Protocollo generico per l'ottimizzazione della produzione di proteine eterologhe utilizzando tecnologia automatizzata di Microbioreactor

Summary

Questo manoscritto descrive un approccio generico per la progettazione su misura di media di coltura microbica. Questa opzione è attivata da un flusso di lavoro iterativo che unisce Kriging sperimentale design e microbioreactor tecnologia per una velocità effettiva coltivazione sufficiente, che è supportata da robotica lab per aumentare affidabilità e velocità nella gestione dei mezzi liquidi preparazione.

Abstract

Un core business in biotecnologie industriali utilizzando fabbriche di produzione microbica delle cellule è il processo iterativo di ceppo ingegneria e ottimizzazione delle condizioni di bioprocessi. Un aspetto importante è il miglioramento di medium di coltivazione per fornire un ambiente ottimale per la formazione microbica del prodotto di interesse. È ben accettato che la composizione media può influire notevolmente le prestazioni complessive di bioprocessi. Ottimizzazione media nutrizione è noto per migliorare la proteina ricombinante produzione con sistemi microbici e, quindi, questo è un gratificante passo nello sviluppo di bioprocessi. Tuttavia, ricette molto spesso standard multimediali sono tratti dalla letteratura, poiché la progettazione su misura di medium di coltivazione è un compito noioso che richiede tecnologia microbioreactor per una velocità effettiva coltivazione sufficiente, analitica rapida del prodotto, così come supporto di robotica lab per abilitare affidabilità nelle operazioni di gestione dei liquidi. Inoltre, metodi matematici avanzati sono necessari per analizzare razionalmente i dati di misura e in modo efficiente progettazione di esperimenti paralleli come raggiungere contenuto informativo ottimale.

Il carattere generico del protocollo presentato consente facile adattamento alla strumentazione di laboratorio diversi, altri host espressione e proteine bersaglio di interesse, così come ulteriori parametri di bioprocessi. Inoltre, altri obiettivi di ottimizzazione come tasso di produzione di proteina, resa specifica o qualità del prodotto possono essere scelti per adattarsi l'ambito di altri studi di ottimizzazione. Il Toolbox di Kriging applicata (KriKit) è uno strumento generale per progettazione di esperimenti (DOE) che contribuisce alla ottimizzazione migliorata bioprocessi olistico. Supporta anche ottimizzazione multi-obiettivo che può essere importante nell'ottimizzare processi upstream e downstream.

Introduction

La tecnologia moderna gene ricombinante consente l'ampio uso di enzimi tecnici per varie applicazioni nell'industria farmaceutica, zootecnia, chimica organica e^1,2,3di trasformazione alimentare. La produzione di enzimi tecnici allo stato sfuso è un argomento importante per la biotecnologia industriale e per la produzione di proteine ricombinanti ottimizzato ed entrambi colare e ingegneria di bioprocess è necessaria. Per la generazione di ceppi ingegnerizzati in modo efficiente produzione, librerie genetiche differenti sono disponibili, ad esempio, per equilibrato gene expression⁴ o secrezione aumentata efficienza⁵.

Glutamicum del corinebatterio è un importante produttore di aminoacidi alla scala industriale^6,7 e rappresenta un host attraente espressione non convenzionali per la produzione di secrezione di proteine ricombinanti^{8 ,9}. Sia il generale secretiva (Sec) e la via di twin-arginina traslocazione (Tat) sono presenti in c. glutamicum e sono state applicate correttamente per proteina ricombinante secrezione¹⁰. Vasta esperienza nell'ingegneria dei bioprocessi per quanto riguarda la produzione dell'amminoacido a scala industriale, come pure la capacità di secernere proteine g/L importi¹¹ e grande robustezza relativa disomogeneità di bioprocessi trovato in larga scala coltivazioni^12,13, effettuare c. glutamicum un organismo piattaforma promettente per la produzione di secrezione delle proteine eterologhe in scala industriale.

