Method Article

Una guida per la produzione, la cristallizzazione e la determinazione della struttura di umana IKK1/α

DOI:

10.3791/56091

⸱

November 2nd, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of California, San Diego, 2Department of Biophysics, Bose Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IκB Kinase 1/α (IKK1/α CHUK) è una proteina di Ser/Thr chinasi che è coinvolto in una miriade di attività cellulari principalmente attraverso l'attivazione di fattori di trascrizione NF-κB. Qui, descriviamo i principali passaggi necessari per la produzione e la determinazione di struttura di cristallo di questa proteina.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Una classe di stimoli extracellulari richiede l'attivazione di IKK1/α per indurre la generazione di una subunità di NF-κB, p52, attraverso l'elaborazione del suo precursore p100. P52 funzioni come un omodimero o un eterodimero con un'altra subunità di NF-κB, RelB. Questi dimeri a loro volta regolano l'espressione di centinaia di geni coinvolti nel ciclo cellulare, la sopravvivenza delle cellule e l'infiammazione. IKK1/α rimane principalmente associato con IKK2/β e NEMO come un complesso ternario. Tuttavia, una piccola piscina di esso inoltre è osservata come un complex(es) di basso peso molecolare. Non è noto se l'attività di elaborazione p100 è attivato dall'attivazione di IKK1/α all'interno il più grande o più piccola piscina complessa. Attività costitutiva di IKK1/α è stato rilevato in diversi tumori e malattie infiammatorie. Per capire il meccanismo di attivazione di IKK1/α e consentirne l'utilizzo come un bersaglio di farmaci, abbiamo espresso IKK1/α ricombinante in sistemi host diversi, quali Escherichia coli, insetto e cellule di mammifero. Siamo riusciti a esprimere solubile IKK1/α in baculovirus infetta cellule di insetto, ottenere quantitativi di mg di proteina altamente pura, si cristallizzano in presenza di inibitori e determinare la sua struttura cristallina ai raggi x. Qui, descriviamo la procedura dettagliata per produrre la proteina ricombinante, sua cristallizzazione e sua determinazione di struttura di cristallo dei raggi x.

Introduction

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Attività trascrizionali della famiglia di fattori trascrizionali dimerica NF-κB sono necessari per diverse funzioni cellulari, che vanno da infiammazione ed immunità alla sopravvivenza e morte. Queste attività sono rigorosamente controllate nelle cellule e una perdita di regolamento porta a varie circostanze patologiche, compreso i disordini autoimmuni e cancro1,2,3. In assenza di uno stimolo, l'attività di NF-κB sono tenute inibita di IκB (inibitore di-f-κB) proteine4. La fosforilazione di specifici residui di Ser IκB proteine marchia per ubiquitinazione e degradazione proteasomica successive o elaborazione selettiva5. Due altamente omologo Ser/Thr chinasi, IKK2/β e IKK1/α, agiscono come regolatori centrale delle attività di NF-κB effettuando questi eventi di fosforilazione6,7.

Interazioni tra un ligando e un recettore trasduce un segnale attraverso una serie di mediatori che portano all'attivazione di fattori di n-f-κB. Il processo di segnalazione di NF-κB possa essere classificato in due percorsi distinti – canoniche e non canoniche (alternativi)8. L'attività di IKK2/β regola principalmente la segnalazione di n-f-κB del pathway canonico che è essenziale per le risposte immunitarie infiammatorie e innata9. Una caratteristica distintiva di questa via è un'attivazione rapida e di breve durata di IKK2/β10 all'interno di un complesso di IKK finora biochimicamente atipici — presunto per essere composto di IKK1 e IKK2, nonché un componente regolamentazione, NEMO (n-f-κB modulatore essenziale )11,12,13. Tra le due subunità catalitiche IKK del complesso IKK, IKK2 è principalmente responsabile14 per la fosforilazione di specifici residui di prototipo IκBs (α, - β e γ-) associati a NF-κB e anche una proteina IκB atipica, NF-κB1/p105, che è un precursore della subunità p50 NF-κB5. Fosforilazione indotta ubiquitinazione e degradazione proteasomal di IκB (o elaborazione di p105) conduce al rilascio e attivazione di un set specifico di n-f-κB dimeri15. Attività di NF-κB aberrante a causa di cattiva regolazione funzione di IKK2 è stato osservato in molti cancri pure come in disordini autoimmuni2,3,16.

