Questo protocollo fornisce istruzioni per i campioni di virus di colorazione negativi che possono essere facilmente utilizzati nei laboratori BSL-2, -3, o -4. Comprende l'utilizzo di una innovativa capsula di elaborazione che protegge la griglia di microscopia elettronica di trasmissione e fornisce all'utente la gestione più agevole negli ambienti più turbolenti all'interno del biocontainment.
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Articolo metodologico
Utilizzazione di capsule per la colorazione negativa di campioni virali all'interno del Biocontainment
In questo articolo
Sommario
Abstract
La microscopia elettronica di trasmissione (TEM) è usata per osservare l'ultrastruttura di virus e altri patogeni microbici con risoluzione nanometrica. La maggior parte dei materiali biologici non contengono elementi densi in grado di spargere elettroni per creare un'immagine; Pertanto, è necessaria una macchia negativa che pone sali duri di metalli pesanti intorno al campione. Per visualizzare i virus in sospensione sotto il TEM devono essere applicati a piccole griglie rivestite con una superficie trasparente solo in nanometri spesse. A causa della loro piccola dimensione e fragilità, queste griglie sono difficili da gestire e facilmente mosse dalle correnti d'aria. La superficie sottile è facilmente danneggiata, lasciando difficile o impossibile l'immagine. I virus infettivi devono essere trattati in un armadio di biosicurezza (BSC) e alcuni richiedono un ambiente di laboratorio per la bioconvenzione. La colorazione dei virus nei livelli di biosicurezza (BSL) -3 e -4 è particolarmente impegnativa perché questi ambienti sono più turbolenti e sono richiesti tecniciO indossare equipaggiamento protettivo personale (PPE), che diminuisce la destrezza.
In questo studio abbiamo valutato un nuovo dispositivo per aiutare i virus di colorazione negativi nel biocontain. Il dispositivo è una capsula che funziona come una punta specializzata della pipetta. Una volta che le griglie vengono caricate nella capsula, l'utente semplicemente aspira i reagenti nella capsula per consegnare il virus e le macchie alla griglia incapsulata, eliminando così la manipolazione degli utenti delle griglie. Anche se questa tecnica è stata progettata appositamente per l'uso in biocontain di BSL-3 o -4, può facilitare la preparazione del campione in qualsiasi ambiente di laboratorio, consentendo una facile colorazione negativa del virus. Questo stesso metodo può essere applicato anche per preparare campioni TEM negativi negativi di nanoparticelle, macromolecole e campioni simili.
Introduzione
La microscopia elettronica di trasmissione (TEM) è uno strumento efficace per visualizzare la morfologia e l'ultrastruttura di campioni biologici troppo piccoli da vedere con un tradizionale microscopio leggero 1 , 2 , 3 , 4 . I TEM sparano gli elettroni attraverso un esemplare molto sottile che produce un'immagine di risoluzione più elevata in quanto gli elettroni hanno una lunghezza d'onda molto più breve della luce. Le regioni del campione che piegano o bloccano gli elettroni appaiono scuri, mentre le regioni che sono elettri....
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Protocollo
1. Preparazione dell'esperimento in un ambiente BSL-2 prima di utilizzare i campioni di virus
- Preparare o acquistare Formvar e griglie di rame TEM, rivestite di carbonio, di solito 200-400 maglie.
- Inserire le griglie TEM rivestite in capsule.
- Utilizza una lente ingrandita per rendere questo processo facile da eseguire. Una o due griglie possono essere inserite in ciascuna capsula. Le capsule pre-caricate possono essere acquistate per eliminare questa fase se lo si desidera.
- Trasferire le capsule con griglie trattate con TEM, insieme ad altre forniture e reagenti, al bioconvettore dove i virus sara....
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Risultati
Il metodo della capsula produce una colorazione negativa di buona qualità per l'imaging TEM:
In primo luogo, abbiamo valutato la qualità delle immagini generate usando sia il metodo manuale a goccia che i metodi della capsula per la colorazione negativa Zaire ebolavirus. Gli ebolavirus sono membri della famiglia Filoviridae , insieme al virus di Marburg. Ebolavirus è in genere da 80 a 100 nm di diametro e può essere .......
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Discussione
La colorazione negativa è una preziosa tecnica TEM per valutare e dimensionare i virus, i complessi proteici e le nanoparticelle. La preparazione di goccioline di questi campioni mediante movimentazione manuale di griglie dal reagente a macchie negative è stata il classico protocollo da più di mezzo secolo. È un processo semplice, ma richiede competenze acquisite attraverso la formazione per il completamento del successo. Ottima colorazione negativa è ancora considerata un set di abilità all'avanguardia e altamente .......
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Dichiarazioni
Le opinioni, le interpretazioni, le conclusioni e le raccomandazioni contenute nell'articolo sono quelle degli autori e non sono necessariamente approvate dall'esercito statunitense o dal Dipartimento della Difesa.
Ringraziamenti
Vorremmo riconoscere e ringraziare il Dott. John Carra e Rowena Schokman per aver fornito i nano-VLP Ebola purificati, il Dr. Rajini Mudhasani per la fornitura del virus Chikungunya e il Dott. Charles (Jason) Shoemaker per la fornitura di VLP di leucemia murina che esprimono glicoproteine Ebolavirus. Vorremmo inoltre ringraziare MAJ Carl Soffler per facilitare il programma di tirocinio estivo (SIP) e il programma di apprendistato per la scienza e l'ingegneria (SEAP) e la dottoressa Catherine Wilhelmsen per la formazione sulla sicurezza del laboratorio.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Griglie TEM rivestite in formato forma/carbonio | SPI | 3420C-MB | 200 mesh Cu Pk/100 |
| mPrep/g capsule | EMS | 85010-01 | scatola |
| accoppiatori mPrep/f | EMS | 85010-11 | standard 16/Pk |
| glutaraldehdyde | EMS | 16320 | soluzione al 50%, |
| tetrossido di osmio | EMS | 19190 | soluzione |
| Acetato di uranile | EMS | 22400 | polvere |
| Acido fosfotungstico di potassio | EMS | 19500 | |
| carta da filtro | in polvere Whatman | 1450-090 | misura 50 |
| Microscopio elettronico a trasmissione | JEOL JEM-1011 | TEM |
Riferimenti
- Gentile, M., Gelderblom, H. R. Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update. New Microbiol. 37 (4), 403-422 (2014).
- Kruger, D. H., Schneck, P., Gelderblom, H. R. Helmut Ruska and the visualisation of viruses. Lancet. 355 (9216), 1713-1717 (2000).
- Curry, A., Appleton, H.....
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Ristampe e permessi
