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Articolo metodologico

Generazione di un modello di malattia polmonare ostruttiva cronica nei topi da esposizione ripetuta dell'ozono

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DOI:

10.3791/56095

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25 agosto 2017

 ,  ,  , 
1Cellular Biomedicine Group, Shanghai, 2Cellular Biomedicine Group, Cupertino, 3Department of Respiratory Medicine, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiaotong University

In questo articolo

Sommario

Questo studio descrive la generazione di successo di un nuovo modello animale di malattia polmonare ostruttiva cronica (COPD) esponendo ripetutamente topi ad alte concentrazioni di ozono.

Abstract

La broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) è caratterizzata da distruzione parenchimale di flusso d'aria persistente limitazione e del polmone. Ha un'incidenza molto alta nelle popolazioni di invecchiamento. Le attuali terapie convenzionali per BPCO concentrarsi principalmente su sintomo-modificanti; Pertanto, è urgente lo sviluppo di nuove terapie. Modelli animali qualificati della BPCO potrebbero contribuire a caratterizzare i meccanismi di fondo e possono essere utilizzati per lo screening di stupefacenti nuovi. Modelli attuali di COPD, come il lipopolisaccaride (LPS) o l'elastasi pancreatica porcina (PPE)-modello di enfisema indotto, generare COPD-come le lesioni nei polmoni e vie respiratorie ma altrimenti non assomigliano alla patogenesi della BPCO umano. Un fumo di sigaretta (CS)-modello indotto rimane uno dei più popolari perché non solo simula la BPCO-come le lesioni dell'apparato respiratorio, ma si basa anche su uno dei principali materiali pericolosi che le cause della BPCO in esseri umani. Tuttavia, gli aspetti molto tempo e laboriosi del modello indotto da CS drammaticamente limitano l'applicazione in screening di nuovi farmaci. In questo studio, abbiamo generato con successo un nuovo modello di BPCO esponendo topi ad alti livelli di ozono. Questo modello ha dimostrato quanto segue: 1) è diminuito di volume espiratorio forzato di 25, 50 e 75/forzata di capacità vitale (FEV25/FVC, FEV50/FVC e FEV75/FVC), che indica il deterioramento della funzione polmonare; 2) gli alveoli del polmone allargata, con distruzione parenchimale del polmone; 3) ridotto affaticamento tempo e distanza; e 4) ha aumentato l'infiammazione. Presi insieme, questi dati dimostrano che il modello di esposizione (OE) l'ozono è un affidabile modello animale che è simile agli esseri umani perché sovraesposizione di ozono è uno dei fattori eziologici della BPCO. Inoltre, ci sono voluti solo 6-8 settimane, basate sul nostro lavoro precedente, per creare un modello di OE, considerando che richiede 3-12 mesi per indurre il modello di fumo di sigaretta, che indica che il modello di OE potrebbe essere una buona scelta per la ricerca di BPCO.

Introduzione

Si prevede infatti che la BPCO, tra cui l'enfisema e la bronchite cronica, potrebbe essere la terza causa di morte nel mondo nel 20201,2. L'incidenza potenziale della BPCO in una popolazione di oltre 40 anni di età è stimata essere 12,7% nei maschi e 8,3% in femmine entro i prossimi 40 anni3. No farmaci attualmente disponibili invertire il deterioramento progressivo in COPD pazienti4. Affidabili modelli animali della BPCO non solo esigono l'imitazione del processo patologico della malattia ma richiedono anche un generazione di breve periodo. Attuali modelli di BPCO, tra cui il LPS o un modello PPE-indotta, possono indurre sintomi simil-enfisema5,6. Una singola somministrazione o una sfida di settimana di LPS o PPE per risultati di topi o ratti in neutrophilia contrassegnato nel fluido di lavaggio broncoalveolare (BALF), aumenti di mediatori pro-infiammatori (per esempio, TNF-α e IL-1 β) nel BALF o siero, produce del polmone parenchimali distruzione-ingrandetta aria spazi e limiti del flusso d'aria5,6,7,8,9,10. Tuttavia, LPS o PPE non sono cause della BPCO umana e non imitare così il processo patologico11. Un modello indotto da CS prodotto una limitazione al flusso aereo persistente, la distruzione parenchimatica del polmone e ridotta capacità di esercizio funzionale. Tuttavia, un protocollo di CS tradizionale richiede almeno 3 mesi per generare un COPD modello12,13,14,15. Pertanto, è importante generare un nuovo modello animale più efficiente che soddisfa i requisiti di due.