Ottimizzazione media nutrizione è noto per migliorare la produzione di proteine ricombinanti con sistemi microbici^14,15,16,17 e di conseguenza, la regolazione del mezzo composizione è un passo gratificante in bioprocessi sviluppo per quanto riguarda la produttività ottimale^18,19,20,21. Intense ricerche sull'applicazione delle piastre di microtitolazione (MTPs) per coltura microbica^22,23,24 ha spianato la strada per lo sviluppo e la progettazione di MTPs per coltura microbica^{25 ,26} e lo sviluppo di sistemi basati su MTP microbioreactor (MBR) con monitoraggio on-line e ambientale controllo^27,28. MBR permettono un significativo aumento della velocità effettiva coltivazione sperimentale. Inoltre, sono disponibili per bioprocessi microbica ottimizzazione^{29,30,31, sistemi MBR derivanti da altri tipi di bioreattori, ad esempio, bolla colonne o agitata serbatoio reattori, 32}.

In generale, gli studi di ottimizzazione beneficiano della maggiore velocità effettiva sperimentale, che diventa ancora più potente in combinazione con metodologie DOE, ad esempio per valutare le interazioni tra le variabili di progetto o ridurre gli spazi di ricerca alto-dimensionali. Di conseguenza, l'uso combinato di sistemi MBR, automazione di laboratorio e DOE ha dimostrato di essere un metodo efficace nella biotecnologia^{8,16,33,34,35}.

Un protocollo per l'ottimizzazione dei media è presentato combinando automazione di laboratorio state-of-the-art, tecnologia MBR con monitoraggio online di processo e progettazione sperimentale/analisi dati basati su Kriging. La metodologia di Kriging è implementata in una Toolbox di MATLAB ("KriKit") che può essere scaricato e utilizzato gratuitamente carica³⁶. Come esempio di applicazione, massimizzazione della produzione di proteine (GFP) secretiva fluo verde con c. glutamicum è mostrato ottimizzando la composizione del terreno minimo CgXII. Titolo GFP è stato scelto come l'obiettivo di ottimizzazione come esso può essere facilmente quantificato e ampiamente si applica come proteina di modello per lo studio del MBR sistemi^37,38,39.

Il quadro presentato è diviso in quattro fasi, che sono illustrati nella Figura 1. I passaggi sono indicati da cornici di casella e corrispondono alle sezioni del protocollo. Il primo passo (Figura 1A) è di definire gli obiettivi di progetto e di determinare i metodi richiesti. La combinazione di metodologie DOE, tecnologia MBR e automazione di laboratorio consente un aumentare il throughput sperimentale che richiede potente elaborazione di dati. Il secondo passo (Figura 1B) mira a rilevare le variabili design sensibile (cioè, componenti medie) con alta influenza sull'obiettivo ottimizzazione. Questo porta ad un ridotto numero di variabili di progetto di interesse. Il terzo passo (Figura 1) comprende un'ottimizzazione iterativa per una ricerca più dettagliata del rapporto funzionale tra le restanti variabili di progetto e l'obiettivo di interesse. Utilizzando il set di dati successivamente estesi, l'approccio di Kriging è applicato per prevedere il risultato sperimentale alle posizioni non misurati. Il ciclo iterativo si arresta non appena il modello Kriging predice un'ottimale o altopiano con sufficiente precisione. I risultati sono verificati nel quarto passaggio (Figura 1), a partire da un'ulteriore analisi di sensibilità intorno l'optimum identificato. Se inizialmente, insensibile componenti si trovano ad per essere insensibili anche nella regione ottima, è ragionevole supporre che questo vale durante la procedura di ottimizzazione iterativa nel terzo passo. In seguito, si consiglia di verificare i risultati di ottimizzazione di applicazione dei metodi ortogonali, come un saggio di attività o SDS-Page.

