Procedura di preparazione per la misura della reattività in Mouse arteriole retiniche Ex Vivo

Sommario

Molte malattie oculare visione-minacciose sono associata con disfunzionali microvasi retinici. Pertanto, la misura delle risposte arteriola retinica è importante approfondire i meccanismi fisiopatologici sottostanti. Questo articolo descrive un protocollo dettagliato per mouse arteriola retinica isolamento e la preparazione per valutare gli effetti di sostanze vasoattive il diametro vascolare.

Abstract

Insufficienza vascolare e alterazioni nel normale perfusione retinica sono tra i fattori più importanti per la patogenesi di varie malattie oculari avvistare-minaccioso, quali retinopatia diabetica, retinopatia ipertensiva ed eventualmente il glaucoma. Di conseguenza, retiniche microvascolari preparazioni sono strumenti cardine per studi fisiologici e farmacologici delineare i meccanismi fisiopatologici sottostanti e di progettazione terapie per le malattie. Nonostante l'ampio uso di modelli murini in Ricerca oftalmica, gli studi sulla reattività vascolare retinica sono scarsi in questa specie. Delle ragioni principali per questa discrepanza è le procedure di isolamento impegnativo a causa le piccole dimensioni di questi vasi sanguigni della retina, che è ~ ≤ 30 µm di diametro luminal. Per aggirare il problema di isolamento diretto di questi microvasi retinici per studi funzionali, abbiamo stabilito una tecnica di isolamento e la preparazione che permette studi ex vivo di vasoattività retinica del mouse in condizioni di quasi-fisiologiche . Anche se i preparati sperimentali presenti in particolare farà riferimento alle arteriole retiniche del mouse, questa metodologia prontamente può essere impiegata per microvasi dai ratti.

Introduzione

Disturbi della perfusione retinica sono stati implicati nella patogenesi di varie malattie oculari, quali la retinopatia diabetica, retinopatia ipertensiva e glaucoma^1,2,3. Così, gli studi volti a misurare la reattività vascolare della retina sono importanti per comprendere la fisiopatologia di queste malattie e per sviluppare il nuovo trattamento si avvicina.

Grazie alla possibilità di manipolazione del gene nel genoma murino, il mouse è diventato un modello animale ampiamente usato per gli studi del sistema cardiovascolare⁴. Tuttavia, a causa delle piccole dimensioni dei vasi sanguigni retinici (≤ 30 µm), misura della reattività vascolare nella retina di topo è complessa. Ad esempio, stereomicroscopia tecniche per la misurazione in vivo sono limitati nella loro risoluzione ottica e quindi solo consentono di rilevare esattamente i cambiamenti nel flusso di diametro o di sangue nel sangue piccolo inferiore a ≤ 30 µm di diametro quando equipaggiato con sofisticati dispositivi aggiuntivi, come un microscopio confocale utilizzando coloranti fluorescenti o l'ottica adattiva che scansione oftalmoscopio luce^5,6. Inoltre, l'interpretazione di in vivo misure volte ad individuare locali segnalazione meccanismi in vasi sanguigni retinici possono essere confuse di anestetici, cambiamenti nella pressione arteriosa sistemica e l'influenza dei vasi sanguigni retrobulbar.

Di conseguenza, abbiamo sviluppato un metodo per misurare le risposte dei vasi sanguigni retinici del mouse con alta risoluzione ottica ex vivo. La tecnica qui presentata permette la visualizzazione delle arteriole retiniche tramite trasmissione microscopia chiara. Questo metodo, che può essere utilizzato anche in ratti, fornisce l'accesso ai vantaggi del gene targeting tecnologia nella ricerca vascolare oculare.

Protocollo

Le procedure sperimentali di questo studio sono state approvate da animale cura Comitato della Renania-Palatinato, Germania. Cura degli animali e conforme alle linee guida istituzionali e l'associazione ricerca in visione e Oftalmologia (ARVO) istruzione per l'uso di animali in oftalmica o visione. Gli animali sono stati trattati secondo la direttiva europea 2010/63/UE per gli esperimenti sugli animali. Per gli esperimenti sono stati utilizzati topi C57BL/6J maschii (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, Stati Uniti d'America) di età compresa tra 3-4 mesi. Gli animali sono stati alloggiati in condizioni standard (temperatura 23 ± 2 ° C, umidità gamma 55 ± 10% e 12 h cicli di luce/buio) e ha avuto accesso al mouse standard chow e acqua ad libitum.

