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Articolo metodologico

Derivazione di linee di cellule staminali da embrioni di Preimplantation Mouse

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⸱

DOI:

10.3791/56171

⸱

20 agosto 2017

 ,  , 
1Unitat de Biologia Cellular, Facultat de Biociències, Universitat Autònoma de Barcelona

In questo articolo

Sommario

Questo articolo descrive un protocollo per derivare e cultura pluripotenti linee di cellule staminali da embrioni di topo allo stadio di blastocisti efficacemente.

Abstract

Mouse sulle cellule staminali embrionali (mESC) derivazione è il processo da cui pluripotenti vengono stabilite linee cellulari da embrioni preimpianto. Queste linee mantengono la capacità di auto-rinnovarsi o differenziare in condizioni specifiche. Grazie a queste proprietà, mESC sono uno strumento utile in medicina rigenerativa, la modellazione di malattia e gli studi di ingegneria tissutale. Questo articolo viene descritto un semplice protocollo per ottenere linee mESC con efficienze di derivazione alta (60-80%) coltivando blastocisti da diversi ceppi di topi permissiva su cellule di alimentatore in medium definito completati con fattore inibitorio di leucemia. Il protocollo può anche applicarsi per derivare in modo efficiente mESC linee da diversi ceppi di topi non permissivi, per semplice aggiunta di un cocktail di due piccole molecole inibitori al medium di derivazione (2i medio). Procedure dettagliate sulla preparazione e sulla coltura di cellule di alimentatore, raccolta e cultura d'embrioni di topo e derivazione e mESC linee sono fornite. Questo protocollo non richiede attrezzature specializzate e può essere effettuato in qualsiasi laboratorio con competenze di cultura di base su cellule di mammifero.

Introduzione

Cellule staminali embrionali (ESC) sono cellule pluripotenti derivate da embrioni preimpianto, che mantengono la capacità di auto-rinnovarsi o differenziare sotto condizioni specifiche1. Basato su queste proprietà, ESC sono diventati uno strumento utile per la medicina rigenerativa, la modellazione di malattia e di studi ingegneria del tessuto2.

ESC sono stati derivati per la prima volta da embrioni di topo preimpianto, originari del mouse ESC (mESC) linee con successo basso3,4. Per anni, l'efficienza di derivazione è rimasta bassa a causa della difficoltà di mantenere la pluripotenza in vitro. Inoltre la presenza di alimentatore cellule5, che migliorano l'efficienza di derivazione, promuovere allegato di Colonia e migliorare stabilità karyotypic6, diverse modifiche del protocollo piombo ad un miglioramento nella manutenzione di pluripotenza. Le più importanti furono l'aggiunta di fattore inibitorio di leucemia (LIF) a mESC coltura7,8, l'uso di embrioni dal 129S2 sfondo permissiva9 e la cultura della mescita con supplementato con definita siero, privo di potenziali fattori di differenziazione10. Più recentemente, una prova convincente ha dimostrato che l'aggiunta di un cocktail di due piccole molecole modulatori delle vie di segnalazione al terreno di coltura mESC (noto come 2i) non consiglia di mantenere la pluripotenza. La 2i cocktail è costituito da una combinazione dell'inibitore MEK PD0325901, che riduce i segnali di differenziazione inibendo la chinasi di proteina mitogene-attivata (MAPK), e l'inibitore di GSK3β CHIR99021, che migliora la sopravvivenza delle cellule a bassa densità attivando la via di Wnt11.

Nel presente articolo, descriviamo un semplice protocollo per derivare in modo efficiente mESC linee da blastocisti di topo. Seguiamo le procedure standard, la coltura di embrioni da ceppi permissive su cellule di alimentatore in medium di derivazione completate con LIF e un siero sostituzione12. Seguendo questo protocollo, mESC linee può essere derivato con efficienze equivalenti a quelli ottenuti in mezzo 2i. Nonostante ciò, 2i possono essere aggiunti per evitare possibili problemi con pluripotenza manutenzione o quando si lavora con ceppi non permissivi.

