Articolo metodologico
Il saggio di un ibrido di lievito modificato qui descritto è un'estensione del saggio classico del lievito un ibrido (Y1H) per studiare e convalidare l'interazione heteromera della proteina-complesso del DNA in un sistema eterologo per qualsiasi studio genomico funzionale.
Nel corso degli anni il test di un ibrido del lievito ha dimostrato di essere una tecnica importante per l'identificazione e la convalida delle interazioni fisiche tra proteine quali i fattori di trascrizione (TFs) e il loro target di DNA. Il metodo presentato qui utilizza il concetto sottostante del Y1H ma è modificato ulteriormente per studiare e validare complessi proteici legati al loro DNA target. Quindi, viene definito come il lievito modificato un ibrido (Y1.5H). Questo test è economico e può essere facilmente eseguito in un normale ambiente di laboratorio. Sebbene utilizzando un sistema eterologo, il metodo descritto potrebbe essere un valido strumento per testare e convalidare il complesso proteomico eteromerico legato al loro target di DNA per la genomica funzionale in qualsiasi sistema di studio, in particolare la genomica vegetale.
In generale, per comprendere le interazioni proteine-DNA, il saggio Y1H è il sistema preferito utilizzato con successo in un ambiente di laboratorio 1 . Il test Y1H di base coinvolge due componenti: a) un costruttore di reporter con DNA di interesse con successo clonato a monte di un gene che codifica una proteina reporter; E b) un costrutto di espressione che genera una proteina di fusione tra il TF di interesse e un dominio di attivazione della trascrizione di lieviti (AD). Il DNA di interesse è comunemente indicato come 'esca' mentre la proteina di fusione è conosciuta come 'preda'. Negli ultimi anni sono state svilupp....
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1. Costruire e preparare il Plasmide Reporter
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La procedura generale di preparazione delle piastre per la co-trasformazione delle regioni del DNA nelle cellule del lievito con proteina di interesse ( Figura 2 ). La configurazione del piatto può essere modificata in base alla necessità dell'esperimento e del numero di regioni / frammenti di DNA sperimentati. Dopo il giorno 5 del protocollo dovrebbe essere visibile una piastra ben sviluppata e positiva come nella figura 3 .......
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La procedura standard esistente Y1H è idonea per identificare una singola preda di proteine legata all'esca del DNA. Con varie modifiche tecniche, il sistema esistente è stato sfruttato per la definizione di reti regolatorie trascrizionali. Tuttavia, TFs sono noti per funzionare come parte di complessi che coinvolgono due o più TF o proteine, con solo alcuni dei TF in grado di legarsi al DNA. Le proteine oi TF che possiedono solo i domini leganti alla proteina e che non dispongono della capacità di legarsi al DN.......
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Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Ringraziamo SS Wang, M. Amar e A. Galla per una lettura critica del manoscritto. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dall'Istituto Nazionale delle Scienze Mediche Generali degli Istituti Nazionali di Salute con i numeri di premio RO1GM067837 e RO1GM056006 (a SAK). Il contenuto è esclusivamente responsabile degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali degli Istituti Nazionali di Salute.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| pDEST22 vector | Invitrogen | PQ1000101 | Kit sistema ibrido Pro-Quest Two |
| pDEST32delatDBD | Invitrogen | PQ1000102 | Pro-Quest Two; questo vecor è modificato. Si tratta di pDEST32 meno il dominio di legame del DNA |
| Kit di clonazione pENTR/D-TOPO | Invitrogen | K240020 | |
| YM4271 Ceppo | Clontech | K1603-1 | MATCHMAKER Sistema ibrido |
| pEXP-AD502 | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Kit di sistemi ibridi |
| Due GATEWAY LR Miscela di enzimi Clonasi II | Invitrogen | 11791020 | |
| YPDA media | Clontech | 630410 | |
| SD-Agar | Clontech | 630412 | |
| SD media minimi | Clontech | 630411 | |
| Uracil DO Integratore | Clontech | 630416 | |
| Triptofano Integratore | Clontech | 630413 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
| LiAc | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| Saplmon Sperm (10mg/ml) | Invitrogen | 15632011 | |
| 96 pozzetti fondo rotondo Piastra | Greiner bio-one | 650101 | |
| PEG3350 | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| 96-deep well block | USA Scientific | 1896-2000 | |
| Foglio sigillabile | USA Scientific | 2923-0110 | |
| Araseal | Excel Scientific | B-100 | |
| 2-mercaptoetanolo | Fisher Scientific | 034461-100 | |
| ONPG | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Na2CO3 | Sigma-Aldrich | 223484 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| KCL | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 83266 | |
| HCL | Fisher Scientific | SA54-4 | |
| Bagno a secco | Thermo Fischer | ||
| Voretx | Thermo Fischer | ||
| Centrifgue | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| Lettore di piastre | Dispositivo | Spettrofotometro | |
| per micropiastre SPECTRAMAX PLUSIncubatrice | Thermo Fisher | Modello n. 5250- 37 gradi, 6250-30 gradi | |
| Agitatore Incubatore | New Brunswick | ||
| Bagno d'acqua | Thermo Fisher | IsoTemp 205 | |
| Puncher | |||
| 50 ml Falocn | BD Falcon | ||
| Beaker | Nalgene | ||
| Fiaschetta | Nalgene | ||
| Piastre di Petriplates (150mm) | Greiner bio-one |
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