In contrasto con IKK2/β, attività di IKK1/α regola NF-κB segnalazione della via non canonica, che è essenziale per lo sviluppo e l'immunità. IKK1 fosforila residui specifici di NF-κB2/p100 sul relativo segmento C-terminale IκBδ, che conduce alla sua elaborazione e la generazione di p52. La formazione dell'eterodimero p52:RelB trascrizionalmente attiva inizia una risposta lenta e sostenuta a segnali dello sviluppo7,17,18,19,20. Interessante, la generazione del centrale p52 fattore NF-κB di questa via è criticamente dipendente da un altro fattore, n-f-κB inducendo chinasi (NIK)21,,22, ma non sul IKK2 o NEMO. Nelle cellule a riposo, il livello di NIK rimane basso a causa della sua costante degradazione proteasoma-dipendente23,24,25. Stimolazione delle cellule da ligandi 'non canoniche' e in alcune cellule maligne, NIK diventa stabilizzato per reclutare e attivare IKK1 / α. le attività della chinasi di NIK e di IKK1 sono essenziali per un'elaborazione efficiente di p100 in p527. IKK1 e NIK fosforilare tre serine (Ser866, 870 e 872), NF-κB2/P100 sul relativo segmento IκBδ C-terminale che porta l'elaborazione e la generazione di p52. Attivazione aberrante del pathway non canonico è stato implicato in molte malignità compreso il mieloma multiplo26,27,28.

Diversi inibitori altamente efficienti e specifici per IKK2/β sono noti, anche se nessuno finora si sono rivelati essere un farmaco efficace. Al contrario, gli inibitori IKK1/α-specific sono sparsi. Questo può derivare in parte dalla nostra mancanza di informazione strutturale e biochimica su IKK1/α, che limita la nostra comprensione della base meccanicistica dell'attivazione di NF-κB di IKK1 nelle cellule e progettazione razionale dei farmaci. Le strutture dei raggi x di IKK2/β ci ha fornito con intuizioni il meccanismo di attivazione di IKK2/β29; Tuttavia, queste strutture non ha potevano rivelare come i diversi stimoli a Monte innescare l'attivazione di IKK1/α o β/IKK2 regolare insiemi distinti di n-f-κB attività 30,31. Per capire la base meccanicistica sottostante la funzione di segnalazione distinta di IKK1/α e a istituire una piattaforma per la progettazione razionale dei farmaci, ci siamo concentrati sulla determinazione della struttura di IKK1/α.

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Protocol

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1. preparazione del Virus ricombinante adatto a larga scala espressione di IKK1/α

  1. Preparazione di virus P1 32
    1. Giorno 1: Le celle di piastra Sf9 (~ 6 X 105) (passaggio numero meno di 10) in 2 mL di Sf900 III insetto medium cellulare in ciascuna di una piastra a 6 pozzetti ed incubare a 27 ° C. Cellule del passaggio quando raggiungono una densità di 2-3 X 106 cellule per mL in sospensione diluendo in media freschi ad una densità di ~ 6 X 105.
    2. Giorno 2: Diluire 8 µ l di reagente di Sf9-transfezione in 100 µ l di Sf900 III o di grazia insetto Medium senza siero e antibiotico. Vortice brevemente.
    3. Diluire 1 µ g di bacmid ricombinante purificato per kit (i dettagli sono forniti in 'Rappresentante risultati')32 in un altro 100 µ l del mezzo stesso, in un tubo separato.
    4. Combinare DNA diluito e reagente di transfezione (volume totale: ~ 210-220 µ l) e incubare a temperatura ambiente per 15-30 min.
    5. Rimuovere il supporto dal pozzo. Aggiungere 1 mL di terreno nuovo senza Antibiotico e siero.
    6. Aggiungere la miscela di reagente di transfezione del DNA diluita goccia a goccia sulle celle. Regolare la dimensione della goccia tale che esso non sloggiare le cellule aderenti.
    7. Dopo ~ 6 h, aggiungere 1,5 mL di terreno nuovo sulla parte superiore o rimuovere il mezzo e aggiungere 2,5 mL di terreno nuovo. Medium fresco caldo a 25-27 ° C prima dell'aggiunta.
    8. Incubare le cellule a 27 ° C. Controllare i pozzi periodicamente ogni ~ 12 h per segni di infezione virale. Effettuare tutte le Sf9 manutenzione ed espressione a 27 ° C.
    9. Giorno 5: Estrarre il mezzo che contiene cellule 60-72 h post infezione. Centrifugare per 5 min a 500 x g e a 4 ° C. Salvare il surnatante; Questo è lo stock di P1-virus. Congelare piccole aliquote a-80 ° C.
  2. Selezionando i migliori esprimendo clone di virus P1.
    1. Cellule di piastra similmente come descritto al punto 1.1.
    2. Successivo giorno o ~ 6 h, placcatura, aggiungere 20 µ l e 50 µ l di vari stock di clone virus P1 sulle celle in diversi pozzi.
    3. Sloggiare le celle aderenti pipettando delicato e raccogliere l'infezione di cellule infettate 60-72 h post mediante centrifugazione per 5 min a 500 x g e a 4 ° C. Salvare il supernatante. Questo è lo stock di virus di P2. Conservare le piccole aliquote dello stock a-80 ° C.
    4. Aggiungere 100 µ l di tampone x Laemmli SDS 2 per il pellet cellulare raccolto. Riscaldare a > 95 ° C per 10 min. centrifuga (in genere > 10.000 x g) per 5 min.
    5. Eseguire 10-15 µ l di ciascun campione in 8-10% SDS-PAGE a 120-160 V fino a quando la parte anteriore della tintura raggiunge il fondo del gel.
    6. Electro-trasferimento le proteine risolte da standard semi-dry transfer protocol (20 V, 30-45 min) su una membrana di nitrocellulosa/PVDF.
    7. Blot con anticorpi anti-IKK1 (diluizione ~ 1:2, 000, deve essere ottimizzato) o anticorpi anti-PentaHis (diluizione ~ 1:3, 000, deve essere ottimizzato) per l'espressione.
    8. Scegliere il miglior clone di virus P1 confrontando l'espressione di IKK1 ricombinante.
  3. Preparazione di stock di virus P3 su larga scala.
    1. Cellule di piastra similmente come descritto nel passaggio 1.1 in un piatto di 15 cm che contiene 25-30 mL di terreno di Sf900 III.
    2. ~ 6 h post placcatura, aggiungere 150-300 µ l di Best-Seller esprimenti stock virus P1 sulle celle.
    3. Dopo 72 h post infezione, aspirare il mezzo attentamente dalla piastra in un tubo adatto (sterile) e centrifugare la provetta a 500-1000 X g per 10 min a 4 ° C. Scartare il pellet cellulare (se uno è formato) e salvare il supernatante. Si tratta di stock di virus P3.
  4. Determinare il titolo di virus ottimale per l'espressione della proteina su larga scala
    1. Cellule di piastra in 2 mL di terreno di Sf900 III, come descritto in 1.1, in una piastra a 6 pozzetti.
    2. Aggiungere 20, 30, 40 e 50 µ l di P3 stock di virus in separato pozzi ~ 6 h post placcatura. Includere un controllo non infetto.
    3. Raccogliere le cellule da ogni infezione post di ben 48-60 h.
    4. Aggiungere 100 µ l di tampone di SDS di Laemmli X 2. Riscaldare a > 95 ° C per 10 min. Centrifugare (in genere a 14.000 x g) per 5 min.
    5. Risolvere il 10-15 µ l di ciascun campione in un gel di SDS-PAGE 8-10%.
    6. Trasferimento risolta proteina ad una membrana di nitrocellulosa/PVDF come accennato a 1.2.6.
    7. Blot con anticorpi anti-IKK1 (diluizione ~ 1: 2000, deve essere ottimizzato) o anticorpi anti-PentaHis (diluizione ~ 1: 3000, deve essere ottimizzato).
    8. Utilizzare il virus con i migliori esprimendo titre per le espressioni su larga scala.

