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Articolo metodologico

Laser Microirradiation per lo Studio In Vivo delle risposte cellulari al danno al DNA semplici e complesse

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DOI:

10.3791/56213

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31 gennaio 2018

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1Department of Biological Chemistry, School of Medicine, University of California, Irvine, 2Beckman Laser Institute and Medical Clinic, University of California, Irvine, 3Department of Developmental and Cell Biology, School of Biological Sciences, University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering and Surgery, University of California, Irvine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

L'obiettivo del presente protocollo è quello di descrivere come utilizzare laser microirradiation per indurre diversi tipi di danno del DNA, compreso le rotture del filo relativamente semplici e danno complesso, per studiare assieme di fattore DNA danni segnalazione e riparazione presso siti di danno in vivo .

Abstract

Danno al DNA induce risposte specifiche di segnalazione e riparazione nella cella, che è fondamentale per la protezione dell'integrità del genoma. Laser microirradiation è diventato un prezioso strumento sperimentale per studiare il DNA danni risposta (DDR) in vivo. Permette analisi unicellulare ad alta risoluzione in tempo reale delle dinamiche macromolecolari in risposta al danno indotto da laser relegato a una regione submicrometrici nel nucleo della cellula. Tuttavia, varie condizioni di laser sono state utilizzate senza apprezzamento delle differenze nei tipi di danno indotto. Di conseguenza, la natura del danno spesso non è ben caratterizzato o controllata, causando evidenti incoerenze nei profili di reclutamento o modifica. Abbiamo dimostrato che condizioni di irradiazione diversi (cioè, diverse lunghezze d'onda come pure diverse potenze di ingresso (irradiances) di un laser a femtosecondi (fs) vicino infrarosso (NIR)) ha indotto gli assembly distinti di proteina DDR e riparazione. Ciò riflette il tipo di danno del DNA prodotto. Questo protocollo descrive come titolazione input di potere del laser permette di induzione di diverse quantità e complessità del danno al DNA, che può essere facilmente monitorato tramite rilevazione di danni base e reticolazione, differenziale poly (ADP-ribosio) (PAR) di segnalazione, e riparazione di percorso specifico assembly fattore presso siti di danno. Una volta che le condizioni di danno sono determinate, è possibile studiare gli effetti di danno differenti complessità e segnalazione differenziali danni nonché deplezione di fattori a Monte su qualsiasi fattore di interesse.

Introduzione

In Vivo Segnalazione di danni del DNA non è ben compreso
In vivo, il DNA è complessato con istoni ed altri fattori a fibre di cromatina forma. Regolamento della struttura della cromatina è di fondamentale importanza per il metabolismo del DNA. Ad esempio, la variante dell'istone H2AX viene fosforilata da atassia-teleangectasia mutato (ATM) e altre chinasi seguente doppio-filo si rompe ad induzione (DSB) ed è importante per amplificazione del segnale DSB danni, nonché a fornire un sito di aggancio per altro fattori. Diffusione della scelta di pathway di segnalazione e riparazione danni sembrano essere criticamente influenzati dalla struttura della cromatina locale a danni siti1. Una serie di fattori, istone chaperoni e modificando gli enzimi istone di rimodellamento della cromatina sono infatti reclutato per danneggiare siti e sono importante per la riparazione del DNA efficiente, evidenziando l'importanza della regolazione della cromatina nella DDR e riparazione2 , 3 , 4. Inoltre, sito danno clustering o il riposizionamento è stato osservato in lievito e drosofila5,6,7,8, ricordano la rilocalizzazione di loci genici nella subnucleare vano associato gene regolamento9,10. Recenti studi nel topo e cellule umane anche rivelato mobilitazione dei siti DSB, quali influenze ripristino fedeltà e via scelta11,12. Ciò solleva la possibilità che DDR/riparazione può anche essere intimamente legato al architettura nucleare, l'organizzazione di ordine superiore della cromatina e cromosoma dynamics nel nucleo della cellula. Quindi, è fondamentale per sviluppare metodi ad alta risoluzione per studiare DDR e processi nel contesto dell'ambiente endogeno nucleare in una cellula viva di riparazione al fine di comprendere le conseguenze a breve e a lungo termine di danno del DNA.