Recentemente, oltre al fumo di sigaretta, inquinamento atmosferico e l'esposizione professionale sono diventati più comuni cause di BPCO16,17,18. L'ozono, come uno dei principali inquinanti (anche se non è la componente principale dell'inquinamento atmosferico), direttamente può reagire con le vie respiratorie e danneggiare il tessuto polmonare dei bambini e dei giovani adulti19,20,21 ,22,23,24,25. Ozono, come pure altri stimolatori inclusi LPS, PPE e CS, sono coinvolti in una serie di vie biochimiche dello stress ossidativo polmonare e danno del DNA e sono collegati all'avvio e alla promozione di BPCO26,27. Un altro fattore è che i sintomi di alcuni pazienti BPCO si deteriorano dopo essere stati esposti all'ozono, che indica che l'ozono può interrompere polmone funzione18,28,29. Di conseguenza, abbiamo generato un nuovo modello di BPCO esponendo ripetutamente topi ad alte concentrazioni di ozono per 7 settimane; Ciò ha provocato difetti di flusso d'aria e danni parenchimali polmonari simili a quelli di precedenti indagini30,31,32. Abbiamo prolungato il protocollo OE ai topi femminili in questo studio e riprodotto con successo dell'enfisema osservato nei topi maschi in nostri precedenti studi30,31,32. Perché BPCO mortalità è diminuita negli uomini, ma aumentato nelle donne in molti paesi33, è necessario un modello di BPCO nelle femmine di studiare i meccanismi e per sviluppare metodi terapeutici per pazienti BPCO femminili. L'applicabilità del modello OE per tutti i generi fornisce ulteriore sostegno al suo uso come un modello di BPCO.

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Protocollo

Nota: OE il modello è stato generato e utilizzato nella ricerca precedentemente segnalati 30 , 31 , 32. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) di Shanghai Jiaotong University.

1. topi

  1. casa esenti da patogeni, 7 a 9-week-old femminili topi BALB/c in gabbie individuali ventilate in un animale impianto sotto controllato temperatura (20 ° C) e umidità (40-60%). Fornire una 12 ore di luce e il ciclo scuro 12h nella struttura. Fornire cibo e acqua ad libitum.

2. L'ozono o l'esposizione all'aria

  1. genera ozono con un generatore elettrico in una casella di acrilico (ad es. del Perspex) tenuta. Soffiare l'aria fuori dalla scatola usando un ventilatore di aria piccola attraverso un tubo di sfiato di aria che è collegato all'interno e all'esterno della casella. Monitorare la concentrazione di ozono nella finestra utilizzando una sonda di ozono. Attendere fino a quando la concentrazione di ozono nella casella raggiunge 2,5 parti per milione (ppm).
    Nota: La sonda di ozono può accendere automaticamente il generatore di ozono o spegnere e può mantenere il livello di ozono nella casella a 2,5 ppm.
  2. Posto i topi nella casella quando il livello di ozono raggiunge 2,5 ppm. Mantenere i topi nella finestra per 3 h ogni volta di esporli a ozono.
    Nota: La casella in grado di mantenere un livello di ozono di 2,5 ppm durante i 3 h commutando automaticamente il generatore di ozono o spegnere e che soffia la CO 2 che è prodotto dai topi out of the box.
  3. Danno due esposizioni di ozono (ogni esposizione durata 3 ore) a settimana (una volta ogni 3 giorni) per 7 settimane; esporre i topi di controllo di aria allo stesso tempo e per lo stesso periodo.

3. Micro-tomografia

  1. alla fine della settimana 7, anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale del pelltobarbitalum natricum (1%, 0,6 - 0,8 ml/100 g) aggiustare la dose in base alle singole situazioni per vedere che il mouse non rispondere a una punta pizzico. Monitor e tenere il mouse ad una frequenza di respirazione costante; e assicurarsi che nessun movimenti volontari esistono durante le procedure.
  2. Porre i topi anestetizzati nella camera di una micro-tomografia computerizzata (µCT).
  3. Calibrare il µCT utilizzando il protocollo standard e il produttore ' s istruzioni. Fissato il tubo di raggi x a 50 kV e la corrente alle 450 µA.
    Nota: Entrambi i raggi x e il rivelatore ruotano attorno i topi.
  4. Eseguire l'analisi µCT con l'acquisizione di 515 proiezioni con una dimensione di pixel effettivi di 0,092 mm, un tempo di esposizione di 300 ms per una fetta e uno spessore di fetta di 0,093 mm.
  5. Ricostruire il polmone con le immagini acquisite utilizzando un software. Regolare la luminosità dell'immagine in scala di grigi impostando rispettivamente il minimo e il massimo di grigi alle unità di Hounsfield-750 e -550,.
    Nota: Il software calcolerà automaticamente i volumi del parenchima polmonare e la zona bassa attenuazione (LAA) 34 , 35.
  6. Calcolare la percentuale di LAA (LAA %) dividendo il volume LAA dal volume polmonare totale.