2. su larga scala l'espressione di 6 x, la sua etichetta umana IKK129,33

  1. Eseguire su larga scala espressione in una coltura di sospensione. Dividere le celle in 1 L di medie Sf900 III in un matraccio di Erlenmeyer L 2 con un tappo di sfiato. La densità delle cellule dovrebbe essere ~ 5 x 105 cellule/mL.
  2. Crescere queste cellule in sospensione a ~ 100 rpm a 27 ° C in un agitatore per ~ 2 giorni fino a quando non raggiunge una densità di 1-2 x 106/ml. Densità delle cellule non deve superare 2 x 106/ml.
  3. Aggiungere la quantità desiderata di virus P3, come valutato in 1.4.
  4. Far crescere la cultura infettata per 48-60 h a ~ 100 rpm a 27 ° C in un agitatore.
  5. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a < 1.500 x g a 4 ° C.
  6. Salvare il pellet cellulare ed eliminare il prodotto.
  7. Procedere direttamente alla purificazione della proteina. Flash congelare il pellet cellulare in azoto liquido e conservare a-80 ° C per un uso futuro.

3. la purificazione della sua IKK133

  1. Il giorno 1, risospendere il pellet cellulare in 40 mL di tampone di lisi (25 mM Tris a pH 8.0, 0,2% NP-40, 200 mM NaCl, imidazolo di 10 mM, 10% glicerolo, 5mm β-mercaptoetanolo e inibitore della proteasi cocktail).
    Nota: Il cella umida pellet massa non è stata determinata. In genere, ~ 2 L di cultura è stata utilizzata in questa fase.
  2. Lisare le cellule di sonicazione a cicli di 60-70%, 5-10 impulsi della durata di 30 s ad un intervallo di > 1 min, mantenendo la sospensione cellulare refrigerati sul ghiaccio.
    Nota: Questo passaggio richiede l'ottimizzazione con ogni modello di sonicatore. Non lasciate che il campione scaldare sopra 10 ° C.
  3. Chiarire il lisato mediante centrifugazione a ≥ 28.000 x g per 45 min a 4 ° C.
  4. Equilibrare 4 mL di resina Ni-NTA agarosio con buffer di lisi e mescolare il chiarificato lisato (surnatante) seguendo il protocollo del produttore.
  5. Consentire la proteina associare la resina incubando per 2 h su un miscelatore rotante in una camera di 4 ° C.
  6. Lavare la resina con il buffer di lisi contenenti imidazolo di 30 mM. Controllare la concentrazione di proteina nella frazione di lavare periodicamente utilizzando analisi di Bradford. Lavare questa concentrazione di proteina nella frazione di lavare fino a 0,1 mg/mL. In genere il volume letto > 20 di tampone di lavaggio è necessaria per raggiungere questo punto.
  7. Eluire la proteina His-Tag IKK1/α sotto flusso di gravità, utilizzando 20 mL di tampone di eluizione (il buffer di lisi contenenti imidazolo 250 mM). Raccogliere le frazioni 1-1.5 mL.
  8. Verificare la purezza delle proteine eluite su un gel di SDS PAGE 8 o 10% di caricamento di 5-10 μL di campione da tutte le frazioni miscelate con tampone di Laemmli.
  9. Piscina frazioni di picco (concentrazione ≥ 2mg/mL) e misurare la concentrazione di proteina usando l'analisi di Bradford.
  10. Digerire con una notte di proteasi per il TEV (01:30-50 (TEV proteasi: IKK1)) (≥ 12 h) a 4 ° C.
    Nota: Ottimizzare la quantità di proteasi TEV necessaria per completare la digestione (≥ 95%) di 6 X, la sua etichetta a priori. Proteasi TEV è stato purificato in casa.
  11. La mattina del giorno 2, incubare la proteina con 1mm di ATP in presenza di 20 mM MgCl2, β-glicerofosfato di 20 mM, 10 mM NaF e orthovanadate del sodio di 1 mM per 1 h a 27 ° C.
  12. Filtrare la soluzione della proteina attraverso un filtro di 0.45 o 0,22 μm.
  13. Carico 6 mL del campione su una colonna di esclusione dimensionale preparativa ~ 120 mL collegata ad un sistema automatizzato di cromatografia liquida. Equilibrare la colonna con tampone A (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 5% glicerolo), prima di applicare il campione della proteina.