Ruolo critico di PAR polimerasi (PARP) nel valutare l'entità e il tipo di danno e regolamentare proteina Assemblea presso il sito di danni
PARP1 è un sensore di nick DNA rapidamente attivato da danno del DNA che svolge un ruolo critico nel DNA riparazione13. PARP1 è stato originariamente pensato per funzionare insieme con raggi x riparare Cross completando 1 (XRCC1) per facilitare la riparazione bassa di asportazione (BER), ma gli studi recenti rivelano il suo ruolo in altre vie di riparazione del DNA, compreso DSB riparazione14. Attivato PARP1 usi nicotinamide adenina dinucleotide (NAD+) da un substrato ad ADP-ribosylate più proteine bersaglio, compreso se stesso. Questo enzima e altri membri della famiglia hanno attirato molta attenzione negli ultimi anni come inibitori PARP sono emersi come promettenti farmaci terapeutici per i tumori. Sebbene gli inibitori PARP inizialmente sono stati trovati per essere efficace nel gene del cancro al seno (BRCA)-mutato di cellule di cancro al seno, ora c'è una pletora di prova per i loro effetti nelle terapie di combinazione e mono - insieme offensivi agenti/irradiazione contro del DNA un ampio spettro di tumori con mutazioni non limitate a BRCA15,16,17,18,19,20.

A livello molecolare, l'attivazione di PARP è stata indicata per giocano un ruolo critico nell'organizzare la struttura locale della cromatina nei siti di danno. Assunzione di PAR-dipendente di enzimi di modificazione della cromatina facilita la riparazione DSB e dettami ripristino scelte di percorso, suggerendo il ruolo importante dell'armatura di PAR modifica presso siti di danno. 13,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31 , recentemente abbiamo dimostrato l'esclusione della p53-binding protein 1 (53BP1) da danni siti di PAR 32, fornendo una spiegazione alternativa per 53BP1-dipendente iperattivazione di endjoining non-omologo ( NHEJ) di PARP inibitore e mettendo in evidenza l'importanza di PARP in DSB riparazione via scelta33,34. PARP1 anche direttamente PARylates e colpisce l'attività del DNA più riparare fattori14.

Usando il Laser Microirradiation come strumento per studiare DDR/riparazione In Vivo
Microirradiation laser per produrre alterazioni di sub-micron sui singoli cromosomi era in primo luogo descritto nel 196935 ed esaminate dettagliatamente nel 198136. Alcuni decenni più tardi, laser microirradiation è stato indicato per indurre il danno del DNA in una regione definita submicrometrici nel nucleo della cellula ed è stato dimostrato di essere una tecnica importante per lo studio di reclutamento o modifiche dei vari fattori per DNA lesioni in vivo 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41. questo metodo permette la rilevazione di quei fattori che non fanno i fuochi indotta per irradiazione distinti (Martina) a danni siti39,42. È anche possibile esaminare la dinamica spazio-temporale dei cambiamenti strutturali della cromatina sia a siti di danno che nel resto del nucleo. Abbiamo confrontato con attenzione il DDR indotto da sistemi laser diversi e poteri per valutare la relazione tra il tipo di danno del DNA e il microirradiation condizioni32,43,44, di input 45. I modelli di reclutamento aberrante di 53BP1 e telomerica ripetere fattore legante 2 (TRF2) sono stati osservati negli studi precedenti danni laser, che ha fornito la base per la ricorrente preoccupazione per la natura "non fisiologica" del danno indotto da laser46 ,47,48,49. Abbiamo trovato che queste apparenti discrepanze ora potrebbero essere spiegate da PARP differenziale che misura la quantità e la complessità del danno indotto32di segnalazione. Abbiamo confermato che: 1) laser-microirradiated cellule (anche dopo irradiazione di potenza di ingresso alta) vengono arrestate in interfase in un modo di controllo-dipendente di checkpoint danni e rimanere vitali (almeno fino a 48 h)32,50; e 2) riparazione fattore reclutamento/modifiche ricapitolare fedelmente quelle osservate con il trattamento con agenti offensivi del DNA convenzionali ed induzione di DSB da endonucleasi32,39,42, 44,50,51,52. Questi risultati sostengono fortemente la rilevanza fisiologica di studiare laser indotta da danno risposte cellulari.

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Protocollo

1. preparazione delle cellule base

Nota: Questo passaggio è per il rilevamento di immunofluorescenza standard del reclutamento di proteina endogena o della modifica e per l'uso di una linea cellulare che esprimono una proteina ricombinante fluorescente contrassegnata. Ad esempio, Potorustridactylus (PtK2) le cellule epiteliali del rene marsupiali che esprimono stabilmente EGFP-53BP11220-1711 o TRF2-YFP sono stati usati nel nostro precedente studiano (Figura 1)32. Nel primo caso, la messa a fuoco che formano la regione di 53BP1 (aminoacido 1220-1711) che contiene il dominio di oligomerizzazione, il dominio Tudor e il motivo di reclutamento ubiquitylation-dipendente (UDR), è stato fuso a GFP avanzata (EGFP-53BP11220-1711). Questa proteina di fusione ricapitola il reclutamento del sito di danni del full-length 53BP153,54,55. In cellule HeLa, fluorescente contrassegnate subunità della coesina (ad es., hSMC1-GFP51, GFP-CP1 (Rad21)52e GFP-SA2 51) deve essere stabilmente espresso per garantire efficiente incorporazione nel complesso e per ricapitolare reclutamento di sito S/G2 ciclo cellulare fase-specifici danni della coesina endogeno51.

