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Articolo metodologico

Rilevamento della colonizzazione di Escherichia Coli enteroemorragica in murino Host di sistema Non invasivo In Vivo bioluminescenza

9K visualizzazioni

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DOI:

10.3791/56169

⸱

9 aprile 2018

 ,  , 
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University

In questo articolo

Sommario

Un protocollo dettagliato di un modello murino per enteroemorragica e. coli (enteroemorragico EHEC) colonizzazione tramite bioluminescenza-identificati batteri è presentato. La rilevazione di questi batteri bioluminescenti di un non-invasiva in vivo imaging sistema animali vivi può avanzare la nostra comprensione corrente della colonizzazione di EHEC.

Abstract

Enteroemorragica e. coli (enteroemorragico EHEC) O157: H7, che è un agente patogeno portato dagli alimenti che causesdiarrhea, colite emorragica (HS), e la sindrome uremica emolitica (HUS), colonizzare il tratto intestinale degli esseri umani. Per studiare il meccanismo dettagliato della EHEC colonizzazione in vivo, è essenziale disporre di modelli animali per monitorare e quantificare la colonizzazione di EHEC. Dimostriamo qui un modello di colonizzazione del mouse-EHEC trasformando il plasmide di espressione bioluminescente per EHEC per monitorare e quantificare la colonizzazione di EHEC in soggiorno ospiti. Animali inoculati con bioluminescenza-labeled EHEC mostrano segnali bioluminescenti intensi in topi tramite rilevazione con un non-invasiva in vivo imaging sistema. Dopo 1 e 2 giorni dopo l'infezione, bioluminescenti segnali potrebbero essere ancora presente in animali infettati, che suggerisce che EHEC colonizzare in padroni di casa per almeno 2 giorni. Inoltre dimostriamo che questi EHEC bioluminescenti individuare all'intestino del mouse, specificamente nell'intestino cieco e del colon, da immagini di ex vivo . Questo modello di colonizzazione del mouse-EHEC può servire come strumento per far progredire la conoscenza corrente del meccanismo di colonizzazione di EHEC.

Introduzione

EHEC O157: H7 è un patogeno che causa diarrea1, HS2, HUS3e anche insufficienza renale4 attraverso cibo o acqua contaminato. EHEC è un patogeno enterobacterium e colonizza il tratto gastrointestinale di esseri umani1. Quando EHEC prima aderire all'epitelio intestinale host, iniettano i fattori di colonizzazione nelle cellule ospiti attraverso il sistema di secrezione di III tipo (T3SS) che funziona come una siringa molecolare che induce un fissaggio e cancellando (A/E) lesione successivamente per imporre adesione (colonizzazione)5. Questi geni coinvolti nella formazione della lesione A/E codificati per il locus dell'enterocita (LEE) il effacement patogenicità isola5.

Bioluminescenza è una reazione chimica produzione di luce, in cui luciferasi catalizza la luciferina di substrato per generare luce visibile6. Questo processo enzimatico richiede spesso la presenza di ossigeno o l'adenosina trifosfato (ATP)6. Bioluminescenza imaging (BLI) permette ai ricercatori la visualizzazione e la quantizzazione delle interazioni ospite-patogeno in animali vivi7. BLI possono caratterizzare il ciclo di infezione batterica in animali vivi seguendo i batteri bioluminescenti come migrare e invadere i tessuti differenti7; Questo rivela una progressione dinamica dell'infezione. Inoltre, la carica batterica negli animali è relativo al segnale bioluminescenti8; così, è un comodo indicatore per stimare le condizioni patologiche degli animali da esperimento in modo semplice e diretto.

Il plasmide usato qui contenute l'operone luciferasi, luxCDABE, che è il batterio Photorhabdus luminescens che codifica la propria luciferasi substrato7,9. Trasformando questo plasmide esprimendo la luciferasi in batteri, i processi di colonizzazione e l'infezione possono essere monitorati osservando questi batteri bioluminescenti animali vivi. Nel complesso, BLI e bioluminescenza-identificati batteri permettono ai ricercatori di monitorare i numeri batterici e la posizione, la vitalità batterica con antibiotici/terapia trattamento ed espressione genica batterica infezione/colonizzazione6, 7. sono stati segnalati numerosi batteri patogeni che esprimono l'operone luxCDABE per esaminare la loro espressione di ciclo e/o gene di infezione nell'infezione. Questi batteri, tra cui uropathogenic Escherichia coli10, EHEC8,11,12,13, enteropatogeni e. coli (EPEC)8, Citrobacter Rodentium14,15, Salmonella typhimurium16, Listeria monocytogenes17, Yersinia enterocolitica18,19, e Vibrio cholerae20, sono stati documentati.