    Nota: Una colonna più piccola poteva essere utilizzata a seconda del rendimento della proteina dopo la fase di purificazione di affinità Ni-NTA. Regolare/calcolare il volume di carico per essere il 5% del volume di colonna).
  14. Eseguire la cromatografia di esclusione dimensionale ad una portata di 1 mL/min e monitorare eluizione a 280 e 254 nm. Raccogliere le frazioni di dimensione di 2 mL.
  15. Verificare la purezza delle frazioni picco (tipicamente intorno ~ 60-70 mL) su un gel di SDS-PAGE 8-10%.
  16. Piscina le frazioni pure (purezza ≥ 95% con una concentrazione di ≥0.5 mg/mL) e concentrare in un kDa 10 o 30 kDa concentratore centrifugo proteina di cut-off di peso molecolare seguendo le istruzioni del produttore.
  17. Periodicamente controllare la concentrazione nella proteina del concentrato con il metodo di Bradford e concentrare il campione fino a 8-12 mg/mL.
  18. Dispensare 25 μL aliquote e freeze flash in azoto liquido. Conservare questi flash campioni congelati nel freezer-80 ° C.

4. schermo per cristallizzazione condizione di IKK1

  1. Calcolare l'importo totale (in volume) di proteina necessaria allo schermo per cristalli seguendo i metodi descritti di seguito.
  2. Provare diversi inibitori (inibitori delle chinasi generico: AMPPNP e Staurosporine; IKK-specific inibitori: MLN120B, composto A e XII IKK-inibitore) per eseguire lo screening per la cristallizzazione. Rendere le soluzioni stock di questi composti seguendo le istruzioni del produttore. Assicurare che la massima concentrazione del composto nella sua soluzione di riserva non superi 20 μM.
  3. Preparare la IKK:inhibitor complesso per lo schermo di cristallizzazione di miscelazione 100 μM di IKK1 con inibitore di 200 μM e incubare a 18-20 ° C per 30-40 min. Centrifugare questa miscela a > 15.000 x g per 2 min a temperatura ambiente. Salvare il surnatante per schermo di cristallizzazione.
  4. Utilizzare le schermate di cristallizzazione commercialmente disponibili (Vedi la Tabella materiali).
  5. Pipettare 80-100 μL di ciascun reagente di cristallizzazione (soluzioni di serbatoio), utilizzando una pipetta multicanale o un robot, nel serbatoio di una piastra a 96 pozzetti. La piastra è ora pronta per impostare la pagina di gocce. Assicurarsi che la piastra ospita cristallizzazione di 2 o 3 gocce in modo che 2 o 3 inibitori possono essere proiettati in un'unica placca.
  6. Usando un robot di cristallizzazione, erogare e miscelare 0.2 – 0.25 μL di IKK1:inhibitor complesso con lo stesso volume di soluzione di serbatoio.
    Nota: Lo Screening può essere eseguito manualmente utilizzando grandi volumi di goccia (0.5-1.0 μL di IKK1:inhibitor complesso con lo stesso volume di soluzione di serbatoio). Tuttavia, utilizzo di un robot sarebbe risparmiare preziosi reagenti.
  7. Sigillare le piastre immediatamente dopo aver impostato le gocce con pellicole otticamente trasparenti per evitare l'evaporazione. Sigillare correttamente utilizzando appropriati applicatore. Fare tavole di replica per ogni set di inibitore. Incubare una piastra a 18 ° C e l'altro in camera fredda (temperatura ~ 4 – 6 ° C). Assicurarsi che gli incubatori non risentono delle vibrazioni.
  8. Utilizzare uno stereomicroscopio con un polarizzatore per verificare la comparsa di cristalli in ogni goccia ogni giorno per i primi sette giorni e poi a intervalli più lunghi. Sistematicamente nota e segnare queste osservazioni.
    Nota: Utilizzare uno stereomicroscopio con un polarizzatore, in modo che i difetti di crescita in cristalli possono essere valutati visivamente. Qui, cristalli è comparso in una condizione dove la soluzione serbatoio conteneva 3% p/v Destrano solfato sodio sale Mr 5.000, 0,1 M pH BICINA 8.5, 15% w/v polietilenglicole 20.000. Cristalli di IKK1 è cresciuto solo in presenza di inibitore di IKK-XII.