  1. Semi di qualsiasi tipo di cellula aderente su un piatto di coltura del tessuto di 35mm con un vetrino coprioggetto quadrettato per consentire per l'identificazione delle singole celle. Regolare il numero iniziale delle cellule per ottenere confluency di 60% in 36-48 h sulla base del tasso di proliferazione della linea cellulare particolare. Per esempio:
    1. Per PtK2 cellule epiteliali di marsupiali del rene (o wild-type o quelli che esprimono stabilmente EGFP-53BP11220-1711 o TRF2-YFP): piastra 2.0 x 104 cellule in 2 mL Advanced minimo essenziale medio (MEM) completati con 2 mM L-Glutammina, 4% fetale bovino siero (FBS) e gli antibiotici (100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina) e incubare a 37 ° C con 7% CO2.
    2. Per HeLa cellule con che esprimono stabilmente fluorescente contrassegnati proteine ricombinanti GFP-SA2: seme 1.0 x 105 celle in 2 mL Medium (DMEM per volta Eagle di Dulbecco) completati con 10% FBS, 2mm L-glutamina, 100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL streptomicina, e incubare a 37 ° C con 5% CO2. Altre cellule HeLa possono anche essere utilizzati inclusi cellule non modificate o cellule che esprimono hSMC1-GFP.
  2. Consentire alle cellule di aderire e proliferare per 36-48 h prima di induzione di danno del DNA alla confluenza di 30-60% (per permettere la visualizzazione del numero di griglia). Procedere alla sezione 4.

2. transitori di transfezione

Nota: A volte buoni anticorpi non sono disponibili per rilevare le proteine endogene. Se non sono disponibili linee cellulari che esprimono stabilmente le proteine marker, eseguire transfezioni transienti per monitorare proteine fluorescente contrassegnati per le analisi di cellule vive.

  1. Per le cellule HeLa, il giorno 1, 6-8 x 104 cellule in 0,5 mL di coltura in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti di semi e incubare in un 100% incubatore a 37 ° C e 5% CO2. Vedere il punto 1.1 per le condizioni di coltura.
  2. Giorno 2, uso un plasmide di espressione mammifera codifica un DNA fluorescente contrassegnato riparare fattore (ad es., GFP-NTH1 o GFP-OGG1 per danno base32,44,56, GFP-Ku per dose elevata DSBs57, GFP-53BP1 32 per DSBs relativamente semplice, o altre proteine di interesse fusa al tag fluorescente) per eseguire liposoma-mediata di transfezione del DNA. Diluire 0,3 µ g plasmide DNA in 25 µ l di terreno di coltura privo di siero in una provetta da 1,5 mL.
  3. In un'altra provetta da 1,5 mL, diluire reagente di transfezione del DNA base di liposomi di µ l 1 in 25 µ l di terreno di coltura privo di siero e mescolare delicatamente.
  4. Mescolare delicatamente l'agente di DNA e transfezione diluito e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente (TA) per formare complessi DNA-lipidico.
  5. Sciacquare una volta cellule con 0,5 mL di coltura, rimuovere il supporto e aggiungere 0,5 mL di coltura fresca per le cellule (come al punto 1.1).
  6. Aggiungere i complessi DNA-lipidica delle cellule. Mescolare delicatamente a dondolo la piastra un paio di volte. Rimettere le cellule in incubatrice come descritto al punto 2.1.
  7. Dopo 4-6 h, rimuovere il terreno di coltura dalle cellule e aggiungere 300 µ l 0.05% tripsina-EDTA. Toglierlo, aggiungere 200 µ l tripsina-EDTA e incubare nell'incubatore 37 ° C per 3-4 min.
  8. Dopo aver confermato che le cellule sono staccate, aggiungere 800 µ l di coltura e risospendere le cellule pipettando delicatamente per spezzare i grumi di cellule. Trasferire la sospensione cellulare a una piastra di coltura di 35mm con un vetrino coprioggetto griglia e aggiungere mezzi di coltura ad un volume finale di 2 mL.
  9. Incubare le cellule nell'incubatrice come descritto al punto 2.1 per 48 h, quindi procedere alla sezione 4.
    Nota: Se l'espressione della proteina ricombinante è tossico (cellule trasfettate mostrano morfologia rotonda o irregolare dopo incubazione nel passaggio 2.8), abbreviare il tempo di espressione ed eseguire laser microirradiation (sezione 4) a 16-20 h dopo trasfezione fintanto che il espressione della proteina può essere confermato (per la rilevazione della fluorescenza, vedi punto 4.3). In questo caso, eseguire transfezione direttamente nel piatto 35 mm. Seme 3.0 x 105 HeLa cells in un piatto di 35mm con un vetrino coprioggetto quadrettato per ottenere circa 50-70% confluenza dopo plasmidi di DNA Transfect h. 30 e cambiare supporto 2-6 ore dopo la trasfezione. Procedere con laser microirradiation 12-20 h successive se l'espressione della proteina è ragionevole e le cellule appaiono sane.

