Un protocollo dettagliato di un modello murino per enteroemorragica e. coli (enteroemorragico EHEC) colonizzazione tramite bioluminescenza-identificati batteri è presentato. La rilevazione di questi batteri bioluminescenti di un non-invasiva in vivo imaging sistema animali vivi può avanzare la nostra comprensione corrente della colonizzazione di EHEC.
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Articolo metodologico
Rilevamento della colonizzazione di Escherichia Coli enteroemorragica in murino Host di sistema Non invasivo In Vivo bioluminescenza
In questo articolo
Sommario
Abstract
Enteroemorragica e. coli (enteroemorragico EHEC) O157: H7, che è un agente patogeno portato dagli alimenti che causesdiarrhea, colite emorragica (HS), e la sindrome uremica emolitica (HUS), colonizzare il tratto intestinale degli esseri umani. Per studiare il meccanismo dettagliato della EHEC colonizzazione in vivo, è essenziale disporre di modelli animali per monitorare e quantificare la colonizzazione di EHEC. Dimostriamo qui un modello di colonizzazione del mouse-EHEC trasformando il plasmide di espressione bioluminescente per EHEC per monitorare e quantificare la colonizzazione di EHEC in soggiorno ospiti. Animali inoculati con bioluminescenza-labeled EHEC mostrano segnali bioluminescenti intensi in topi tramite rilevazione con un non-invasiva in vivo imaging sistema. Dopo 1 e 2 giorni dopo l'infezione, bioluminescenti segnali potrebbero essere ancora presente in animali infettati, che suggerisce che EHEC colonizzare in padroni di casa per almeno 2 giorni. Inoltre dimostriamo che questi EHEC bioluminescenti individuare all'intestino del mouse, specificamente nell'intestino cieco e del colon, da immagini di ex vivo . Questo modello di colonizzazione del mouse-EHEC può servire come strumento per far progredire la conoscenza corrente del meccanismo di colonizzazione di EHEC.
Introduzione
EHEC O157: H7 è un patogeno che causa diarrea1, HS2, HUS3e anche insufficienza renale4 attraverso cibo o acqua contaminato. EHEC è un patogeno enterobacterium e colonizza il tratto gastrointestinale di esseri umani1. Quando EHEC prima aderire all'epitelio intestinale host, iniettano i fattori di colonizzazione nelle cellule ospiti attraverso il sistema di secrezione di III tipo (T3SS) che funziona come una siringa molecolare che induce un fissaggio e cancellando (A/E) lesione successivamente per imporre adesione (colonizzazione)5
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Protocollo
Attenzione: EHEC O157: H7 è un livello di biosicurezza 2 (BSL-2) agente patogeno secondo i Centers for Disease Control and Prevention (CDC) istruzioni di sicurezza biologica (https://www.cdc.gov/). Di conseguenza, tutte le procedure sperimentali che coinvolgono EHEC devono essere effettuate in una struttura di BSL-2. Indossare guanti e camici da laboratorio quando si effettua l'esperimento. Lavorare in una certificato di biosicurezza (BSC). Disinfettare il banco sperimentale prima e dopo la procedura sperimentale con etanolo al 70%. Tutti gli strumenti o attrezzature che EHEC contatto (o potenzialmente contatto) deve essere disinfettata con etanolo al 70% o candeggina....
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Risultati
Abbiamo amministrato la bioluminescenza-labeled EHEC (~ 109 cellule batteriche) ai topi C57BL/6 femminili 6 - settimana-vecchi mediante sonda gastrica orale. Dopo la somministrazione orale di EHEC ai topi all'interno di 1h, gli animali sono stati esaminati per segnale bioluminescenti secondo il sistema di imaging in vivo come mostrato nella Figura 7. I risultati hanno mostrato un forte segnale bioluminescente in topi di sonda gastrica con .......
