Quantificazione del linfocita murino traffico In Vivo e chemiotassi del monocito umano In Vitro

Sommario

Protocolli per la valutazione quantitativa della chemiotassi dei linfociti e la migrazione sono strumenti importanti per la ricerca in immunologia. Qui, un protocollo in vitro è descritto che permette in tempo reale, multiplexed valutazione della migrazione cellulare, così come un complementare in vivo tecnica abilitazione rilevamento di cellule native alla milza.

Abstract

La chemiotassi è migrazione lungo un gradiente chimico specifico¹. Le chemochine sono citochine chemiotattiche che promuovono il traffico cellulare con specificità anatomiche e temporale². La chemiotassi è una funzione critica dei linfociti e altre cellule immuni che possono essere quantitativamente valutata in vitro. Questo manoscritto descrive i metodi che consentono la valutazione della chemiotassi, sia in vitro che in vivo, per tipi cellulari diversi tra cui linee cellulari e cellule native. Lo in vitro, formato basato su piastra permette il confronto delle diverse condizioni contemporaneamente in tempo reale e può essere completato entro 1-4 h. In vitro analisi condizioni possono essere manipolate per introdurre gli agonisti e antagonisti, come bene come differenziare la chemiotassi da chemokinesis, che è il movimento casuale. Per le valutazioni traffico in vivo , le cellule immuni possono essere contrassegnate con le tinture fluorescenti più e utilizzate per trasferimento adottivo. L'etichettatura differenziale delle cellule consente di popolazioni di cellule miste ad essere introdotti nello stesso animale, quindi diminuendo la varianza e riducendo il numero di animali necessari per un esperimento adeguatamente alimentato. Migrazione nel tessuto linfoide si verifica in meno di 1 h e compartimenti multipli possono essere campionati. Citometria a flusso successivo vendemmia del tessuto permette un'analisi rapida e quantitativa dei flussi migratori di più tipi di cellule.

Introduzione

Robusta immunità richiede il complesso coordinamento temporale e spaziale di una miriade di tipi di cellule al fine di rispondere in modo appropriato alla lesione, infezione e generare auto-tolleranza. Parecchi dozzina recettori per le chemochine e loro corrispondenti ligandi sono stati scoperti e caratterizzati fornendo meccanismi molecolari da cui le cellule specifiche possono essere diretto in un tessuto specifico in un momento specifico. Pertanto, studiare chemiotassi e migrazione è una componente indispensabile di ricerca in immunologia. Infatti, l'analisi descritta in vitro è stata recentemente usata come uno strumento di screening per identificare un c....

Protocollo

tutte le procedure sono state approvate dal Rockefeller University ' s istituzionale Animal Care e Comitato di uso. Tutti gli animali sono stati alloggiati in condizioni da organismi patogeni specifiche.

1. chemiotassi In Vitro

1. cultura THP-1 cellule ⁶ nel 1640 di Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640) completati con 10% siero bovino fetale (FBS) e 4-(2-idrossietil) -1- acido piperazineethanesulfonic (HEPES; 25 mM) (completo di media), mantenendo la densità tra 0,5-1,0 x 10 ⁶ cellule/mL.
2. Coltura di cellule in un 35 mm piatto, etichetta 3,5 x 10 ⁵ THP-1 cel....

Risultati

Quando si utilizza il colorante calceina-AM, ispezione visiva delle cellule confermerà l'assorbimento etichetta (Figura 1). Letture di fluorescente automatizzate terrà traccia migrazione come transito di cellule sulla parte inferiore dell'inserto nel corso del tempo. Questi dati mostrano chiaramente un'induzione della migrazione cellulare verso MCP-1, così come un aumento di questa risposta dal siero (Figura 2A). A seconda della .......

Discussione

Quantificazione della migrazione delle cellule immuni può essere compiuta usando semplice e veloce saggi sia in vitro che in vivo. Dimostriamo la chemiotassi in vitro di monociti umani in risposta un gradiente di MCP-1 e l'aumento di siero. In vivo, gli splenocytes murini donatore differenzialmente sono stati etichettati e a seguito di trasferimento adottivo, sono stati recuperati dal destinatari animali.

Utilizzando un lettore di piastra ha il vantaggio di .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
RPMI-1640	Thermo Fisher Scientific	11875-093
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630-080
Siero fetale bovino	ATCC	30-2020
Pallone per colture cellulari	Corning	353136
Calcein AM	Thermo Fisher Scientific	C1430	Eccitazione: 485 nm, Emissione: 520 nm
Cella piatto di coltura	Corning	1007
piastra a 24 pozzetti	Corning	353504
Fluoroblok Inserto in fibronectina	Corning	CB354597
Provetta conica da 15 mL	Corning	352097
Bovine Serum Albumina	Cell Signaling Technology	9998S
Human Recombinant MCP-1	Peprotech	300-04
Siero bovino adulto	Sigma	B9433
HBSS con calcio e magnesio; senza rosso fenolo	Thermo Fisher Scientific	14025-092
Lettore di piastre SpectraMax M2e	Molecular Devices
Microscopio a fluorescenza invertita Olympus IX71	Olympus
Isothesia	Henry Schein salute animale	11695-6776-2	Anestesia isofluorana
Filtro cellulare 40um nylon	Falcon Corning	352340
ACK tampone di lisi	Qualità Biologico	118-156-101
CellTracker Colorante CMTMR arancione	Thermo Fisher Scientific	C2927	Eccitazione: 541nm, Emissione: 565nm
CellTracker Colorante CMFDA verde	Thermo Fisher Scientific	C2925	Eccitazione: 485nm, Emissione: 520nm
siringa da 5 ml	Siringa BD	309646
Siringa TB da 1 ml	Siringa BD	309625
linea cellulare THP-1	ATCC	TIB-202
Brilliant Violet 421 anticorpo CD3 anti-topo	Biolegend	100228	Eccitazione: 405 nm, Emissione: 421 nm
Brilliant Violet 605 anti-topo CD19	Antibody Biolegend	115540	Eccitazione: 405 nm, Emissione: 603 nm
Piastra a fondo rotondo a 96 pozzetti	Corning	353077
LSRII	BD Biosciences		Citometro a flusso