3. ciclo cellulare sincronizzazione

Nota: Per ricombinazione omologa (HR) proteine di riparazione, come Rad51 e coesina, il reclutamento è più prominente in fase S/G2 del ciclo cellulare, nella quale HR riparazione prende posto51. Così, per monitorare l'assunzione di queste proteine, sincronizzazione delle cellule in fase S/G2 è necessaria.

  1. Sincronizzazione di fase S/G2
    1. Utilizzare il protocollo di blocco doppio timidina per la sincronizzazione delle cellule S/G2 fase50,51. Dopo la semina le cellule in un piatto di griglia coprioggetto di 35 mm (Vedi punto 1.1), incubare le cellule con timidina (a una concentrazione finale di 2,5 mM) in mezzi di coltura (come al punto 1.1) per 17 ore a 37 ° C e 5% CO2.
    2. Lavare le cellule con terreni di coltura privo di timidina 1ml (come al punto 1.1) due volte e incubare le cellule in terreno di coltura privo di timidina 2 mL per 9 h come al punto 1.1.
    3. Aggiungere 200 µ l di soluzione madre di 27,5 mM timidina (disciolta in terreni di coltura) in terreni di coltura con le cellule ad una concentrazione finale di timidina 2,5 mM. Incubare le cellule come descritto al punto 3.1.1 per h. 15 un altro risciacquo e incubare le cellule in terreno di coltura privo di timidina per 4-6 h e indurre danni al DNA (sezione 4).
    4. Confermare l'efficienza di sincronizzazione utilizzando marcatori del ciclo cellulare (ciclina A2 e B1 per S/G2 e G2, rispettivamente), fattori di riparazione di danni del DNA di fase-specifici di S/G2 (ad es., Rad51 o coesina), o dall'IdU/EdU incorporazione (per le cellule di fase S)51.
  2. Sincronizzazione di fase G1
    1. Seme 6-8 x 104 le cellule HeLa in una piastra di coltura di 35 mm con griglia coprioggetti (punto 2.1).
    2. Dopo 2 giorni, identificare cellule in metafase, che sono leggermente sollevata ed a forma di rotonda, sotto un microscopio invertito con obiettivo 10x e 10 X oculare lenti. Acquisire immagini per registrare la posizione delle cellule di metafase il coprivetrino quadrettata.
    3. Dopo 3-4 h, confermare la divisione cellulare in due cellule figlie (nella fase G1) e indurre danni al DNA (sezione 4).

4. titolazione del Laser di potenza in ingresso

Nota: In questo protocollo, induciamo il danno del DNA usando un 780 nanometro ha pulsato sistema di laser NIR fs attaccato ad un microscopio confocale, o un 800 nanometro ha pulsato laser NIR fs accoppiato ad un microscopio invertito epi-fluorescenza. Anche se la potenza in ingresso (effettivo irraggiamento al punto focale laser nel campione) necessaria per indurre DDR paragonabile è diverso in questi sistemi, il principio base della titolazione di potenza in ingresso è applicabile a entrambi, o qualsiasi, NIR sistemi32,57 . L'energia in situ per irraggiamento di impulso e picco di laser al punto focale per i sistemi due laser erano nella gamma di 5,33 × 10-2-4 × 10-1 nJ e 7 × 1010-5.24 × 1011 W/cm2, rispettivamente32.