1. isolamento di Retina di topo

1. Collocare gli strumenti di dissezione sul piano di preparazione e verifica se tutti gli strumenti sono completi per consentire una rapida preparazione.
2. Sacrificare il mouse da inalazione di CO₂ .
3. Decapitare il mouse con le forbici in acciaio, tagliate il sagitally del cranio in due metà usando lo stesso paio di forbici e rimuovere la pelle e il cervello con le forbici dell'occhio (Figura 1).
4. Tagliare l'osso del cranio di lasciare solo l'osso orbitale utilizzando forbici occhio.
5. Trasferire l'orbita in un piatto di dissezione contenente tampone Krebs-Henseleit ghiacciata.
6. Mantenere il piatto di dissezione su ghiaccio o modificare il buffer ogni 10 min.
7. Tagliare l'osso orbitale usando le forbici occhio e rimuovere delicatamente il globo oculare insieme il tessuto orbitale usando tipo 4 precisione pinzette e forbici di primavera studente Allerød (Figura 2).
8. Rimuovere delicatamente la ghiandola di Harder, tessuto connettivo e muscoli extraocular utilizzando pinzette di precisione 5 tipo e Allerød capsulotomy forbici, facendo attenzione a non per danneggiare il ramo principale dell'arteria oftalmica.
9. Lega i orbitale rami dell'arteria oftalmica e, infine, l'estremità prossimale del ramo principale dell'arteria oftalmica usando i suturare di Nylon 10-0 (Figura 3).
10. Trasferire il globo oculare in una capsula di Petri contenente etanolo al 70% per 10 s con tipo 4 pinzette di precisione. Inserire nuovamente il globo oculare il piatto di dissezione e sostituire il buffer con soluzione di Krebs fresca. La cornea appare biancastra dopo esposizione all'etanolo.
11. La cornea periferica di puntura con un ago da 30 gauge e sezionare la cornea utilizzando forbici capsulotomy Allerød. Delicatamente tagliare il tessuto dell'iride, posizionare un punto tagliente delle forbici capsulotomy Allerød tra la coroide e della retina e tagliare la coroide e sclera. Lasciare qualche tessuto sclerale intorno al nervo ottico (Figura 4).

2. montaggio della Retina nella camera di perfusione

Nota: La camera di aspersione utilizzata per esperimenti di arteriola retinica è fatta in casa. Si compone di un serbatoio trasparente con un tubo di ingresso e di uscita (Figura 5). Un'estremità di un tubo di silicone è incollata alla parte inferiore dell'alloggiamento con histoacryl adesivo e l'altra estremità collegata ad un rubinetto a tre vie. Collegare una siringa contenente tampone di Krebs fresca al rubinetto a tre vie e riempire il tubo con il tampone.

1. Prendere una micropipetta di vetro con un porta-aghi e spingere l'estremità del tubo nella parte inferiore della camera di aspersione. Poi rompere la punta della micropipetta con forbici tipo 4 per ottenere una punta di 100 µm di diametro.
2. Concentrarsi sulla punta della micropipetta e buttare via la siringa collegata al tubo. Fare attenzione che il capillare non è occluso da detriti. In caso di occlusione, rimuoverlo, svuotare il tubo e inserire un'altra micropipetta.
3. Riempire la camera di aspersione con tampone Krebs refrigerato e mettere la vaschetta sotto un microscopio stereo.
4. Posto una piattaforma di plastica trasparente nella camera di aspersione. Questa piattaforma ha un rientro di 1,8 mm di larghezza per il nervo ottico e l'arteria oftalmica e posti su due fili di acciaio di diametro 1,6 mm. Quindi, inserire un anello di acciaio di diametro interno 2,8 mm e 4,0 mm di diametro esterno sulla piattaforma.
5. Trasferire la retina con il nervo ottico e dell'arteria oftalmica allegata dalla camera di dissezione nella camera di aspersione con estrema cura, utilizzando un cucchiaio. Questo passaggio è importante per prevenire potenziali stiramento dei tessuti in quanto può essere dannoso per l'esperimento.
6. Tagliare la parte suturata dell'estremità prossimale dell'arteria oftalmica, posizionare due anelli preformati di sutura in nylon 10-0 sulla micropipetta e incannulare l'arteria oftalmica con la micropipetta. Legare l'arteria per la micropipetta (Figura 6) e posizionare la retina sulla piattaforma trasparente con belle-punto-pinzette.
7. Delicatamente strappare aperto il capsula lenticolare anteriore con due pinzette a punta fine, tirare fuori la lente e tagliare il capsula intera lente utilizzando microforbici.
8. Successivamente, fare quattro incisioni radiali nella retina metà della distanza dalla pars plana al nervo ottico e posizionare un anello di acciaio sulla retina per risolvere il problema di fondo. La retina è ora pronta per l'esperimento (Figura 7).

3. preparazione delle arteriole retiniche per l'esperimento

1. Posizionare la camera di aspersione sotto un microscopio chiaro. L'obiettivo è una lente di obiettivo di immersione in acqua X 100.
2. Collegare i due tubi per in - e out - flow a una pompa periciclica e circolare della camera con tampone Krebs ossigenata con 95% O₂ e gassata con 5% CO₂ a 37 ° C. Utilizzare una velocità di flusso tra 100 e 120 mL/min.
3. Collegare il tubo di silicone, che è collegato alla micropipetta, di un serbatoio in silicone tubo tramite un rubinetto a tre vie. Poi, riempire il serbatoio con buffer di Krebs per un'altezza corrispondente a 50 mm Hg, ma non ancora aprire il rubinetto a tre vie.
4. Guardare attraverso gli obiettivi del microscopio e concentrarsi sulla superficie della retina. Ricerca di vasi sanguigni o globuli rossi. È possibile che i vasi sanguigni sono completamente crollati, a volte solo che alcuni globuli rossi sono visibili.
5. Quando viene trovato un vaso sanguigno, concentrarsi su di esso e aprire il rubinetto a tre vie. Il diametro del vaso dovrebbe aumentare immediatamente e i globuli rossi si sposteranno mediante centrifugazione, se si tratta di un'arteriola, o centripeto in caso di una venula. Le arteriole sono più piccole di diametro rispetto alle venule dello stesso ordine.
6. Una volta trovato un vaso sanguigno con una parete ben visibile, può essere impiegato per esperimenti dopo un periodo di equilibrazione di 30 min (Figura 8). Durante il periodo di equilibrazione, le arteriole sviluppano solo debole tono intrinseco con conseguente meno il 10% di riduzione di diametro luminal.

