Metodo ottimizzato di LC-MS/MS per l'analisi di High-throughput di campioni clinici di Ivacaftor, suoi principali metaboliti e Lumacaftor nei fluidi biologici di pazienti affetti da fibrosi cistica

Sommario

Combinazione di ivacaftor e ivacaftor-lumacaftor sono due nuovi farmaci CF. Tuttavia, c'è ancora una carenza di comprensione sulle loro PK/PD e farmacologia. Presentiamo una tecnica ottimizzata di HPLC-MS per l'analisi simultanea di ivacaftor e suoi metaboliti principali e lumacaftor.

Abstract

Difetti nel regolatore di conduttanza del trans-membrana di fibrosi cistica (CFTR) sono la causa della fibrosi cistica (CF), una malattia con le manifestazioni polmonari mortali. Ivacaftor (IVA) e combinazione di ivacaftor-lumacaftor (LUMA) sono due nuovi farmaci svolta CF che modulano direttamente l'attività e il traffico della proteina CFTR difettosa. Tuttavia, c'è ancora una carenza di comprensione sui parametri di farmacocinetica/farmacodinamica e la farmacologia di ivacaftor e lumacaftor. La tecnica HPLC-MS per l'analisi simultanea delle concentrazioni di ivacaftor, idrossimetil-ivacaftor, ivacaftor-carbossilato e lumacaftor nei fluidi biologici in pazienti che ricevono la combinazione standard di ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor la terapia è stata precedentemente sviluppato dal nostro gruppo e parzialmente convalidata a norme FDA. Tuttavia, per consentire l'analisi di alto-rendimento di un numero maggiore di campioni di pazienti, il nostro gruppo ha ottimizzato il metodo segnalato attraverso l'uso di una colonna di cromatografia a fase inversa di dimensioni dei pori più piccolo (2,6 µm, C8 100 Å; 50 x 2.1 mm) e un sistema solvente gradiente ( 0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: detenuta al 70% B; 2,7-2,8 min: 70-90% B; 2,8-4,0 min: 90% lavaggio B; 4.0-4,1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: detenuta al 40% B) invece di un'eluizione isocratica. L'obiettivo di questo studio era quello di ridurre i tempi di analisi di HPLC-MS per campione drammaticamente da ~ 15 min a solo 6 min per campione, che è essenziale per l'analisi di una grande quantità di campioni di pazienti. Questo metodo vantaggioso sarà di notevole utilità per gli studi di relazioni esposizione-risposta tra queste droghe CF svolta.

Introduzione

Fibrosi cistica (CF) è una comune malattia genetica che coinvolge le ghiandole esocrine muco di polmone, fegato, pancreas e intestino provocando progressiva insufficienza multi-organo, come ad esempio un declino della funzione polmonare e insufficienza pancreatica^{1, 2,3}. Ivacaftor (IVA) è il primo Food and Drug Administration (FDA-US) e Agenzia europea dei medicinali (EMA) ha approvato la fibrosi cistica trans-membrana conduttanza regolatore (CFTR) potenziatore farmaco, con efficacia clinica dimostra producendo un significativo miglioramento nella funzione polmonare rispetto....

Protocollo

approvazione per l'etica è stata ottenuta da Monash University umana ricerca etica Comitato (MUHREC).

1. applicazione del dosaggio: raccolta del campione di paziente

1. registrare il momento in cui il paziente prende loro dose standard di 150 mg ivacaftor o /lumacaftor di 125 mg di ivacaftor 200 mg.
2. Nota giù l'ora esatta quando il campione di sangue del paziente è raccolto.
   Nota: Si consiglia la raccolta di campioni di 4-5 sopra un corso di tempo di 24 ore. Se la raccolta di un solo campione è possibile, il punto di tempo indicato è 2.5-4 h post ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor combinazione dosaggio come C _max....

Risultati

Recentemente abbiamo segnalato un metodo convalidato parzialmente ai campioni della FDA, su un triplo quadrupolo LC-MS e un sistema rivelatore HPLC, utilizzando una colonna C8 (5 µm, 3,9 mm x 50 mm di diametro interno) con la fase mobile composto da 100% ACN e 0,1% acido formico in acqua (40: 60 v/v) con una portata di 1 mL/min. Una correlazione lineare dei picchi è stata osservata in un intervallo di concentrazione da 0,01 a 10 µ g/mL in plasma umano per tutti i metaboliti, ivacaftor, Iva-M1, M6 Iva e lumacaftor

Discussione

Come precedentemente segnalato, il nostro gruppo ha per la prima volta sviluppato e convalidato un metodo HPLC e LC-MS per tempestiva rilevazione e quantificazione di ivacaftor e dei suoi principali metaboliti M1 idrossimetil-IVA (attivo) e IVA-carbossilato M6 (inattivo); e lumacaftor nel plasma e dell'espettorato di pazienti CF¹⁴. Il saggio segnalato dal nostro gruppo precedentemente è stato usato con successo per quantificare la concentrazione di LUMA, IVA, IVA-M1 e IVA-M6 nel plasma ed espettor.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
IVA (Cat#S114)	SelleckChem (Stati Uniti).
LUMA (Gatto#S1565)	SelleckChem (Stati Uniti).
IVA-carbossilato (Cat# 510242247CS)	Clearsynth (Canada).
idrossimetil-IVA (Cat# 510240849CS)	Clearsynth (Canada).
Metanolo (MeOH, grado LC-MS),	Acetonitrile Sigma-Aldrich
(grado ACN, LC-MS)	Sigma-Aldrich
(FA)	Sigma-Aldrich
triplo quadrupolo Shimadzu 8030 LC-MS
Phenomenex Kinetex (2,6 &; m C8 100 Å; 50 &volte; 2,1 mm)
(KrudKatcher Ultrea HPLC Filtro in linea 0,5 m Filtro di profondità x 0,004 pollici).
Provetta per microcentrifuga in polipropilene (VWR) da 1,5 mL.
Eppendorf Centrifuge 5430
Filtro per siringa da 13 mm (0,45 &; micro; m nylon, GRACE, USA)
[Phenomenex VEREX, 9 mm, PP, 300 µ L, PTFE/Setti in silicone].

Acido formico