5. cristallo crescita ottimizzazione29,33

  1. Preparazione delle soluzioni madri.
    1. Preparare 30% w/v soluzioni di Destrano solfato di diverso peso molecolare (medio a MW 5.000, 8.000, 15.000, Da 40.000) in deionizzata H2O. filtro soluzione utilizzando 0,22 μm filtri.
    2. Preparare 1 o 0,5 M scorte di diversi buffer nell'intervallo di pH di 6.5-9. Soluzioni utilizzando 0,22 μm filtri del filtro.
    3. Preparare il 25% o 50% (p/v) soluzioni di PEG di diverso peso molecolare (medio a MW:1000, 1.500, 3.350, 4.000, 6.000, 8.000, 10.000, 12.000, Da 20.000). Soluzioni utilizzando 0,22 μm filtri del filtro.
    4. Eseguire una schermata di griglia variando sistematicamente pH, tipo di buffer, concentrazione e tipo di PEG e di solfato di destrano.
  2. Ottimizzare lo screening sia a 18 ° C e in camera fredda (temperatura ~ 4-6 ° C).
  3. Mescolare una quantità uguale della IKK1:Inhibitor complesso con soluzione bene e incubare sopra la soluzione bene in un ambiente sigillato. Questa operazione può essere eseguita manualmente o utilizzando un robot di erogazione.
    Nota: Qui, i cristalli più grandi e ben definiti (come valutato dal colore uniforme sotto il polarizzatore che indicava una crescita uniforme) sono stati ottenuti le seguenti condizioni: 100mm BisTris pH 7.0, 2,8-3,5% di solfato di destrano (medio MW 15 kDa), 8,5-10% PEG 20 kDa nella stanza fredda.

6. cristalli nei grandi numeri in crescita

  1. Preparare le seguenti soluzioni stock e filtrarli attraverso filtro di 0,22 μm.
    1. Preparare 0,5 M BisTris pH 7.0 e BisTris propano pH 7.0 e 7.5.
    2. Preparare il 30% (p/v) solfato di destrano (medio MW ~ 15 kDa). Conservare a 4 ° C.
    3. Preparare 50% PEG (medio MW ~ 12 kDa).
  2. Utilizzo 24 ben appeso goccia piastre.
  3. Applicare sigillante grasso sugli anelli sollevati di ciascun pozzetto.
  4. Preparare la soluzione ben come segue (concentrazione finale): 100 mM BisTris pH 7.0-7.5, 2.8 – 3,5% Destrano solfato ~ 15 kDa, 8,5 – 10% PEG ~ 12 kDa. Preparare 1 mL di soluzione ben in provette da 1,5 mL.
    Nota: Una variazione minore in condizioni di cristallizzazione è stata osservata dipendendo il batch di proteina, e/o solfato di destrano, così una prova di una gamma stretta è raccomandata. Sia BisTris e BisTris buffer di propano dello stesso intervallo di pH resa monocristalli.
  5. Mantenere le soluzioni ben e piastre unta in camera fredda per almeno 1 h.
  6. Preparare IKK1:Inhibitor complesso come descritto nel precedente paragrafo 4.3. Consente di trasferire i singoli pozzetti della piastra ben 24 le soluzioni bene da provette da 1,5 mL.
  7. Pulito siliconato (commerciale o in-House (siliconizzazione/silanizzazione)) vetrini coprioggetto utilizzando salviette panno di vetro e applicare getti di aria ad alta pressione ha individuato utilizzando spolverino aerosol disponibili in commercio.
  8. Posto 1 – 1.5 μL di soluzione ben su un vetrino pulito. Pipetta volume uguale di IKK1:inhibitor complesso, mescolare delicatamente pipettando su e giù 3 - 4 volte. Girare il vetro vetrini coprioggetto e posizionare sul rispettivo bene con forcipe e sigillare il pozzo premendo sul grasso.
  9. Dopo aver impostato tutte le gocce di una piastra a 24 pozzetti, incubare la piastra in camera fredda nel buio. Controllare visivamente le gocce sotto un microscopio per aspetto e crescita dei cristalli.
    Nota: Esso non è stato testato se incubando piatti in cristallo sotto la luce sarebbe cambiare il risultato. È fondamentale, tuttavia, che le piastre vengono incubate in un ambiente con minimo/assenza di vibrazioni.