4. esecuzione dell'esperimento

1. Testare la redditività delle navi con il trombossano mimetico 9,11-dideoxy-9α, 11α-methanoepoxy della prostaglandina F_2α (U46619) aggiungendo la soluzione del bagno. Questo agente constricts arteriole retiniche del mouse circa il 50% dal diametro di riposo alle concentrazioni di ≥ 10^-6 M.
2. Una volta che la nave è confermata praticabile, lavare l'agonista dal bagno, la pompa di circolazione e fornire fresco Krebs buffer nel bagno.

Risultati

U-46619 prodotto risposte vasocostrittori di concentrazione-dipendente in arteriole retiniche da topi wild-type dello sfondo C57Bl/6J. Ad una concentrazione di 10^-6 M, riduzione del diametro luminal era ≈50% dal diametro di riposo. Figura 9A Mostra una curva di concentrazione-risposta rappresentativo di un'arteriola retinica. In arteriole preconstricted con U46619, amministrazione cumulativo di acetilcolina evocato aumenti di concentrazione-dipende...

Discussione

La misurazione delle risposte vascolari nella retina di topo è impegnativo a causa delle piccole dimensioni dei vasi sanguigni retinici. Con la tecnica presentata, arteriole retiniche sono visualizzate da microscopia chiara trasmessa. Questo è possibile, perché la retina isolata è traslucida. Il vantaggio della tecnica è l'alta risoluzione ottica. La risoluzione spaziale calcolata è 11 px/µm. Tuttavia, la risoluzione reale per questo sistema ottico che utilizza la luce bianca è fra 200 e 300 nm, che si spiega con il limi...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Forbici in acciaio	Carl Roth GmbH	3576.1	1x 140 mm
Forbici per occhi	Geuder	G-19390	1x dritta, 10,5 cm
Pinzetta di precisione, dritta con punte fini	Carl Roth GmbH	LH68.1	2x tipo 4
Pinzette di precisione, dritte con punte extra fini	Carl Roth GmbH	LH53.1	2x tipo 5
Forbici	per capsulotomia VannasGeuder	19760	1x dritto, 77 mm
Studente Vannas Forbici a molla	Fine Science Tools	91501-09	1x curvo,
Barraquer Porta ago	Geuder	G-17500	1x curvo, 120 mm
Ago	Becton, Dickinson and Company	305128	1x 30 G
Capillari in vetro (per la produzione di micropipette)	Drummond Scientific Company	9-000-1211	1x (1,2 x 0,8 mm; diametro esterno/interno)
Sutura in nylon	Alcon	198001	1x 10-0
Piatto per coltura cellulare Nunclon	Thermo Fisher Scientific 153066		1x 35 mm di diametro
Nunclon piatto per coltura cellulare	Thermo Fisher Scientific 172931		1x 100 mm di diametro
Discofix C	Braun	16500C	10 cm
Histoacryl adesivo	B. Braun Surgical, S.A.	1050052
Name	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Equipment
Pompa periciclica  (CICLO II)	Carl Roth GmbH	EP76.1	1x
estrattore per pipette verticale modello 700C	David Kopf Instruments		1x
microscopio (Vanox-T AH-2)	Olympus		1x
obiettivo ad immersione in acqua LUMPlanFL, 1.0 NA	Olympus		1x
fotocamera digitale (TK-C1381)	JVC		1x
camera di perfusione	autocostruita		1x
Name	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Farmaci e soluzioni
Ethanol	Carl Roth GmbH	K928.4
Cloruro di calcio diidrato (CaCl2)	Carl Roth GmbH	5239.1
Cloruro di Kalium (KCl)	Carl Roth GmbH	6781.1
Diidrogeno fosfato di Kalium (KH2PO4)	Carl Roth GmbH	3904.2
Solfato di magnesio (MgSO4)	Carl Roth GmbH	261.2
Cloruro di sodio (NaCl)	Carl Roth GmbH	9265.2
Carbonato acido di sodio (NaHCO3)	Carl Roth GmbH	0965.3
α-(D)-(+)- Glucosio monoidrato	Carl Roth GmbH	6780.1
9,11-dideossi-9α,11α-metanoepoxy prostaglandina F2α (U-46619)	Cayman Chemical	16450
Cloruro di acetilcolina	Sigma-Aldrich	A6625-25G