Multi-fotone Time Lapse Imaging per visualizzare lo sviluppo in tempo reale: visualizzazione della migrazione di cellule neurali della cresta negli embrioni di Zebrafish

Summary

Una combinazione delle tecniche ottiche avanzate di scansione microscopia con lungo l'eccitazione di fluorescenza multi-fotone lunghezza d'onda del laser è stata implementata per catturare immagini ad alta risoluzione, tridimensionale, in tempo reale della migrazione dalla cresta neurale in embrioni di zebrafish di Tg (foxd3:GFP) e Tg (sox10:EGFP).

Abstract

Occhio congenita e anomalie craniofacciali riflettono imprevisti nella cresta neurale, una popolazione transitoria di migratori cellule staminali che danno origine a numerosi tipi di cellule in tutto il corpo. Comprensione della biologia della cresta neurale è stata limitata, che riflette una mancanza di modelli geneticamente trattabili che possono essere studiati in vivo e in tempo reale. Zebrafish è un modello di sviluppo particolarmente importante per lo studio di popolazioni di cellule migratorie, come la cresta neurale. Per esaminare la migrazione dalla cresta neurale nell'occhio in via di sviluppo, una combinazione delle tecniche ottiche avanzate di scansione microscopia con eccitazione di fluorescenza di multi-fotone lunghezza d'onda del laser è stata implementata per catturare video ad alta definizione, tridimensionali, in tempo reale dell'occhio in via di sviluppo negli embrioni di zebrafish transgenici, vale a dire Tg (sox10:EGFP) e Tg (foxd3:GFP), come sox10 e foxd3 è stati dimostrati in numerosi modelli animali di regolare differenziazione iniziale dalla cresta neurale e probabilmente rappresentano gli indicatori per le cellule della cresta neurale. Time-lapse di immagini multi-fotone è stato utilizzato per discernere il comportamento e schemi migratori delle due popolazioni di cellule neurali della cresta che contribuiscono al precoce sviluppo dell'occhio. Questo protocollo fornisce informazioni per la generazione di video time-lapse durante la migrazione dalla cresta neurale di zebrafish, come esempio e possa essere applicato per visualizzare lo sviluppo precoce di molte strutture in zebrafish e altri organismi di modello.

Introduction

Malattie congenite dell'occhio possono causare la cecità di infanzia e spesso sono dovuti ad anomalie della cresta neurale cranica. Cellule della cresta neurale sono cellule staminali transitorie che derivano dal tubo neurale e formano numerosi tessuti in tutto il corpo. ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} cellule della cresta neurale, derivate dal prosencefalo e mesencefalo, danno luogo all'osso e la cartilagine del midface e regioni frontali e l'iride, cornea, trabecolato e sclera nel segmento anteriore dell'occhio.

Protocol

Il protocollo qui descritto è stato eseguito in conformità con le linee guida per il trattamento umano degli animali da laboratorio stabilite dal Comitato per l'uso e la cura degli animali dell'Università del Michigan (UCUCA).

1. Raccolta di embrioni per l'imaging time-lapse

1. Tra le 15 e le 21, allestisci un maschio e una femmina di pesce zebra transgenico adulto Tg(sox10:EGFP) o Tg(foxd3:GFP) in una vasca di riproduzione divisa per l'accoppiamento a coppie.
   NOTA: I pesci Tg(sox10:EGFP) e Tg(foxd3:GFP), doni gentili di Thomas Schilling e Mary Halloran, rispettivamente, sono stati incroci....

Results

Time-lapse imaging multi-fotone di fluorescenza generata una serie di video che ha rivelato i modelli di migrazione delle cellule neurali craniche della cresta che danno origine alle strutture craniofacial e segmento anteriore dell'occhio nel Tg (sox10:EGFP) e Tg (foxd3:GFP) linee di zebrafish. Ad esempio, sox10 -positivo dalla cresta neurale cellule tra 12 e 30 hpf migrano dal bordo del tubo neurale nella regione craniofacial (Video 1,

Discussion

Time-lapse di immagini multi-fotone consente il monitoraggio in vivo di popolazioni cellulari transitori e migratori. Questa potente tecnica può essere utilizzata per studiare i processi embrionali in tempo reale, e nello studio presente, i risultati di questo metodo ha migliorato la conoscenza attuale di sviluppo e migrazione delle cellule neurali della cresta. Precedenti studi di imaging time-lapse in genere utilizzano la microscopia a scansione laser confocale. ^{29 ,}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vasche di allevamento con divisori	Aquaneering	ZHCT100	Set di vasche di attraversamento (1,0 litri) Policarbonato trasparente con coperchio e inserto
M205 FA Combi-Scope	Leica Microsystems CMS GmbH		Microscopio a stereofluorescenza - FusionOptics e TripleBeam
Sodium Chloride	Millipore (EMD)	7760-5KG	Doppio sacco in PE. N. CAS 7647-14-5, numero CE 231-598-3
Cloruro di potassio	Millipore (EMD)	1049380500	Cloruro di potassio 99.999 Suprapur. N. CAS 7447-40-7, numero CE 231-211-8.
Cloruro di Calcio Diidrato	Fisher Scientific	C79-500	Flacone in polietilene; 500 g. Codice CAS 10035-04-8
Solfato di Magnesio (Anidro)	Millipore (EMD)	MX0075-1	Flacone in polietilene; 500 g. Codice CAS 7487-88-9, Numero CE 231-298-2
Blu di metilene	Milliporo (EMD)	284-12	Flacone in vetro; 25 g. in polvere, colorante biologico certificato
Bicarbonato di sodio	Millipore (EMD)	SX0320-1	Flacone in polietilene; 500 g. Polvere, GR ACS. N. CAS 144-55-8, numero CE 205-633-8
N-feniltiourea	Sigma	P7629-25G	>98%. Numero CAS 103-85-5, Numero CE 203-151-2
Dimetilsolfossido	Sigma	D8418-500ML	Grado di biologia molecolare. Numero CAS 67-68-5, Numero CE 200-664-3
Tricaina Metanansolfonato	Western Chemical Inc.	MS222	Tricaine-S
Agarosio a basso punto di fusione	ISC Bioexpress	E-3112-25	Setaccio GeneMate GQA Agarosio a basso punto di fusione, 25 g
Camera da bagno aperta	Warner Instruments	RC-40HP
Vetrini coprioggetto in vetro	Fisher Scientific	12-545-102	Vetro di copertura circolare. Grasso per alto vuoto diametro 25 mm
	Fisher Scientific	14-635-5C	Tubo da 2,0 libbre. DOW CORNING CORPORATION 1658832
Piattaforma di sostituzione rapida	Warner Instruments	QE-1	da 35 mm
	Warner Instruments	SA-20LZ-AL	16,5 x 10 cm
TC SP5 MP Microscopio multifotone	Leica Microsystems CMS GmbH
Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire Laser	SpectraPhysics
Scatola	di sicurezza laserLeica Microsystems CMS GmbH
Leica Application Suite X (LAS X)  Software	Leica Microsystems CMS GmbH
Photoshop CS 6 Versione 13.0 x64 Software	Adobe
iMovie Versione 10.1.4 Software	Apple