7. Cryo protezione dei cristalli

  1. Preparazione delle soluzioni di cryo.
    1. Preparare A Cryo (~ 2% Destrano solfato, ~ 10% PEG 12000, 60 mM BisTris propano (del pH stesso come la soluzione ben previsto), 5 mM Tris-HCl pH 7.5, 40-50 mM NaCl, 2.5% glicerolo).
    2. Preparare Cryo B (~0.3% solfato di destrano, ~ 10% PEG 12000, 60 mM BisTris propano (del pH stesso come la soluzione ben previsto), 5 mM Tris-HCl pH 7.5, 40-50 mM NaCl, 20 o 25% glicerolo o 20 o 25% glicole etilenico).
      Nota: Test diversi cryo-protectants oltre a glicerolo e glicole etilenico (ad es., PEG 200, PEG 400, PEG MME 550 PEG 1000).
  2. Rimuovere il vetrino coprioggetto vetro contenente il cristallo delicatamente e posizionarlo su una superficie solida con la goccia di cristallo verso l'alto. Delicatamente aggiungere 10 μL di soluzione di Cryo A sopra la goccia e mescolare delicatamente pipettando affinché il cristallo non è toccato.
    Nota: Questo pulisce la superficie di cristallo di detriti e contribuire a equilibrare il cristallo con il buffer di cryo iniziale. Evitare sollecitazioni meccaniche e termiche al cristallo. Eseguire tutti i passaggi successivi al microscopio per evitare di danneggiare il cristallo.
  3. Lentamente togliere un po' di liquido dal cristallo e tenere circa 5-8 μL della soluzione. Evitare la disidratazione del cristallo. Prendere la cura estrema per evitare sollecitazioni meccaniche e disidratazione del cristallo in tutte le fasi successive.
  4. Delicatamente aggiungere 2,5 – 4 μL della soluzione di Cryo B sulla goccia, mescolare molto delicatamente pipettando. Coprire con un piccolo piatto di Petri per evitare il flusso diretto dell'aria sopra il cristallo. Attendere 5 min sempre attenti che il cristallo non subiscono rapidi cambiamenti di pressione osmotica o disidratazione.
  5. Ripetere il punto 7.4 quattro volte per acclimatare lentamente il cristallo nella soluzione di cryo.
  6. Mantenere 10 – 20 μL della soluzione di cryo in questa fase (cioè, consentire il cristallo essere inondata di circa 20 – 25% contenente soluzione di cryo-protectant). Ammollo per diversi periodi di tempo (5 min a 1 h) in cryo-soluzione finale.
  7. Congelare cristalli multipli a intervalli di tempo diversi.
  8. Scegliere attentamente un singolo cristallo dalla goccia in un appropriato cryo-ciclo montato su una vera e propria base e tuffo-freeze in liquido N2. Eseguire questo passaggio senza intoppi e in modo da evitare la formazione di ghiaccio sul cristallo.
    Nota: Scegliere il cristallo utilizzando un anello di diametro leggermente più grande rispetto l'asse più lungo del cristallo, in modo che può essere montato nel goniometro robotico utilizzato nell'origine di fotone avanzate, Argonne National Laboratory.
  9. Memorizzare il cristallo contenente cryo-loop in pucks immerso nel liquido N2. Conservare queste pastiglie in liquido N2 pallone Dewar finché non sono pronti per la spedizione per diffrazione dei raggi x al sincrotrone. Procedere alla raccolta dei dati di diffrazione di raggi x e l'elaborazione (articoli 8 e 9).
    Nota: Dati di diffrazione dei cristalli di IKK1 da casa sorgenti di raggi x non erano abbastanza ad alta risoluzione per le prove di determinazione di struttura, anche se indicato la qualità dei cristalli che saranno proiettati presso il sincrotrone. Tutti i dati di diffrazione sono stati raccolti a diversi beamlines (principalmente 19ID) della fonte del fotone Advance, Argonne National Laboratory, USA.

8. raccolta di dati raggi x

  1. Raccogliere i dati di diffrazione a raggi x presso la beamline ID19 dell'origine sincrotrone APS, utilizzando dati remoti raccolta software34.
    Nota: Verso l'alto di 100 cristalli sono stati testati per le loro proprietà di diffrazione. I cristalli diffratte ordinariamente a una risoluzione di 7-11 Å, solo raramente cristalli che diffratto per oltre 5 Å sono stato osservato e solo un grande cristallo diffratte oltre 4.5 Å. Poiché i cristalli decadde rapidamente durante la raccolta dei dati, sono stati raccolti i DataSet in diverse parti del cristallo stesso. Questo è stato possibile poiché i cristalli erano grandi (superiori a 400 µm), e il diametro del fascio utilizzato era 100 µm.