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Protocollo

l'uso degli animali descritti nelle sezioni riportate di seguito è stato approvato dal comitato di etica animale e umana ricerca della Universitat Autònoma de Barcelona e dalla Departament d' ' Agricultura, Ramaderia, Pesca ho Alimentació della Generalitat de Catalunya (protocollo #8741).

1. inattivazione delle cellule feeder e deposito

Nota: fibroblasti umani del prepuzio (HFF-1) precedentemente sono stati congelati in 1 mL di soluzione di congelamento composto da 90% siero bovino fetale (FBS) e 10% dimetil solfossido ( DMSO) e conservati in azoto liquido fino uso.

  1. Scongelare una fiala criogenica di HFF-1 (1 mL) immergendo il flaconcino in bagnomaria a 37 ° C.
  2. Aggiungere lo scongelati contenuto del flaconcino criogenico a Dulbecco pre-riscaldato ' s Modified Eagle ' s Medium (DMEM) completati con 10% FBS per rendere un 01:10 diluizione.
  3. Le cellule diluite (10 mL) di semi in una boccetta di T75 e loro coltura a 37 ° C e 5% CO 2.
  4. Il giorno successivo, cambiare il mezzo per eliminare i resti di DMSO. Rimuovere il mezzo e aggiungere 10 mL di pre-riscaldato DMEM supplementato con 10% FBS.
  5. Cultura il HFFs e cambiare il mezzo ogni 48 h fino a quando la cultura raggiunge la fase confluente. L'operazione potrebbe richiedere circa 7-10 gg.
  6. Per preparare la soluzione di inattivazione, diluire mitomicina C in DMEM supplementato con 10% FBS ad una concentrazione finale di 10 µ g/mL. Incubare le cellule con la soluzione di inattivazione per 3 h a 37 ° C e 5% CO 2.
  7. Rimuovere la soluzione di inattivazione e sciacquare le cellule tre volte con 2 mL di Hanks bilanciato sale soluzione (HBSS) per eliminare i resti di mitomycin C.
  8. Per staccare le cellule inattivate, aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina-EDTA pre-riscaldato e incubare per 5 min a 37 ° C e 5% CO 2.
  9. Osservare le cellule al microscopio invertito per assicurare sono scollegati (obiettivo 10x con 0,3 apertura numerica o NA). Se non lo sono, li Incubare per un paio di minuti a 37 ° C e 5% CO 2. Controllare le cellule sotto il microscopio invertito.
  10. Pipetta la soluzione con una pipetta Pasteur al fine di dissociare i grumi di cellule.
  11. Neutralizzare la soluzione enzimatica aggiungendo 4 mL di DMEM completati con 10% FBS e risospendere.
  12. Prendere un'aliquota della sospensione cellulare e fare una diluizione 1: 100 in HBSS. Per determinare il numero di celle, è necessario caricare 10 µ l della diluizione in un Neubauer ' camera di s. Contare le celle che si trova in una delle piazze più grandi della camera sotto un microscopio invertito (obiettivo x 20 con un NA 0,45).
    1. Ripetere il conteggio in un totale di quattro grandi piazze. Calcolare il numero totale di cellule (N) n = numero medio di cellule contate x volume totale x diluizione x 10 4.
  13. Centrifugare il resto del campione per 5 min a 200 x g. gettare il surnatante e risospendere il sedimento con congelamento soluzione ad una concentrazione di 10 6 cellule per mL.
  14. Aliquota della sospensione in fiale criogeniche con 10 6 cellule (1 mL) ogni. Posizionare le fiale criogeniche in un contenitore di congelamento e congelare a -80 ° C.
  15. Il giorno successivo, conservare i flaconi criogenici in azoto liquido.