  1. Accendere il laser NIR e consentire al sistema laser di warm-up per 1 h prima dell'uso.
  2. Mettere un piatto di cellule su un palco riscaldata (37 ° C) in una camera che permette di CO2 (5%) e controllo dell'umidità (100%).
    Nota: Se una camera di CO2 non è disponibile, utilizzare CO2-mezzi di coltura indipendente per fino a 5-6 h. Se una fase di riscaldamento non è disponibile, mantenere le cellule sotto il microscopio per < 20 min e rimettere immediatamente l'incubatrice di coltura del tessuto con temperatura adeguata, CO2e controllo dell'umidità. Queste condizioni di cultura possono variare a seconda del tipo di cella specifica utilizzato così come l'organismo di derivazione (ad es., mammiferi e anfibi).
  3. Per l'analisi di cellule vive di proteine fluorescente, selezionare un filtro GFP (450-490 nm eccitazione, 515-586 nm emissione) o Cy3 (540-552 nm eccitazione, > 590 nm emissione) per GFP o fusi con mCherry proteina, rispettivamente, utilizzando un 100x o immersione in olio X 63 obiettivo.
  4. Ricerca per le cellule che hanno segnali di fluorescenza paragonabile, che riflette i livelli comparabili di espressione della proteina. Evitare le cellule che hanno troppo debole o troppo forte espressione al fine di ridurre la variabilità della cellula--cellula in misure di fluorescenza.
  5. Titolare la potenza di ingresso di laser.
    1. laser NIR 780 nm collegato ad un microscopio confocale
      1. Utilizzare la funzione di candeggina software per destinazione tracce lineari all'interno del nucleo delle cellule per l'esposizione alle scansioni laser singolo (risoluzione 512 x 512 pixel, zoom X1, sbiancato regione 50 x 4 pixel, tempo di permanenza di 12,8 µs pixel, iterazione x1) attraverso l'obiettivo di olio (100 X / 1.3 NA).
      2. Regolare la percentuale di trasmissione del laser (utilizzando il software/hardware integrato nel sistema di microscopio laser dal produttore) al 5% senza modificare le altre impostazioni.
      3. Inserire una cella al centro del campo. Fare clic sull'area di strumento di interesse (ROI) e disegnare una linea o la casella (circa 50 x 4 pixel) nel nucleo utilizzando il mouse e fare clic sul pulsante "Candeggina" per indurre il danno del DNA.
        Nota: Nei passaggi successivi irradiazione, "sbianca" dovrebbe essere aumentato in incrementi del 5% al 40% o fino al 100% se necessario.
      4. 800 nm del laser NIR attaccato al microscopio a epifluorescenza
      5. Controllare la potenza in ingresso attraverso un (63 X / 1,4 NA) contrasto di fase obiettivo di immersione olio di rotazione motorizzata di un filtro di polarizzazione introdotto nel percorso ottico e montato su una fase rotazione motorizzata comandata da calcolatore32,39 , 58.
      6. Regolare l'angolo di polarizzatore (°) e misurare la potenza in ingresso (mW) entrando il microscopio, usando un misuratore di potenza del laser. Determinare gli angoli di polarizzatore che forniscono inpue potenze che vanno da 20 mW-155 mW a incrementi di 5-10 mW.
      7. Impostare l'angolo di polarizzatore che corrisponde a 20 mW di potenza di ingresso.
        Nota: Per il nostro sistema di laser, se l'angolo di polarizzatore è 40 °, la potenza assorbita è di 65 mW. Aumentare la potenza in ingresso con incrementi di 5-10 mW.
  6. Per l'analisi di cellule vive, passare alla procedura 6.1 e 6.3. Per il rilevamento di immunofluorescenza della proteine endogene o modifiche, procedere alla sezione 5. Dopo l'analisi, andare al punto 4.7 per ulteriore titolazione della potenza del laser. Per analizzare il requisito di fattore a Monte, andare alla sezione 7.
    Nota: Reclutamento di fattori di BER e NHEJ è veloce (entro pochi minuti) e transitori (< ~ 30 min - 1 h a seconda del fattore e < ~ 4 h post danneggiare induzione, rispettivamente). Al contrario, l'assunzione di fattori HR Rad51 e coesina è rilevabile a ~ 30 min - 1 h e tendono a persistere più di 8 h a unrepaired del DNA lesioni44,50,51. Pertanto, è necessario esaminare diversa volta punti post irradiazione per riparazione diversi fattori.
  7. Aumentare la potenza di ingresso desiderati incrementi (cioè, 5% per 780 laser NIR e 5-10 mW per 800 NIR) come descritto al punto 4.4 e ripetere i passaggi 4.5-4.7 su una nuova serie di celle per determinare la soglia (50% di cellule danneggiate Vedi assunzione) e picco (100% di cellule Visualizza assunzione) per ogni proteina.

5. immunofluorescenza

Nota: per il rilevamento di modificazione covalente di proteine, come PAR (marker di danno complesso) e fosforilazione H2AX (γH2AX) (indicatore DSB), così come dimero di pirimidina del cyclobutane (CPD)/(6-4) photoproducts (6-4PP) e 8-oxoguanine (8-oxoG) (reticolazione e base di marcatori di danno, rispettivamente), le cellule devono essere corretti e macchiate con gli anticorpi specifici. Inoltre, si consiglia di confermare i risultati ottenuti con le proteine ricombinanti fluorescente contrassegnate tramite rilevazione di anticorpi delle proteine endogene, per distinguere gli artefatti indotti dalla sovraespressione di proteine di fusione ricombinante.