Parecchi modelli sperimentali sono stati sviluppati per facilitare lo studio di EHEC colonizzazione in vitro e in vivo21,22,23. Tuttavia, c'è una mancanza di adeguati modelli animali per studiare l'EHEC colonizzazione in vivoe quindi una conseguente scarsità di dettagli. Per facilitare lo studio di EHEC colonizzazione meccanismo in vivo, è prezioso per costruire modelli animali per osservare e quantificare la colonizzazione di EHEC animali vivi in un metodo non-invasivo.

Questo manoscritto descrive un modello di colonizzazione del mouse-EHEC che utilizza un sistema di espressione bioluminescente per monitorare la colonizzazione di EHEC nel tempo in soggiorno ospiti. Topi intragastrically vengono inoculati con bioluminescenza-labeled EHEC e viene rilevato il segnale bioluminescente in topi con un non-invasiva in vivo imaging sistema13. I topi infettati con bioluminescenza-labeled EHEC hanno mostrato significativi segnali bioluminescenti in loro intestino dopo 2 giorni dopo l'infezione, che ha suggerito che tali batteri colonizzarono nell'intestino ospite dopo 2 giorni dopo l'infezione. Ex vivo immagine dati hanno mostrato che questa colonizzazione è specificamente nell'intestino cieco e del colon dei topi. Utilizzando questo modello di mouse-EHEC, la colonizzazione di EHEC bioluminescente può essere rilevata nell'ospite vivente da uno in vivo imaging system, per studiare i meccanismi dettagliati della colonizzazione di batteri enterici, che possono promuovere ulteriore comprensione in Cambiamenti fisiologici e patologici indotti da EHEC.

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Protocollo

Attenzione: EHEC O157: H7 è un livello di biosicurezza 2 (BSL-2) agente patogeno secondo i Centers for Disease Control and Prevention (CDC) istruzioni di sicurezza biologica (https://www.cdc.gov/). Di conseguenza, tutte le procedure sperimentali che coinvolgono EHEC devono essere effettuate in una struttura di BSL-2. Indossare guanti e camici da laboratorio quando si effettua l'esperimento. Lavorare in una certificato di biosicurezza (BSC). Disinfettare il banco sperimentale prima e dopo la procedura sperimentale con etanolo al 70%. Tutti gli strumenti o attrezzature che EHEC contatto (o potenzialmente contatto) deve essere disinfettata con etanolo al 70% o candeggina. Rifiuti contaminati (o potenzialmente contaminati) dovrebbero essere accuratamente sigillati e sterilizzati in autoclave. Indossare una maschera, occhiali protettivi, guanti doppio o una tuta, se necessario. I topi femminili C57BL/6 di 6-settimana-vecchio sono stati acquistati e mantenuti presso il laboratorio animale Center del National Cheng Kung University (NCKU). Esperimenti sugli animali sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Comitato di NCKU (numero di omologazione 104-039).

1. generazione di batteri EHEC Bioluciferase-etichettato

  1. Mix 50 ng dell'acido deossiribonucleico (DNA), 1 μL ogni 10 μm avanti e indietro primer, 2 μL 2,5 mM deossinucleotidi (dNTP), 2 μL 10 x buffer, 0,2 μL DNA polimerasi e acqua bidistillata sterile (ddH2O) ad un volume finale di 20 μL per amplificare il Cassetta anti-kanamicina, nptII gene24. Il modello di DNA è da pBSL18024, che è stato acquistato da progetto nazionale di BioResource (NBRP). Le condizioni PCR sono elencate nella tabella 1 e sequenza del primer è disponibile nella tabella 2.
  2. Legare i prodotti di PCR in un vettore di clonazione commerciale seguendo il kit protocollo (Vedi Tabella materiali).
  3. Asportare il frammento del gene nptII dal vettore di clonazione da NsiI e SmaI e clonare in pBBR1MCS4, che viene digerito dal NsiI e ScaI da pAKlux29 per creare il plasmide resistente kanamicina, pWF27813.
  4. Asportare l'operone luxCDABE , dalla luciferasi esprimendo plasmide9, pAKlux2, di SpeI-HF e ScaI e clone SpeI-HF e SmaI digerito pWF278 per generare kanamicina resistente e luciferasi esprimendo plasmide, pWF27913.
    Nota: Per le estrazioni di plasmide e le purificazioni di frammento asportato, utilizzare l'estrazione commerciale plasmide e il kit di estrazione del gel, rispettivamente. Per digestione degli enzimi, mescolare 100 ng DNA, 1 μL 10 x buffer, 1 μL di ogni selezionato degli enzimi di limitazione e sterile ddH2O ad un volume totale di 10 μL e incubare a 37 ° C per 2,5-3 ore.
  5. Trasformare il plasmide pWF279 in cellule competenti di Escherichia coli O157: H7 EDL933 mediante elettroporazione con 2.500 V per 4 ms.
  6. Incubare le cellule di batteri trasformati in 1 mL di terreno di Luria-Bertani (LB) a 37 ° C per 1 h.
  7. Piastra i batteri su una piastra di agar LB completati con 50 µ g/mL di kanamicina a 37 ° C per 16-18 h.
  8. Controllare il segnale bioluminescente della piastra da uno in vivo imaging macchina il giorno successivo. Scegli una singola Colonia dalla piastra e cultura esso in 3 mL di LB completati con 50 kanamicina µ g/mL a 37 ° C per 16-18 h.
  9. Preparare il supporto di stock batterico diluendo 100% glicerolo sterile ddH2O per rendere la soluzione di glicerolo di 30%.
  10. La kanamicina resistente al gelo e. coli O157: H7 EDL933 batteri che harboring il plasmide luciferasi come azione batterica in un tappo a vite cryovial come un rapporto di 1:1 di soluzione di glicerolo cultura e 30% di batteri a-80 ° C. La concentrazione finale del glicerolo è del 15%.