2. Coltura cellulare alimentatore

  1. da uno a quattro giorni prima di iniziare il processo di derivazione, disgelo criogenico flaconcino contenente 1 x 10 6 inattivato HFF-1 cellule in un bagno di acqua a 37 ° C.
  2. Fare una diluizione di 1:6 di HFF-1 scongelati nel pre-riscaldati DMEM completati con 10% FBS e mantenere la temperatura a 37 ° C.
  3. Riempire ogni pozzetto di una piastra a 4 pozzetti con 500 µ l di pre-riscaldato 0,2% gelatina da pelle porcina e tenere la piastra a 37 ° C per 10 min.
  4. Rimuovere i 500 µ l di gelatina dai pozzetti e aggiungere 500 µ l della diluizione HFFs. Scuotere delicatamente la piastra per assicurare una distribuzione uniforme del HFFs sul fondo dei pozzetti. Evitare movimenti circolari, in caso contrario si concentreranno le cellule al centro del pozzo.
  5. Incubare la piastra almeno 24 ore a 37 ° C e 5% di CO 2 per ottenere un monostrato di HFFs inattivato in ciascun pozzetto.
  6. Il giorno successivo, osservare le cellule al microscopio invertito (obiettivo 10x con NA 0,3) e verifica che siano collegati e distribuiti in modo omogeneo. Modificare il mezzo per eliminare i resti di DMSO. Rimuovere il mezzo e aggiungere 500 µ l di pre-riscaldato DMEM supplementato con 10% FBS.

3. Raccolta degli embrioni e cultura

  1. quattro giorni prima della raccolta degli embrioni, amministrare 5 IU della cavalla incinta ' gonadotropina del siero di s tramite l'iniezione intraperitoneale di topi femmina 6-12 settimane vecchio.
    Nota: Abbiamo usato le femmine da 129S2 o B6CFAF1 ceppi, anche se le femmine da altri ceppi del mouse possono essere utilizzate. Tuttavia, quando mezzo di lavoro con le femmine da ceppi non permissivi (ad es. CBA), dovrebbe essere completato con 2i come indicato al punto 4.2.
  2. Dopo 48 h, amministrare 5 UI di gonadotropina corionica umana tramite l'iniezione intraperitoneale e accoppiare le femmine con i maschi, almeno 8 settimane di vita, con un rapporto 1:1. Separare le femmine dai maschi il giorno successivo.
  3. Il giorno prima della raccolta degli embrioni, preparare una coltura cellulare di 35 mm di Petri con alcune gocce di 40 µ l di KSOMaag supplementato con 4 mg/mL albumina di siero bovino (BSA) e riempire il piatto con olio minerale per coprire completamente le gocce. Incubare la piastra a 37 ° C e 5% di CO 2 per equilibrare il medium.
  4. Per preparare pipette di manipolazione dell'embrione, scaldate la parte più sottile di un vetro con punta lunga pipetta Pasteur utilizzando un bruciatore di Bunsen. Una volta morbido, ritirarlo dal fuoco e separare le due estremità. Romperlo fino alla lunghezza desiderata. Il diametro interno alla punta dovrebbe essere 100-150 µm.
  5. Eutanasia i topi femminili di dislocazione cervicale 45-48 h coitum dell'alberino (p.c.).
  6. Sezionare i topi per esporre la cavità addominale tagliando la pelle con forbici affilate lisce curve ed il peritoneum con forbici affilate dritto. Afferrare un utero con una pinza, tagliare l'ovidotto utilizzando delle forbici affilate dritto e inserirlo nella tamponata Hepes CZB medio (HCZB) 13 a 37 ° C. Ripetere la procedura per rimuovere altri ovidotto.
  7. Flush ovidotti con una siringa da 1 mL caricati con HCZB tenuto da forcipe orologiaio per raccogliere gli embrioni 2-cell.
    Nota: Per preparare il lavaggio dell'ago prendere un ago ipodermico 30g, tagliare l'estremità e a terra su una punta smussata su una pietra abrasiva.
  8. Utilizzando l'apparato di pipetta di bocca, prendere gli embrioni, lavarli in HCZB e loro cultura nella piastra di coltura degli embrioni precedentemente preparato a 37 ° C e 5% CO 2 fino allo stadio di blastocisti. Fino a 50 embrioni possono essere coltivati in ogni goccia di 40 µ l. Monitorare lo sviluppo dell'embrione ogni 24 h sotto uno stereomicroscopio.
    Nota: In alternativa, gli embrioni possono essere raccolti allo stadio di blastocisti per abbreviare in vitro coltura embrionale. In questo caso, eutanasia le femmine al giorno p.c. 3,5-4,5, sezionare l'utero. e lavare con HCZB.