  1. Difficoltà cellule in diversi momenti dopo induzione di danno (punto 4.5) a seconda dei fattori sostituendo i terreni di coltura (Vedi punto 1.1) con 1,5 mL di 4% paraformaldeide/1 X PBS per 10 minuti a TA.
    Attenzione: Paraformaldeide fumi sono tossici e tutto il lavoro dovrebbe essere fatto in una cappa ventilata.
  2. Rimuovere la paraformaldeide 4% / PBS e aggiungere 1 mL di 0.5% detergente/PBS per 10 minuti a TA.
  3. Rimuovere le cellule di detersivo/PBS e risciacquo di 0,5% con 2 mL di PBS per 5 min due volte e incubare le cellule in 2 mL di soluzione bloccante (siero di vitello di 10%, 1% BSA/PBS) per 1 h a TA.
  4. Rimuovere la soluzione bloccante e aggiungere 2 mL di PBS alle celle e sostituire PBS con 250 µ l di soluzione di anticorpo primario del 3% BSA/PBS durante la notte a 4 ° C o 1 h a RT. uso un 1: 200-diluizione 1: 500 (concentrazione tipica circa 1 µ g/mL, determinato empiricamente) per gli anticorpi specifiche per diversi indicatori di danno del DNA (ad es., γH2AX/53BP1 (DSB); Ku (DSB, NHEJ); RAD51/coesina (DSB, HR); CPD/6-4PP (reticolazione danni); 8-oxoG/DNA glycosylases (ad esempio, NTH1) (danno di base); PAR (danno complesso dose elevata)).
  5. Rimuovere la soluzione di anticorpo e risciacquare con 2 mL di PBS per 5 min due volte, Rimuovi PBS e incubare con 250 anticorpo secondario in 0,1% µ l in 3% BSA/PBS per 1 h al buio a TA.
  6. Rimuovere la soluzione di anticorpo secondario e aggiungere 2 mL di PBS per 5 min due volte e mantenere le cellule in 1.5-2 mL di PBS a 4 ° C per l'imaging ai punti 6.1 e 6.2.

6. analisi di fluorescenza quantitativa di Immunostained o cellule vive

  1. Catturare immagini di cellule macchiate o dal vivo (n > 10) utilizzando microscopio utilizzato per irradiazione. Per il sistema di epi-fluorescenza microscopio, utilizzare la risoluzione di 1.344 x 1.024 pixel e salvare le immagini come file TIFF 16 bit. Per un microscopio confocale, utilizzare l'ingrandimento di 1x; Laser di argon per GFP/FITC, laser HeNe 594 per Cy3/mCherry; 512 x 512 o 1.024 x 1.024 pixel per risoluzione dell'immagine; 5, numero di velocità di scansione: 1 per una scansione rapida o 2 + per una media di scansioni multiple per migliorare il rapporto segnale-rumore.
  2. Utilizzare un'analisi di immagine programmi progettati per misurare l'intensità di pixel.
    1. Utilizzare lo strumento rettangolo di Volume per disegnare un ROI intorno al sito di danni nell'immagine singola cella. Utilizzare la stessa dimensione ROI per misurare il segnale di fluorescenza di fondo nel nucleoplasma adiacente, ma non sovrapposte con i siti di danno. Questo è importante per la normalizzazione di photobleaching connesso con il sistema di microscopio confocale-non.
    2. Per misurare i segnali di fluorescenza usando il programma di analisi di immagine, fare clic su "Volume Analysis Report" trovato nella cassetta degli attrezzi. Apparirà una nuova finestra. Nella sezione "Dati a Display", selezionare solo le caselle "Nome" e "Densità". Quindi fare clic su "Fatto" per visualizzare le misurazioni.
    3. Esportare i valori in un foglio di calcolo facendo clic sull'icona tabella trovato nella parte inferiore della finestra di Report Volume e selezionare "schede (formato excel)" per separatori di campo e "File" per esportare destinazione.
    4. Per ottenere segnali relativi, è necessario utilizzare il programma di foglio di calcolo per dividere l'intensità di fluorescenza nel sito di danno (colonna 1) di che nel controllo sfondo regione (colonna 2) nel nucleoplasma e sottrarre da 1 per la normalizzazione.
  3. Analisi di tempo-corso di fluorescenza quantitativa in tempo reale utilizzando il microscopio confocale
    1. Identificare cellule proteina-positive fluorescente contrassegnate utilizzando il microscopio come descritto al punto 4.3.
    2. Eseguire l'imaging di fluorescenza time-lapse prima danno e in diversi momenti dopo induzione di danno nella sezione 4. Prima disegnare la candeggina ROI (per induzione di danno), quindi selezionare la "Acquire > Time Series" sottomenu, impostare il "Numero" come 20 e il "ritardo ciclo" come 30 s, scegli "candeggina una volta dopo la prima scansione" e quindi facendo clic su "start B". In questo caso, la prima immagine viene acquisita immediatamente prima di induzione di danno, seguita da 19 acquisizioni di immagine a un intervallo di 30 s. Intervalli ("ritardo del ciclo") possono essere modificati a seconda dello scopo dello studio.
    3. Una volta completata l'acquisizione di immagini, fare clic su "Significa" e disegnare il ROI alla regione di danni. Fare clic su «Show Table» per ottenere una tabella che elenca l'intensità all'interno il ROIs selezionato. Normalizzare i dati dividendo l'intensità della fluorescenza del sito danno a tempi diversi dall'intensità della stessa regione prima di danni e sottrarre 1.