2. preparazione di batteri EHEC bioluminescenti per inoculazione orale

Nota: Il diagramma di flusso di timeline delle procedure sperimentali per la preparazione di EHEC e sonda gastrica orale del mouse è presentato nella Figura 1 per aiutare nella preparazione sperimentale.

  1. Striscia e. coli O157: H7 EDL933 batteri che harboring plasmide luciferasi su una piastra di agar LB con 50 kanamicina µ g/mL a magazzino di-80 ° C. Crescere i batteri per 16-18 h a 37 ° C.
  2. Scegliere una singola Colonia dalla piastra durante la notte e la cultura in 3 mL LB medium con 50 kanamicina µ g/mL per 16-18 h in un incubatore a 37 ° C a 220 giri/min.
  3. Sottocultura i batteri (diluizione 1: 100) in kanamicina (50 µ g/mL) contenenti brodo LB per 2.5-3 h in un incubatore a 37 ° C a 200 giri/min. (Per esempio, aggiungere 2 mL coltivato durante la notte i batteri per mL 200 LB supplementato con kanamicina (50 µ g/mL)).
  4. Incubare i batteri per 2.5-3 h e misurare il valore di densità ottica a 600 nm (OD600) fino a quando il valore è compreso tra 0,9 a 1. Il numero di cellule batteriche è una densità di8 di circa 10 con unità formanti colonie (CFU) / mL.
  5. Centrifugare i batteri ri-colti a 8.000 x g per 30 min, 4 ° C.
  6. Scartare il supernatante senza agitare il pellet di batteri e lavare la pallina con 100 mL 0,9% normale soluzione salina sterile di movimentazione delicata.
  7. Ripetere i passaggi da 2.5 e 2.6 una volta.
  8. Dopo il lavaggio, centrifugare la coltura batterica a 8.000 x g per 30 min, 4 ° C e scartare il surnatante delicatamente.
  9. Condensa il pellet a 100 volte con soluzione salina sterile 0,9%. Per esempio, se sono centrifugati batteri 200 mL, aggiungere 2 mL di normale soluzione salina per sospendere il pellet.
  10. Confermare i batteri CFU (dovrebbe essere circa 109 CFU/100 μL dopo condensazione in salino normale) i batteri concentrati attraverso una diluizione seriale 10 volte25di placcatura.

3. Mouse Gavage orale di EHEC

  1. Trattare 6-settimana-vecchi topi C57BL/6 femminili con acqua di streptomicina (5 g/L) per 24 h.
  2. Dopo 24 h, passare alla normale acqua potabile per un altro 24 h prima sonda gastrica. Dopo il trattamento con acqua normale per 24 h, i topi sono pronti per sonda gastrica orale di EHEC.
  3. Riempire la siringa con 100 batteri EHEC di μL tirando indietro lo stantuffo. Assicurarsi che non siano bolle d'aria nella siringa. Rimuovere le bolle schioccando la siringa con le dita.
  4. Sollevare delicatamente l'animale e posizionarlo sulla parte superiore gabbia con cura.
  5. Afferrare il mouse per la coda con attenzione, e l'animale verrà presa nella parte superiore della gabbia e tentare di allontanare.
  6. Frenare dolcemente il mouse afferrando la pelle flaccida del collo e sul retro l'animale con pollice e indice per impedire che la testa del mouse in movimento.
  7. Tenere premuto il mouse in posizione verticale per inserire l'ago sonda gastrica e garantire che la testa del mouse è immobilizzato e verticale.
  8. Inserire l'ago sonda gastrica in bocca del mouse seguendo il tetto della bocca e spostare verso il basso nell'esofago e verso lo stomaco.
  9. Quando l'ago inserito è metà o due terzi lunghezza nel topo, iniettare 100 batteri EHEC μL, che contengono circa 10 celle di9 CFU.