4. Derivazione di cellule staminali

  1. preparazione delle piastre derivazione
    1. il giorno di embrione semina, preparare il supporto di derivazione arricchendo terreno DMEM con 100 µM 2-β mercaptoetanolo, 1 x gli aminoacidi Non essenziali , 20% di siero sostituzione e 10 3 U/mL LIF.
    2. Se lo si desidera, aggiungere anche 1 µM dell'inibitore MEK PD0325901 e 3 µM dell'inibitore GSK3 CHIR99021 per ottenere un mezzo di 2i.
    3. Prendere la piastra a 4 pozzetti con il monostrato di HFFs inattivato (punto 2.6) dalla incubatrice. Rimuovere il mezzo e aggiungere 800 µ l di terreno di derivazione pre-riscaldato a ciascun pozzetto. Riporre la piastra nell'incubatore.
  2. Pellucide rimozione ed embrione semina
    1. preparare una coltura cellulare 35mm Petri con gocce tre 30 µ l di acido Tyrode ' s soluzione 14 e tre 30 µ l gocce di mezzo di derivazione. Coprire le gocce con olio minerale e mantenere il piatto a 37 ° C.
    2. Prendere la piastra di coltura dell'embrione dall'incubatrice. Uno per uno, trasferire le blastocisti dalle gocce di cultura a un'acida Tyrode ' goccia di soluzione di s usando una pipetta di manipolazione dell'embrione. Se possibile, selezionare solo le blastocisti espanse per avviare il processo di derivazione.
    3. Monitor la zona pellucida Digestione sotto lo stereomicroscopio. Appena scompare la zona pellucida, trasferire le blastocisti ad un calo medio di derivazione per lavare fuori il Tyrode acide ' soluzione di s.
    4. Prendere la piastra 4 pozzetti derivazione da incubatrice e seme uno privi di zona blastocisti nell'alimentatore di cellule in ciascun pozzetto.
    5. Ritorno la piastra 4 pozzetti derivazione in incubatrice e coltura a 37 ° C e 5% CO 2.
  3. Modificare la crescita delle cellule staminali di monitoraggio e medie
    1. monitorare le culture ogni 24 h sotto un microscopio invertito (obiettivo X 20 con 0,45 NA). È importante notare se ci sono segni di differenziazione delle cellule staminali, quali le cellule refrattiva gonfiate che circondano l'escrescenza o anche spingendo l'alimentatore cellule da parte.
    2. Ogni altro giorno, cambiare il mezzo della cultura. Prendere la piastra a 4 pozzetti dall'incubatrice, rimuovere il mezzo da ogni pozzetto e aggiungere 800 µ l di terreno di derivazione pre-riscaldato completato con LIF e 2i, se utilizzato. Mantenere la cultura fino a escrescenze sono osservati (6-8 giorni).