4. tapis roulant Test

  1. dare i topi un adattamento di prova ad una velocità di 10 m/min per 10 min su una corsa tapis roulant macchina. Nota: l'elettricità è sempre spento quando la procedura sta conducenda.
  2. amministra un prova di fatica per i topi.
    1. Riscaldare i topi ad una velocità di 10 m/min per 5 min.
    2. Aumentare la velocità a 15 m/min per 10 min.
    3. Aumentare l'intensità dell'esercizio: aumentare la velocità di 5 m/min, a partire da 20 m/min, ogni 30 min fino a topi non può continuare a eseguire 36.
  3. Registrare la totale distanza corrente e tempo di esecuzione come distanza di affaticamento e stanchezza tempo, rispettivamente.

5. misure di funzione polmonare

  1. anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale del pelltobarbitalum natricum (1%, 0,6 - 0,8 ml/100 g) aggiustare la dose in base alle singole situazioni per vedere che il mouse non non rispondere a un pizzico di punta e attendere che i topi hanno mantenuto respirazione spontanea. Monitor e tenere il mouse ad una frequenza di respirazione costante; e assicurarsi che nessun movimenti volontari esistono durante le procedure.
  2. Attentamente tracheostomize i topi e metterli in un pletismografo di corpo che è collegato ad un ventilatore controllato dal computer.
    Nota: La ventilazione è controllato tramite una valvola posta prossimalmente al tubo endotracheale. Il programma di installazione fornisce diverse manovre semi-automatiche, tra cui la manovra del volume pressione quasi-statica e la manovra del volume flusso veloce.
  3. Imporre una media frequenza di 150 respiri/min al mouse anestetizzato tramite ventilazione pressione-controllata fino a un modello di respirazione regolare respiratoria e completa scadenza ad ogni ciclo di respirazione è ottenuta.
  4. Eseguire la manovra di pressione-volume quasi-statico con il dispositivo utilizzando pressioni negative generate nel pletismografo.
  5. Eseguire la manovra di volume di flusso veloce entro i loop di pressione-volume quasi-statica per registrare la FVC e il FEV. Gonfiare il polmone a + 30 cm H 2 O ed immediatamente in seguito, collegarlo a una pressione altamente negativa per far rispettare la scadenza fino a quando il volume residuo è a-30 cm H 2 O. Record il FEV nelle prime 25, 50 e 75 ms dell'espirazione (FEV 25 FEV 50 e FEV 75, rispettivamente). Respingere le manovre non ottimali. Per ogni test con ogni singolo mouse, condurre un minimo di tre manovre accettabili per ottenere un mezzo affidabile per tutti i parametri numerici.

6. BALF collezione

  1. a seguito di anestesia terminale con pelltobarbitalum natricum ((1%, 1.8-2.4 ml/100 g) aggiustare la dose in base alle situazioni individuali per vedere che il mouse non rispondere a un pizzico di punta e perdere il respiro), il lavaggio la topi con 2 mL di PBS tramite un tubo endotracheale di 1 mm di diametro e quindi recuperare il BALF 10.
  2. Raccogliere le aliquote di Estratto di lavanda e centrifugare li a 4 ° C e 250 x g per 10 min.
  3. Raccogliere il surnatante per un uso immediato e memorizzare il resto a-80 ° C o azoto liquido.
  4. Contare il numero totale di celle utilizzando un emocitometro.
  5. Risospendere il pellet cellulare in PBS e quindi spin (1.400 x g, 6 min) 250 µ l di sedimento cellule sui vetrini utilizzando una centrifuga spinner diapositiva.
  6. Applicare Wright colorazione di cellule sulle diapositive secondo il produttore ' protocollo s.
  7. Contare 200 celle per topo; identificare le cellule come i macrofagi o neutrofili, secondo standard morfologia, sotto 400 ingrandimenti; e contare i loro numeri.