9. elaborazione dei dati raggi x

  1. Unire tutti i set di dati raccolti su diverse parti del cristallo stesso34.
    Nota: sette set di dati sono state fuse da cristallo migliore e i dati risultanti erano completo al 93%. Nel complesso ho / σ era ~ 6.8) e Rmerge era 89% nella collocazione di risoluzione più alta (5.4-4.5 Å).
  2. Set di dati di processo con HKL200034 per ottenere spazio group, dimensioni cella unità, contenuto di solventi e plausibile composizione dell'unità asimmetrica.

10. struttura soluzione

  1. Preparazione di modelli di ricerca
    1. Basato su modelli strutturali disponibili di hIKK2 (pdb id 4E3C e 4KIK35), generare una serie di dimeri con diversi orientamenti di KD del N-terminale (che esegue il rendering di un'apertura di 30 e 62 Å, tra P578 di due KD in dimero). Nessuno di questi modelli recuperati una soluzione di ricerca molecolare sostituzione dopo lunghe prove.
    2. Generare una mappa di IKK1 da singola particella cryo-EM dati33.
    3. Generare un modello di IKK1 umana dalla struttura più alta risoluzione di IKK2 (pdb id 4KIK).
    4. Ancorare i singoli domini del modello umano IKK1 nella mappa di densità EM cryo di IKK1 umano utilizzando folaga36. Questo ruotato l'orientamento di KD circa 24 gradi e modificato il N-terminale di apertura a ~ 58 Å.
    5. Applicare l'orientamento di KD del modello cryo-EM montato (il monomero) a tutti i dimeri generati nella versione 10.1.1.
  2. Sostituzione molecolare
    1. Utilizzare dimeri da 10.1.1 e 10.1.5 come modelli di ricerca in programmi PHASER37, MOLREP38 e CNS39,40.
      Nota: Qui, utilizzando uno dei dimeri da 10.1.5 (52 apertura Å) come modello di ricerca a, sei dimeri (due esameri) si trovavano nell'unità asimmetrica utilizzando MOLREP. Il Å 52 apertura nel modello di ricerca è simile all'apertura di Å 49-50 dei dimeri (tutti i sei dimeri) nella struttura raffinata.

11. struttura raffinatezza

  1. Routine di raffinatezza della struttura
    1. Difficoltà l'orientamento e la posizione di questo modello iniziale di raffinatezza di corpo rigido in CNS (cns_solve_1.3)39,40.
    2. Perfezionare la struttura ulteriormente utilizzando minimizzazione e ricottura simulata con una funzione di destinazione di massima verosimiglianza e una correzione di appartamento massa-solvente utilizzando la CNS sistema39,40.
    3. Costruire il modello basato su 2FO-FC e Fo-Fc mappe utilizzando Xtalview41.
      Nota: Applicare DEN-assistita raffinatezza42 e NCS trattenere durante i perfezionamenti per una migliore precisione del modello. Infatti, raffinatezza DEN migliorato drammaticamente geometrie e R-fattori della struttura e il fattore R era 22,2% e gratuito R fattore era 27,8% per il modello finale. Il miglioramento drammatico della R gratuito deve essere a causa del modello di alta precisione di IKK1 domini che sono stati generati dal modello IKK2 (4KIK).

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Results

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Clonazione ed espressione di diversi costrutti di IKK1/α
Figura intera che umana IKK1/α è stato clonato nel baculovirus espressione vettoriale pFastBacHTa all'interno dei suoi siti di restrizione EcoRI e NotI per ottenere un N-terminale hexa-istidina etichetta IKK1. Il tag poteva essere rimossi da digestione della proteasi TEV. Poiché integrale IKK1/α contiene regioni flessibile su entrambe le estremità e regioni flessibili rendono solitamente una proteina difficili a ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Soluzione di produzione, la cristallizzazione e la struttura delle due proteine IKK relative
Abbiamo precisato per determinare la struttura di cristallo dei raggi x di IKK1/α con la nozione che sarebbe stato un esercizio relativamente semplice, dato la nostra esperienza con la produzione della proteina IKK2/β, cristallizzazione e determinazione della struttura. Tuttavia, siamo rimasti molto sorpresi che queste due proteine correlate si comportavano in modo molto diverso per quanto riguarda la facilità...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano senza concorrenti interessi finanziari o altri conflitti di interesse.