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Discussione
È stato segnalato che EHEC trasformati con il plasmide luciferasi è stato utilizzato per esaminare la localizzazione nel host o espressione genica in vivo8,11,12. Il modello murino dimostrato qui è stato segnalato anche per rilevare i tempi di EHEC colonizzato e localizzazione in host murino8. Tuttavia, forniamo il protocollo di dettaglio di come amministrare l'inoculazione di EHEC ai topi intrag.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Riconosciamo Chi-Chung Chen dal dipartimento di ricerca medica, Chi Mei Medical Center (Tainan, Taiwan) per l'aiuto nel topo di infezione e il supporto dal centro laboratorio animale della National Cheng Kung University. Questo lavoro è sostenuto dal Ministro della scienza e tecnologia (MOST) concede (più 104-2321-B-006-019, 105-2321-B-006-011,-005 and106-2321-B-006) a CC.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Incubatrice con agitatore | YIH DER | LM-570R | incubazione batterica |
| Incubatore con agitazione orbitale | FIRSTEK | S300 | per incubazione di batteri |
| pBSL180 | fonte del gene nptII | ||
| pAKlux2 | fonte di luxCDABE operone | ||
| T& Un kit di clonazione | Yeastern Biotech | FYC001-20P | da utilizzare per la clonazione TA |
| Nsi I | NEB | R0127S | uso per il clonaggio di plasmidi |
| Sca I | NEB | R0122S | uso per la clonazione di plasmidi |
| Spe I-HF | NEB | R0133S | uso per il clonaggio di plasmidi |
| Sma I | NEB | R0141S | uso per la clonazione di plasmidi |
| T4 ligasi | NEB | M0202S | uso per il clonaggio di plasmidi |
| Ex Taq | TaKaRa | RR001A | uso per l'amplificazione PCR |
| 10X Ex Taq Buffer | TaKaRa | RR001A | uso per l'amplificazione PCR |
| dNTP Miscela | TaKaRa | RR001A | uso per l'amplificazione PCR |
| PCR | macchina applicata Biosistema | 2720 termociclatore | per l'amplificazione della PCR |
| Glicerolo | SIGMA | G5516-1L | uso per la soluzione di stoccaggio dei batteri |
| NaCl | Sigma | 31434-5KG-R | prodotto chimico per la produzione di LB medium, 10 g/L |
| Tryptone | CONDA pronadisa | Cat 1612.00 | prodotto chimico per la produzione di LB medium, 10 g/L |
| Estratto di lievito in polvere | Affymetrix | 23547-1 KG | prodotto chimico per la produzione di LB medium, 5 g/L |
| Agar | CONDA pronadisa | Cat 1802.00 | prodotto chimico per la produzione di LB agar |
| kanamicina | Antibiotici Sigma | K4000-5G | , uso per |
| la streptomicina | Sigma | S6501-100G | , eliminano il microbiota nei topi |
| EDL933 cellula competente | Il metodo fatto in casa | è su documento supplementare. | |
| Elettroporatore | MicroPulser | per elettroporazione | |
| Cuvette per elettroporazione | Gene Pulser/MicroPulser | 1652086 | per elettroporazione |
| Centrifuga ad alta velocità | Beckman Coulter | Avanti, J-26S XP | uso per la centrifugazione di batteri |
| Rotore ad angolo fisso | Beckman Coulter | JA25.5 | utilizzato per la centrifugazione di batteri |
| Rotore ad angolo fisso | Beckman Coulter | JLA10.5 | uso per la centrifugazione dei batteri |
| bottiglie da centrifuga | Beckman Coulter | REF357003 | utilizzare per centrifugare i batteri |
| flaconi da centrifuga | Thermo Fisher scientific | 3141-0500 | uso per la centrifugazione dei batteri |
| Eppendorf Biofotometro Plus | eppendorf | AG 22331 hamburg | per la misurazione del valore OD600 dei |
| batteri C57BL/6 topi | Camice da laboratorio Laboratory Animal Center di NCKU | ||
| , guanti | per la protezione del personale | ||
| isoflurano | Panion & BF Biotech Inc. | G-8669 | per anestesia dei topi, siringa da 1ml di grado farmaceutico |
| utilizzare per la sonda orale dei topi Ago | |||
| per l'alimentazione riutilizzabile da 22 G con punta a sfera | φ 0,9 mm X L 50 mm | uso per sonda orale di topi | |
| chirurgici forbici | utilizzare per l'esperimento sui topi | ||
| Sistema di imaging Xenogen IVIS 200 | Perkin Elmer | Spettro IVIS | utilizzare per l'acquisizione di immagini bioluminescenti |
| Software di immagine vivente | Perkin Elmer | versione 4.1 | per quantificare i dati dell'immagine |
Riferimenti
- Pennington, H. Escherichia coli O157. Lancet. 376 (9750), 1428-1435 (2010).
- Mayer, C. L., Leibowitz, C. S., Kurosawa, S., Stearns-Kurosawa, D. J. Shiga toxins and the pathophysiology of hemolytic uremic syndrome in humans and animals. Toxins (Basel). 4 (11), 1261-1287 (2012).
- Tarr, P. I., Gord....
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Ristampe e permessi