7. Prelievo di sangue cardiaco

  1. raccogliere il sangue tramite puntura cardiaca, caricarlo in provette da 1,5 mL e tenerlo in ghiaccio per 30 min.
  2. Centrifugare i campioni di sangue per 5 min a 2.000 x g e 4 ° C.
  3. Trasferire il surnatante (siero) ad un nuovo tubo e conservare a-80 ° C o azoto liquido.
  4. Preparare il siero per IL-1 β, IL-10 e TNF-α rilevamento test utilizzando i rispettivi kit ELISA.

8. L'analisi morfometrica del polmone

  1. sezionare i polmoni e i tracheas dai topi.
    1. Posizionare ogni mouse eutanasizzati su una scheda chirurgica subito dopo sacrificio.
    2. Distanza sezionare il platisma e muscoli anteriori tracheali per visualizzare e accedere gli anelli tracheali.
    3. Open up toracico cavità. Sezionare i polmoni e la trachea, ma non separare il cuore dai polmoni.
  2. Collegare il catetere endotracheale per una siringa contenente paraformaldeide 4% attraverso un tubo di polietilene PE90.
    Attenzione: Paraformaldeide è tossico. Indossare guanti e occhiali di sicurezza e utilizzare la soluzione all'interno di una cappa aspirante.
  3. Gonfiare il polmone completamente usando paraformaldeide al 4% (10 gocce, ~ 200 µ l) attraverso il catetere endotracheale. Togliere il cuore dopo il completamento della inflazione.
  4. Mantieni il polmone in una provetta da 15 mL contenente 10 mL di paraformaldeide al 4% per almeno 4 h.
  5. Incorporare il polmone in paraffina. Ottenere le sezioni 5-µm dal blocco di paraffina sezionamento con un microtomo rotativo. Durante il sezionamento, esporre la superficie massima del tessuto polmonare all'interno dell'area dell'albero bronchiale.
  6. Per l'analisi morfometrica, eseguire ematossilina ed eosina (H & E) colorazione sulle sezioni.
  7. Le sezioni di immagine con un microscopio verticale campo chiaro (lente dell'obiettivo, 20x; tempo di esposizione, ms 1,667).
  8. Hanno due investigatori accecati per il protocollo di trattamento indipendentemente contare le sezioni istologiche. Utilizzare l'intercetta lineare media (L m) come parametro per misurare la distanza della parete del setto Inter-alveolare. Determinare L m attenendosi alla seguente procedura:
    1. aprire le immagini delle sezioni in Photoshop e disegnare una griglia di reticolo sull'immagine con linee lunghe cinque 550 µm.
    2. Contare il numero degli alveoli su tutta la linea di griglia.
    3. Calcolare L m dividendo la lunghezza della linea griglia per il numero degli alveoli. Per la quantificazione, immagine cinque sezioni per topo. Acquisire dieci immagini di ogni sezione (una sola immagine per ogni campo) e valutare in modo casuale. Durante la selezione del campo, evitare campi delle vie aeree e vasi spostando un campo in avanti o in un'altra direzione.
      Nota: I dati sono presentati come la media ± s.e.m. Un t-test ONU-accoppiato è stato effettuato per confronto tra aria-esposti topi e topi esposti a ozono. Tre animali di ogni gruppo sono stati utilizzati per calcolare la differenza significativa. Un valore di p < 0,05 è stato considerato significativo.

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Risultati

Esempi di immagini 3D µCT di ogni gruppo vengono visualizzati nella Figura 1un. I topi esposti a ozono hanno avuti un volume polmonare totale significativamente più grande (Figura 1un e b) e LAA % (Figura 1c) che ha fatto i topi di controllo aria-esposti. Il volume polmonare e LAA % è rimanere elevati dopo sei settimane di ozono esposizione

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Discussione

In questo studio, presentiamo un metodo affidabile per la generazione di un nuovo modello di BPCO. Rispetto ad altri modelli (cioè, LPS o modelli di dpi), questo modello di OE ricapitola il processo patologico di pazienti con BPCO. Poiché il fumo di sigaretta è il principale materiale pericoloso che le cause della BPCO in pazienti umani40, il modello CS rimane il più popolare BPCO modello41,42. Tuttavia, il modello CS richiede un ...