5. Coltura della cellula formativa e manutenzione

  1. preparare Kolle-come maniglie e pipette di manipolazione di cellule staminali. Seguire il passo 3.4 preparare pipette di manipolazione di cellule staminali con un diametro interno sulla punta di 250-300 µm. utilizzare l'altra parte della pipetta Pasteur tirata per preparare la maniglia Kolle-come. Calore e modellarlo fino ad ottenere un hook.
  2. Prendere la piastra di coltura 4 pozzetti fuori l'incubatrice e individuare l'escrescenza sotto un microscopio stereoscopico. Utilizzare il quadratino per spingere via le cellule differenziate e gli alimentatori che circondano l'escrescenza.
    Nota: Per evitare eventuale differenziazione della conseguenza, è importante rimuovere tutte le cellule differenziate dal bordo dell'escrescenza.
  3. Aspirare l'escrescenza con una pipetta di manipolazione di cellule staminali e posizionarlo in un nuovo piatto in una goccia di tripsina-EDTA 50 µ l.
  4. Utilizzare un bisturi per tagliare la conseguenza in più parti al fine di disaggregare esso sia meccanicamente che enzimaticamente.
  5. Subito, trasferire i frammenti di conseguenza in una fresca goccia di mezzo di derivazione per neutralizzare l'azione della tripsina.
  6. Trasferire i frammenti di conseguenza una nuova piastra a 4 pozzetti con un monostrato di alimentatori. Trasferimento fino a 10 frammenti per pozzetto e cultura li con il mezzo di derivazione a 37 ° C e 5% CO 2.
  7. Mantenere le colture delle cellule staminali per almeno sei settimane prima di considerare la linea mESC stabilita. Modificare il mezzo ogni altro giorno e sottocultura li una volta a settimana.

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Risultati

A seguito di questo protocollo, oltre il 95% della formazione di conseguenza dovrebbe avvenire dopo la prima settimana della cultura (Figura 1A). Creazione di linee di mESC dopo sei passaggi è variabile tra repliche sperimentali, con una media di successo del 60-80%. L'aggiunta di 2i non migliora significativamente i risultati quando si lavora con diversi ceppi di topi permissiva, come quelli con un background di 129S2, ma è necessario quando si lavora con ce...

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Discussione

Anche se mESC linea derivazione è una procedura ben nota ordinariamente utilizzata in molti laboratori, sua efficienza non è sempre più in alto come previsto a causa di molteplici fattori che possono disturbare la pluripotenza manutenzione. Nel presente articolo abbiamo illustrato, passo dopo passo, come stabilire linee mESC con alta efficienza utilizzando un protocollo semplice e affidabile. Queste efficienze sono simili a quelli segnalati nella letteratura.

