Laser Microirradiation per lo Studio In Vivo delle risposte cellulari al danno al DNA semplici e complesse

Xiangduo Kong; Gladys M.S. Cruz; Bárbara A. Silva; Nicole M. Wakida; Nima Khatibzadeh; Michael W. Berns; Kyoko Yokomori

doi:10.3791/56213

Articolo metodologico

Laser Microirradiation per lo Studio In Vivo delle risposte cellulari al danno al DNA semplici e complesse

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DOI:

10.3791/56213

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31 gennaio 2018

Xiangduo Kong^*¹ , Gladys M.S. Cruz^*² , Bárbara A. Silva² , Nicole M. Wakida² , Nima Khatibzadeh² , Michael W. Berns²^,³^,⁴ , Kyoko Yokomori¹

¹Department of Biological Chemistry, School of Medicine, University of California, Irvine, ²Beckman Laser Institute and Medical Clinic, University of California, Irvine, ³Department of Developmental and Cell Biology, School of Biological Sciences, University of California, Irvine, ⁴Department of Biomedical Engineering and Surgery, University of California, Irvine

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

L'obiettivo del presente protocollo è quello di descrivere come utilizzare laser microirradiation per indurre diversi tipi di danno del DNA, compreso le rotture del filo relativamente semplici e danno complesso, per studiare assieme di fattore DNA danni segnalazione e riparazione presso siti di danno in vivo .

Abstract

Danno al DNA induce risposte specifiche di segnalazione e riparazione nella cella, che è fondamentale per la protezione dell'integrità del genoma. Laser microirradiation è diventato un prezioso strumento sperimentale per studiare il DNA danni risposta (DDR) in vivo. Permette analisi unicellulare ad alta risoluzione in tempo reale delle dinamiche macromolecolari in risposta al danno indotto da laser relegato a una regione submicrometrici nel nucleo della cellula. Tuttavia, varie condizioni di laser sono state utilizzate senza apprezzamento delle differenze nei tipi di danno indotto. Di conseguenza, la natura del danno spesso non è ben caratterizzato o controllata, causando evidenti incoerenze nei profili di reclutamento o modifica. Abbiamo dimostrato che condizioni di irradiazione diversi (cioè, diverse lunghezze d'onda come pure diverse potenze di ingresso (irradiances) di un laser a femtosecondi (fs) vicino infrarosso (NIR)) ha indotto gli assembly distinti di proteina DDR e riparazione. Ciò riflette il tipo di danno del DNA prodotto. Questo protocollo descrive come titolazione input di potere del laser permette di induzione di diverse quantità e complessità del danno al DNA, che può essere facilmente monitorato tramite rilevazione di danni base e reticolazione, differenziale poly (ADP-ribosio) (PAR) di segnalazione, e riparazione di percorso specifico assembly fattore presso siti di danno. Una volta che le condizioni di danno sono determinate, è possibile studiare gli effetti di danno differenti complessità e segnalazione differenziali danni nonché deplezione di fattori a Monte su qualsiasi fattore di interesse.

Introduzione

In Vivo Segnalazione di danni del DNA non è ben compreso
In vivo, il DNA è complessato con istoni ed altri fattori a fibre di cromatina forma. Regolamento della struttura della cromatina è di fondamentale importanza per il metabolismo del DNA. Ad esempio, la variante dell'istone H2AX viene fosforilata da atassia-teleangectasia mutato (ATM) e altre chinasi seguente doppio-filo si rompe ad induzione (DSB) ed è importante per amplificazione del segnale DSB danni, nonché a fornire un sito di aggancio per altro fattori. Diffusione della scelta di pathway di segnalazione e riparazione danni sembrano essere criticamente influenzati dalla....