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Dichiarazioni

Z.W.S. e W.W. sono dipendenti attuali e i titolari di stock options del gruppo cellulare di biomedicina (NASDAQ: CBMG). Gli altri autori dichiarano di non avere nessun interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Gli autori vorrebbero esprimere gratitudine al signor Boyin Qin (Shanghai Public Health Clinical Center) per l'assistenza tecnica con la valutazione di µCT in questo protocollo.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Topi BALB/cSlac Laboratory Animal, Shanghai, CinaInquesto studio sono stati utilizzati topi BALB/c femmine di 7-9 settimane di età.
Gabbie ventilate individualiSuhang, Shanghai, CinaNumero di modello: MU64S7Le gabbie sono state utilizzate per ospitare i topi nella struttura per animali.
Scatola di perspex sigillanteSuhang, Shanghai, CinaN/ALa scatola è stata utilizzata per contenere il generatore di ozono. I topi sono stati esposti all'ozono all'interno della scatola.
Generatore elettricoSander Ozoniser, Uetze-Eltze, GermaniaModello 500 Il dispositivo è stato utilizzato per generare ozono.
Sonda per ozonoATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Greater Manchester, Regno UnitoOzono 300Il dispositivo è stato utilizzato per il monitoraggio e il controllo della generazione di ozono.
Pelltobarbitalum natricumSigma, St. Louis, MO, USAP3761I topi sono stati anestetizzati mediante iniezione intraperitoneale di pelltobarbitalum natricum.
Tomografia micro-computerizzataGE Healthcare, Londra, ON, CanadaRS0800639-0075Questo dispositivo è stato utilizzato per l'acquisizione di immagini del polmone.
Micro-view 2.01 ABA softwareGE Healthcare, Londra, ON, CanadaMicro-view 2.01 Questo dispositivo è stato utilizzato per ricostruire il polmone e analizzare il volume, LAA del polmone.
Tapis roulant Duanshi, Hangzhou, Zhejiang, CinaDSPT-208Questa macchina è stata utilizzata per la prova di fatica.
Pletismografo per carrozzeriaeSpira™ Sistema di manovre forzate, EMMS, Edimburgo, Regno UnitoSistema di manovre forzateQuesto dispositivo è stato utilizzato per testare la funzione polmonare della spirometria.
VentilatoreeSpira™ Sistema di manovre forzate, EMMS, Edimburgo, Regno UnitoSistema di manovre forzateQuesto dispositivo è stato utilizzato per testare la funzione polmonare della spirometria.
Centrifuga per vetriniDenville Scientific, Holliston, MA, USAC1183 È stato utilizzato per far girare le cellule BALF su vetrini.
Wright StainingHanhong, Shanghai, CinaRE04000054  È stato utilizzato per colorare i macrofagi e i neutrofili nel BALF sospeso.
EmocitometroHausser Scientific, Horsham, PA, USA4000Veniva utilizzato per contare le cellule.
IL-1βAbcam, Cambridge, MA, USAab100704Sono stati utilizzati per testare i rispettivi fattori nel siero.
IL-10Abcam, Cambridge, MA, USAab46103Sono stati utilizzati per testare i rispettivi fattori nel siero.
TNF-&alfa;Abcam, Cambridge, MA, USAab100747Sono stati utilizzati per testare i rispettivi fattori nel siero.
ParaformaldeideSigma, St. Louis, MO, USAP6148Il polmone è stato gonfiato con paraformaldeide al 4%.
ParaffinaHualing, Shanghai, Cina56#È stato utilizzato per incorporare il polmone.
Microtomo rotativoLeica, Wetzlar,  Assia, GermaniaRM2255È stato utilizzato per il sezionamento del polmone.
Hgaematossilina ed eosina (H& E) soluzione coloranteSolarbio, Pechino, CinaG1120H& La colorazione E è stata eseguita per l'analisi morfometrica.
Microscopio verticale a campo chiaroOlympus, Center Valley, PA, USACX41È stato utilizzato per visualizzare l'H& E vetrini coloranti.
Adobe Photoshop 12Adobe, San Jose, CA, Stati UnitiAdobe Photoshop 12È stato utilizzato per contare il numero di alveoli sul H & E immagini colorate.
Prisma GraphPad 5Graphpad Software Inc., San Diego, CAPrisma GraphPad 5È stato utilizzato per l'analisi dei dati e la produzione di figure.

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