Per garantire la massima efficienz...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo Jonatan Lucas per la sua assistenza tecnica con coltura cellulare alimentatore, Servei Estabulari de la UAB per cura degli animali e Domènec Martín per la registrazione del video. Questo lavoro è stato supportato dal Ministerio de Economia y Competitividad AGL2014-52408-R e Generalitat de Catalunya 2014 SGR-524. MVC è beneficiario di una borsa di studio di PIF-UAB.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1 ml di sryringeBD 
2-β-mercaptoetanoloLife Technologies31350-010
Piastra a 4 pozzettiThermo Scientific Nunc176740
Soluzione acida di Tyrode fattain casa in Nagy et al, 2003. Per la conservazione a breve termine (fino a 1 mese) mantenerla a 4ºC. In alternativa, per la conservazione a lungo termine mantenerla a -20ºC. Se l'efficienza della soluzione diminuisce, dovrebbe essere acidificata con l'aggiunta di una piccola goccia di HCl 1M.
BSASigmaA3311
Pollo anti-Topo IgG, Alexa Fluor 488Sonde Molecolari - InvitrogenA-21200diluizione 1:500. Anticorpo secondario per gli anticorpi di topo Oct4, Tuj1, αSMA e AFP.
CHIR990212Axon Medchem 1386Ricostituire con 2,15 ml di DMSO per ogni mg di polvere, per ottenere una soluzione madre da 1 mM. Aliquotare al volume desiderato e conservare a -20ºC. Evitare cicli di gelo e disgelo.
CryoTubeThermo Scientific Nunc 3754518
DMSOSigma41640
DMEMBioWestL0107
FBSBioWestS1810Inattivarlo prima dell'uso riscaldandolo per 30 minuti a 56ºC. Aliquotare e conservare a -20º C
Ago di lavaggioBD 304000Tagliare l'estremità dell'ago e macinare fino a ottenere una punta smussata su una pietra abrasiva
Gelatina di pelle suinaFluka48724Diluire allo 0,2% in acqua distillata e sterilizzare in autoclave. Ogni diluizione può essere utilizzata per un mese.
IgG anti-coniglio di capra, sonde molecolari Alexa Fluor 594- InvitrogenA-11037diluizione 1:500. Anticorpo secondario per l'anticorpo di coniglio Sox2.
HBSSBioWestL0611
CZB  tamponato con Hepes;Fatto inVedi composizione in Chatot et al, 1989
Gonadotropina corionica umanaDivasa-FarmavicVeterin-Corion 3000 UIDiluire in NaCl 0,9% a 50 UI/ml. Aliquotarlo in 1 ml e conservare a -20º C per un massimo di due mesi. Una volta scongelato, non congelare di nuovo.
Fibroblasti del prepuzio umanoATCCATCCSCRC-1041Per la conservazione a lungo termine si consiglia di conservarli in azoto liquido.
Tecnologie per la vita di sostituzione del siero knockout  10828-028Fotosensibile. Si consiglia di aliquotarlo in piccoli volumi come 10 ml e conservarlo a -20º C (controllare la data di scadenza). Evitare cicli di gelo e disgelo.    
KSOMaag EvolveZenith BiotechZEKS-050Integratore con 4 mg/ml di BSA. Equilibrare a 37º C e 5% di CO2 un giorno prima dell'uso.
Fattore inibitorio della leucemiaMerk MilliporeESG1106
TopiCharles River/HarlanSi consiglia di utilizzare topi di un ceppo permissivo in termini di derivazione mESC (come 129S2 o C57BL). Tuttavia, i ceppi di consanguineità sono meno efficienti nella produzione di embrioni. Pertanto, si consiglia di utilizzare un ceppo ibrido, come 129S2 x C57BL o B6CBAF1 per sfruttare il vigore dell'ibrido.
Olio mineraleSigmaM8410Embrione testato. Fotosensibile.
Mitomicina CServa2980501Ricostituire la polvere con acqua MilliQ a 0,5 mg/ml. Conservare a 4º C protetto dalla luce. Attenzione, è dannoso e sospettato di causare il cancro.
Mouse anti-tubulina &; III (Tuj1)BiolegendMMS-435P1:500 diluizione
Monoclonale di Topo anti-&alfa;SMASigmaA5228Diluizione 1:200
Monoclonale di Topo anti-AFPR& D SystemsMAB1368diluizione 1:50
Topo monoclonale anti Oct3/4 Santa cruzSc-5279diluizione 1:50
Aminoacidi non essenziali LifeTechnologies11140-035
PD0325901Axon Medchem 1408Ricostituire con 2,08 ml di DMSO per ogni mg di polvere, per ottenere una soluzione madre da 1 mM. Aliquotare al volume desiderato e conservare a -20ºC. Evitare cicli di gelo e disgelo.
Piastra di Petri (35mm)Thermo Scientific Nunc153066
Piastra di Petri (60mm)Thermo Scientific Nunc150288
Siero di cavalla gravida gonadotropinaFoligonFoligon-1000 UIDiluire in NaCl 0,9% a 50 UI/ml. Aliquotare in 1 ml e conservare a -20º C per un massimo di due mesi. Una volta scongelato, non congelare di nuovo.
Coniglio policlonale anti-Sox2Merck MilliporeAB5603diluizione 1:200
T75 falcoThermo Scientific130190
Tripsina-EDTA 10xBioWestX0930Diluire 1:10 in HBSS per ottenere una soluzione 1x
309628Vedi ricetta casa

Riferimenti

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