7. piccolo RNA interferenti (siRNA) transfezione

Nota: Lo svuotamento della proteina dell'obiettivo è un modo efficace per delineare il requisito di fattore a Monte per l'assunzione di proteine osservati ai danni di siti (sezione 4). Inoltre, la strategia è il modo migliore per affrontare la specificità di un anticorpo utilizzato per il rilevamento di immunofluorescenza (Vedi sezione 5).

  1. Giorno 1: Preparare 2 pozzi delle cellule HeLa in una piastra a 24 pozzetti da semina 6-8 x 104 le cellule HeLa in 0,5 mL di coltura in ciascun pozzetto, uno per la transfezione di siRNA di controllo e uno per PARP1 siRNA (5'-CCG AGA AAT CTC TTA CCT CAA-3').
  2. Giorno 2: Confermare che le cellule sono circa 40-50% confluenti. Eseguire il primo giro di trasfezione con siRNA: diluire 5 pmol siRNA in 25 µ l di terreno di coltura privo di siero, aggiungere Reagente di transfezione in base 3 lipidi µ l nella provetta, agitare delicatamente e incubare per 5-10 minuti a TA.
  3. Sciacquare le cellule con 0,5 mL di coltura fresca una volta e mantenere le cellule in terreno di coltura fresco di 0,5 mL (Vedi punto 1.1).
  4. Aggiungere i complessi RNA-lipidi alle cellule e mescolare delicatamente inclinando il piatto di avanti e indietro. Rimettere le cellule in incubatrice come descritto al punto 2.1.
  5. Aspirare la miscela di transfezione e aggiungere 0,5 mL di coltura fresca (punto 1.1) dopo 6 h.
  6. Giorno 3: Eseguire il secondo round del siRNA transfezioni (Vedi punto 7.2). Allora, seed 60-100% delle cellule in un piatto di griglia coprioggetto 35 mm come descritto al punto 2.3.
  7. Giorno 5: Procedere con microirradiation laser utilizzando la condizione di potenza ottimale del laser per massima per l'assunzione del fattore di interesse, come determinato dalla sezione 4. In genere, svuotamento efficiente può essere osservato in circa il 60-90% delle cellule HeLa.
    Nota: Come un'alternativa e complementare approccio, inibitori, se disponibile, può essere utilizzato per inibire la funzione del fattore di interesse32,44. Per analizzare l'effetto di inibire la segnalazione di DDR, aggiungere inibitore PARP 20 µM, 1 µM PAR glicoidrolasi (PARG) inibitore o 10 della chinasi di proteina DNA-dipendente µM con subunità catalitica (DNA-PKcs) inibitore e 10 µM ATM inibitore in dimetilsolfossido (DMSO) per la piatti 1 h prima di induzione di danni. Aggiungere DMSO solo alle cellule di controllo.

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Risultati

Utilizzando PtK2 le cellule che esprimono EGFP-53BP11220-1711 o TRF2-YFP, titolazione di alimentazione in ingresso di laser è stato effettuato per determinare la condizione ottima per la loro assunzione (Figura 1)32.

Siti di danno del laser di alta potenza di ingresso, il clustering significativo della CPD (reticolazione danno tipicamente generato da danno ultravioletto (UV)) così come GFP-NTH1 DNA glicosilasi che riconosce speci...

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Discussione

I vantaggi dell'utilizzo di laser microirradiation per la ricerca DDR sono:

1. è fattibile per indurre diversi tipi e quantità di DNA danni da rotture del filo semplice complesso danno del DNA, e per rilevare riparazione diversi fattori al DNA danno siti regolando i parametri di irradiazione del laser. È anche possibile di infliggere danni più volte nel nucleo della cellula stessa al fine di valutare gli effetti di trans (come in Figura 3).