4. visualizzazione

  1. Dopo l'alimentazione mediante sonda gastrica orale, rilevare i segnali bioluminescenti nei giorni 1 e 2.
  2. Prima di esaminare i segnali bioluminescenti di animali, li anestetizzare inserendole in una camera di 2,5% isoflurane con 1,5 L/min di ossigeno.
  3. Attendere 2-5 min fino a quando tutti i topi diventano inconscio e si fermano. Gli animali sono pronti per la rilevazione in vivo della bioluminescenza.
  4. Rilevare e immagine bioluminescenti segnali di animali da uno in vivo imaging system. Vedi sezione 5 "Acquisizione dati" per il funzionamento del software. Durante il processo di imaging, tutti gli animali sono sotto una fornitura continua di 2,5% isoflurane con 1,5 L/min di ossigeno.
    1. Fare clic su file > dal vivo e manualmente si concentrerà sul mouse.
    2. Selezionare l'intensità di laser e tempo di esposizione.
    3. Fare clic su acquisire > catturare.
  5. Per l'ex vivo imaging, eutanasia i topi di dislocazione cervicale e rimuovere l'intero intestino dei topi infettati. Posizionare l'intestino in una capsula di Petri e immagine a 9 cm dal in vivo imaging sistema. L'impostazione è la stessa come l'in vivo imaging tranne il campo di vista è impostato come A/B. Per dettagli, vedere sezione 5 "Acquisizione dati".
    Nota: Il metodo per dislocazione cervicale: frenare i topi sulla parte superiore gabbia afferrando la coda con una mano in modo che gli animali afferrare la gabbia. Posizionare un pennarello o il pollice e l'indice di altra mano contro la parte posteriore del collo alla base del cranio. Spingere in avanti con la mano o un oggetto mentre tratteneva la testa e tirare all'indietro con la mano che tiene la coda rapidamente.
    Controllare molto attentamente per confermare l'arresto respiratorio e nessun battito cardiaco.

5. acquisizione dati

Nota: Il software utilizzato per l'acquisizione dati è elencato nella Tabella materiali.

  1. Per acquisizione di immagini, aprire il pannello di controllo di acquisizione del software (Figura 2).
  2. Selezionare "Luminescente", "fotografare" e "Overlay".
  3. Impostare il tempo di esposizione come "Auto". Impostare Binning come "Medio".
  4. Impostare ƒ/stop come 1 per luminescenti e 8 per fotografia. Ƒ/stop controlli la quantità di luce ricevuta dal sensore CCD.
  5. Impostare il campo visivo basato sul campo delle immagini che sono di interesse per l'acquisizione. Opzione "D" può montare cinque 6-settimana-vecchi topi e loro immagine tutto in un momento. "C" potete immagine tre 6-settimana-vecchi topi in un campo.
  6. Una volta che i topi/campioni sono pronti per l'imaging, fare clic su "Acquire" per acquisizione di immagini.
  7. Aprire i dati di immagine che è stati acquistati.
  8. Aprire il pannello tavolozza degli strumenti (Figura 3).
  9. Selezionare strumenti di ROI. Si consiglia il cerchio (quello più a sinistra) alla gamma della zona bioluminescente sulle immagini (Figura 4).
  10. Fare clic su "Misura ROIs" (icona di matita) per misurare l'intensità bioluminescente superficie (Figura 3). Il pannello di ROI misurazioni e i valori di quantificazione appaiono (Figura 5).
  11. Utilizzare la misurazione configurare nell'angolo sinistro del pannello misure ROI per selezionare i valori/informazioni necessarie (Figura 6), in caso contrario fare clic su "Esporta" per esportare questa tabella di dati e salvare come file CSV (Figura 5).
  12. Utilizzare i valori della colonna "Flusso totale (p/s)" come la quantificazione bioluminescenti intensità nel file CSV.