Acknowledgements

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Ringraziamo il personale presso il beamlines 19ID, 24ID e 13ID alla Advanced Photon fonte, Lemont, IL, per il supporto durante la raccolta di dati su vari cristalli. Siamo grati a Dmitry Lyumkis, Istituto di Salk per noi il recupero la mappa di cryo-EM bassa risoluzione alle fasi iniziali di EM mappa/modello edificio, che è stato usato per costruire il modello di ricerca molecolare sostituzione IKK1 iniziale. La ricerca che porta a questi risultati ha ricevuto finanziamenti da sovvenzioni NIH AI064326, CA141722 e GM071862 a GG. SP è attualmente un Wellcome Trust DBT India intermedio Fellow.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Cellfectin/Cellfectin IIThermo Fisher Scientific10362100Cellfectin è ora fuori produzione, sostituito da Cellfectin II
Sf900 III Terreno cellulare per insettiThermo Fisher Scientific12658-027
Celle SF9Thermo Fisher Scientific12659017
anticorpo anti-IKK1Novus BiologicalsNB100-56704Precedentemente venduto da Imgenex
anticorpo anti-PentaHisQiagen34460
MilliporeIPVH00010Nitrocellulosa può essere utilizzato anche
Agarosio Ni-NTAQiagen30210
Reagente per test BradfordBioRad500001
Colonna Superdex 200 ConcentratoreGE Healthcare28989335
AmiconMilliporeUFC801008, UFC803008, UFC201024 UFC203024
Composto ABayer
Calbiochem IKK-inibitore XIICalbiochem401491
StaurosporinaSIGMAS4400
MLN120BMilleniumArticolo
AMPPNPSIGMAA2647
destrano solfatoSIGMA51227, 42867, 31404,
destrano solfatoAlfa AesarJ62101
PEGSIGMA93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172Alcuni di essi sono nuovi Cat # sul catalogo SIGMA. Quello che avevamo era originariamente da Fluka che aveva diversi Cat #.
Schermi
Crystal Screen I e II (Crystal Screen HT)Hampton ResearchHR2-130
Index HTHampton ResearchHR2-134
PEG/Ion e PEG/Ion2 (PEG/Ion HT)Hampton ResearchHR2-139
PEGRX 1 e PEGRx 2 (PEGRx HT)Hampton ResearchHR2-086
SaltRx 1 e SaltRx 2 (SaltRx HT)Hampton ResearchHR2-136
Monta il cristalloHampton ResearchHR8-188, 190, 192, 194
SincrotroneLa sorgente di fotoni avanzata (APS) presso il Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti' s Argonne National LaboratoryBeamline 19 IDLa sorgente di fotoni avanzata (APS) presso il Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti' s Argonne National Laboratory fornisce fasci di raggi X ultra-luminosi e ad alta accumulo di energia generati da anelli per la ricerca in quasi tutte le discipline scientifiche.
Membrana in PVDF regalodi cristallizzazione

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. NF-kappaB, an active player in human cancers. Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).
  2. Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140 (6), 883-899 (2010).
  3. Ben-Neriah, Y., Karin, M. Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker. Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).
  4. Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).
  5. Karin, M., Ben-Neriah, Y. Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity. Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).
  6. Ghosh, S., Karin, M. Missing pieces in the NF-kappaB puzzle. Cell. 109, Suppl . S81-S96 (2002).
  7. Sun, S. C. The noncanonical NF-kappaB pathway. Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).
  8. Bonizzi, G., Karin, M. The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity. Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).
  9. DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB. Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).
  10. Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity. Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).
  11. Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation. Cell. 91 (2), 243-252 (1997).
  12. Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex. Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).
  13. Yamaoka, S., et al. Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation. Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).
  14. Li, Z. W., et al. The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis. J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).
  15. Hayden, M. S., Ghosh, S. Shared principles in NF-kappaB signaling. Cell. 132 (3), 344-362 (2008).
  16. Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity. Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).
  17. Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells. Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).
  18. Senftleben, U., et al. Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway. Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).
  19. Coope, H. J., et al. CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52. EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).
  20. Dejardin, E., et al. The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways. Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).
  21. Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation. The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).
  22. Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100. Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).
  23. Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100. J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).
  24. Zarnegar, B. J., et al. Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK. Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).
  25. Vallabhapurapu, S., et al. Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling. Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).
  26. Annunziata, C. M., et al. Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).
  27. Keats, J. J., et al. Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).
  28. Staudt, L. M. Oncogenic activation of NF-kappaB. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109(2010).
  29. Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS Biol. 11 (6), e1001581(2013).
  30. Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).
  31. Scheidereit, C. IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription. Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).
  32. Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).
  33. Polley, S., et al. Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha. Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).
  34. Otwinowski, Z. aM., W, Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode. Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).
  35. Liu, S., et al. Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer. J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).
  36. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  37. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  38. Vagin, A. T., Teplyakov, A. MOLREP: an automated program for molecular replacement. J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).
  39. Brunger, A. T. Version 1.2 of the Crystallography and NMR system. Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).
  40. Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).
  41. McRee, D. E. XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview. J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).
  42. Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data. Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).
  43. Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS biology. 11 (6), e1001581(2013).
  44. Christopher, J. A., et al. The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).
  45. Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking crystallographic model and data quality. Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).
  46. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).

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