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Si ringraziano il Dr. Akira Yasui Università di Tohoku, Giappone per il plasmide di espressione di GFP-NTH1 e Dr. Eros Lazzerini Denchi al Scripps Research Institute, La Jolla, in California, per la TRF2-YFP e plasmidi di espressione di EGFP-53BP11220-1711 . Questo lavoro è stato supportato da Air Force Office of Scientific Research (FA9550-04-1-0101) e la Fondazione di Beckman Laser Institute Inc (a M.W.B), la Ford Foundation Fellowship presso l'Accademia nazionale delle scienze (a B.A.S) e NSF MCB-1615701 e CRCC CRR-17-426665 (per K. Y.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ti:Sapphire NIR laser a femtosecondi pulsato Mira-900Coherent Inc.Mira 900
Microscopio invertito Obiettivo Carl ZeissAxiovert 200M
63X/1.4 NAZeissAPOCHROMAT Ph3 
Stadio di rotazione compatto Newport CorpPR50PP
Regolatore di temperaturaWarnerTC-344B
Sistema di riscaldamentoIbidi 10918
Sistema di incubazione del gasIbidi 11920
Contatore laser di potenza ed energia (RoHS)CampocoerenteMaxII-TOP 
Telecamera CCD digitale ORCA-R2HamamatsuC10600
LSM 510 META Microscopi a scansione laserCarl Zeiss
100X/1.3 NA Zeiss Plan APOCarl Zeiss
35mm Piastre a griglia MatTekP35G-1.5-14-CGRD-D
PtK2 cellule epiteliali renaliATCCCCL 56 
Celle HeLaATCCCCL-2
DMEMLife Technologies11885-092
Mezzo indipendente da CO2 Life Technologies18045-088
MEM avanzatoLife Technologies12492-013integrato con L-Glutammina, 4% FBS
penicillina/streptomicinaFisher Scientific15140122
L-GlutamminaFisher Scientific 25030081
FBSOmega ScientificFB-02
Timidina   SIGMAT9250
terreni senza siero       (Opti-MEM I Terreni di siero ridotti)Fisher Scientific 11058021
Dimero pirimidina anti-cicolbutanza (CPD) (topo)Kamiya Biomedical CompanyMC-062
Anti-XRCC1 (topo)Gene Tex IncGTX72311
Anti-53BP1 (coniglio)Santa Cruz Biotechsc-22760
Anti-CtIP (coniglio)Abcamab70163
Polimeri anti-PAR (topo)Enzo Life SciencesBML-SA216-0100
Anti-PAR (coniglio)Trevigen4336-BPC-100
Anti-TRF2 (topo)Novus Biological NB100-56506
Anti 6-4PP (topo)Kamiya Biomedical
Anti-Rad21 (Coniglio)                                        (per il rilevamento della coesina)di Yokomori (KY)
Anti-Rad51 (Coniglio)Santa Cruz BiotechnologySC-8349
Anti-Ku70 (topo)  Novus BiologicalsNB100-102
8-ossiguanina Trevigen, Inc.
Anti-PARP1  (Coniglio)                                       generato nel laboratorioref 43
  Anti-hCAPG (Coniglio)                                      (per il rilevamento della condensa)generato in laboratorio KYref 42
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG  Jackson ImmunoResearch Inc711-165-152
Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgGThermo Fisher ScientificA-21202
HiPerFect siRNA Reagente di trasfezioneQiagen301705
Lipofectamine 2000 Reagente di trasfezioneThermo Fisher Scientific11668019
GFP-SMC1 linea cellulare stabile       generato in laboratorio KYref 49 
Linea cellulare stabile GFP-NEIL2generata nel laboratorioref 54
Linea cellulare stabile GFP-NTH1generata nel laboratorioref 32
Plasmide GFP-SMC1generato nel laboratorio
Plasmide GFP-Kugenerato nel laboratorio
Anti-MDC1 (coniglio)  Novus BiologicalsNB100– 395
Anti-gH2AX (coniglio)  Millipore07– 164
EGFP-53BP1 (1220-1711) Linea cellulare stabile PtK2generata nel laboratorioref 32
TRF2-YFP Linea cellulare stabile PtK2generata nel laboratorioref 32
DMSOSigmaD2650-100ML
Inibitore PARGTrevigen4680-096-03
DNA– Inibitore della PKcs  NU7026 SigmaN1537
Inibitore ATM KU55933  Calbiochem118500
Olaparib Apexbio TechnologyA4154
Paraformaldeide MICROSCOPIA ELETTRONICA SCIENC MS100503-916 (EA)
Quantità Uno Software di analisi 1D Versione 4.6.9Bio-RadSOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC programma di analisi delle immagini
Excelprogramma perfogli di calcolo
Triton X100Fisher ScientificBP151-500detergente
salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) 10X senza calcio e magnesioFisher Scientific14200166diluito a 1X 
generato nel laboratorio KY KY KY KYKY Berns Berns microsoft soluzione

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