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Risultati

Abbiamo amministrato la bioluminescenza-labeled EHEC (~ 109 cellule batteriche) ai topi C57BL/6 femminili 6 - settimana-vecchi mediante sonda gastrica orale. Dopo la somministrazione orale di EHEC ai topi all'interno di 1h, gli animali sono stati esaminati per segnale bioluminescenti secondo il sistema di imaging in vivo come mostrato nella Figura 7. I risultati hanno mostrato un forte segnale bioluminescente in topi di sonda gastrica con ...

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Discussione

È stato segnalato che EHEC trasformati con il plasmide luciferasi è stato utilizzato per esaminare la localizzazione nel host o espressione genica in vivo8,11,12. Il modello murino dimostrato qui è stato segnalato anche per rilevare i tempi di EHEC colonizzato e localizzazione in host murino8. Tuttavia, forniamo il protocollo di dettaglio di come amministrare l'inoculazione di EHEC ai topi intrag...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Riconosciamo Chi-Chung Chen dal dipartimento di ricerca medica, Chi Mei Medical Center (Tainan, Taiwan) per l'aiuto nel topo di infezione e il supporto dal centro laboratorio animale della National Cheng Kung University. Questo lavoro è sostenuto dal Ministro della scienza e tecnologia (MOST) concede (più 104-2321-B-006-019, 105-2321-B-006-011,-005 and106-2321-B-006) a CC.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Incubatrice con agitatoreYIH DERLM-570Rincubazione batterica 
Incubatore con agitazione orbitaleFIRSTEKS300per incubazione di batteri 
pBSL180fonte del gene nptII
pAKlux2fonte di luxCDABE operone
T& Un kit di clonazioneYeastern BiotechFYC001-20Pda utilizzare per la clonazione TA 
Nsi INEBR0127Suso per il clonaggio di plasmidi 
Sca INEBR0122Suso per la clonazione di plasmidi 
Spe I-HFNEBR0133Suso per il clonaggio di plasmidi 
Sma I NEBR0141Suso per la clonazione di plasmidi 
T4 ligasiNEBM0202Suso per il clonaggio di plasmidi 
Ex TaqTaKaRaRR001Auso per l'amplificazione PCR
10X Ex Taq BufferTaKaRaRR001Auso per l'amplificazione PCR
dNTP Miscela TaKaRaRR001Auso per l'amplificazione PCR
PCRmacchina applicata Biosistema 2720 termociclatore   per l'amplificazione della PCR
GliceroloSIGMAG5516-1Luso per la soluzione di stoccaggio dei batteri
NaClSigma31434-5KG-Rprodotto chimico per la produzione di LB medium, 10 g/L
TryptoneCONDA pronadisaCat 1612.00prodotto chimico per la produzione di LB medium, 10 g/L
Estratto di lievito in polvereAffymetrix23547-1 KGprodotto chimico per la produzione di LB medium, 5 g/L
AgarCONDA pronadisaCat 1802.00prodotto chimico per la produzione di LB agar
kanamicina Antibiotici SigmaK4000-5G, uso per
la streptomicinaSigmaS6501-100G, eliminano il microbiota nei topi
EDL933 cellula competenteIl metodo fatto in casaè su documento supplementare.
ElettroporatoreMicroPulserper elettroporazione
Cuvette per elettroporazioneGene Pulser/MicroPulser1652086per elettroporazione
Centrifuga ad alta velocitàBeckman CoulterAvanti, J-26S XPuso per la centrifugazione di batteri 
Rotore ad angolo fissoBeckman CoulterJA25.5utilizzato per la centrifugazione di batteri 
Rotore ad angolo fissoBeckman CoulterJLA10.5uso per la centrifugazione dei batteri 
bottiglie da centrifugaBeckman CoulterREF357003utilizzare per centrifugare i batteri 
flaconi da centrifugaThermo Fisher scientific3141-0500uso per la centrifugazione dei batteri 
Eppendorf Biofotometro Plus eppendorfAG 22331 hamburgper la misurazione del valore OD600 dei
batteri C57BL/6 topiCamice da laboratorio Laboratory Animal Center di NCKU
, guantiper la protezione del personale 
isoflurano Panion & BF Biotech Inc.G-8669per anestesia dei topi, siringa da 1ml di grado farmaceutico
 utilizzare per la sonda orale dei topi Ago
per l'alimentazione riutilizzabile da 22 G con punta a sferaφ 0,9 mm X L 50 mmuso per sonda orale di topi
chirurgici   forbici  utilizzare per l'esperimento sui topi
Sistema di imaging Xenogen IVIS 200Perkin ElmerSpettro IVISutilizzare per l'acquisizione di immagini bioluminescenti 
Software di immagine viventePerkin Elmerversione 4.1per quantificare i dati dell'immagine
da selecitoneGli antibiotici

Riferimenti

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