Il carattere generico del protocollo presentato consente facile adattamento di attrezzature di laboratorio diversi, altri host espressione e proteine bersaglio di scelta, così come ulteriori bioprocessi variabili come la temperatura di valore o coltivazione di pH.Inoltre, altri obiettivi di ottimizzazione come tasso di produzione di proteina, resa specifica o qualità del prodotto possono essere scelti per adattarsi l'ambito di altri studi di ottimizzazione.

Figura 1 : Flusso di lavoro di studio di ottimizzazione. I quattro riquadri corrispondono alle sezioni del protocollo, "Concepire the studio e definizione di metodi" (sezione 1), "Sensitivity Analysis" (sezione 2), "Ottimizzazione iterativa" (sezione 3) e "Convalida" (sezione 4). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

1. concepire lo studio e la definizione di metodi (Figura 1: parte A)

Nota: Definizione dell'obiettivo ottimizzazione: È un corso a tempo di formazione del prodotto necessaria o è solo un intervallo di tempo limitato o addirittura un punto del tempo fisso rilevante? Inoltre, considerare problemi potenziali come la stabilità, lo sforzo di quantificazione analitica, o tempo di coltivazione. Come alternativa al titolo finale di proteine, altri obiettivi potrebbero essere considerati come tempo di biomassa o coltivazione. Biomassa è riflessa dalla resa di prodotto specifico biomassa, mentre il tempo di coltivazione si riflette di spazio-tempo-rendimento. Qualità del prodotto (minimo) potrebbe anche essere un obiettivo. Ottimizzazione multi-obiettivo potrebbe essere necessario in determinate situazioni, come discusso altrove⁴⁰. In questo studio, titolo GFP dopo 17 ore di coltivazione è stato scelto come l'obiettivo di ottimizzazione. Fluorescenza GFP può essere seguito on-line utilizzando le attrezzature disponibili in questo studio, che semplifica notevolmente la determinazione della concentrazione della proteina modello.
Nota: Definizione dei parametri da ottimizzare: CgXII medio è costituito da 16 componenti individuali⁴¹ e indagare tutti questi in un progetto fattoriale completo si tradurrebbe in 2¹⁶ esperimenti ≈ 65.000. Di conseguenza, lo spazio di ricerca deve essere ridotto su una base razionale ed esperienza-driven. La selezione di componenti di media considerata per ottimizzazione possa essere supportata da dati di letteratura o conoscenze di esperte disponibili.

1. Decidere quali concentrazioni medie componente non dovrebbero essere variate. Per l'ottimizzazione del mezzo di CgXII, i seguenti componenti sono stati scelti per essere risolto:
   1. Glucosio è fissato a 10 g/L. Questa ottimizzazione è banale, perché più glucosio produce più GFP secernenti biomassa. Lo scopo era di rivelare gli effetti medi non intuitivo.
   2. 3-(N-morfolino) acido propansulfonico (MOPS) è fissata a 42 g/L. Questo fornisce sufficienti capacità tampone durante la coltivazione di batch e non è metabolizzato.
      Nota: L'aggiunta di MOPS a questa concentrazione finale assicura un valore iniziale di pH 7, anche con i vari volumi delle altre soluzioni stock aggiunti, che non sono a pH 7. Tuttavia, per escludere qualsiasi deviazione nel pH valori iniziali, il pH deve essere controllato per composizioni medie dove tutte le soluzioni di riserva vengono aggiunti alle loro volumi massimi e minimi.
   3. KH₂PO₄ e K₂HPO₄ sono fissati a 1 g/L. Questi forniscono anche potere tampone e servire come una fonte di fosfato.
   4. Urea è fissato a 5 g/L. Questo serve come una fonte di azoto basale e agente stabilizzante pH, sufficiente ad impedire N-limitazione.
   5. La biotina è fissata a 0,2 mg/L. c. glutamicum ATCC13032 è auxotrofi per biotina.
   6. Acido protocatechico (PCA) è fissato a 30 mg/L. Serve come un agente chelante del ferro.
   7. Isopropil-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) è fissato a 100 µM. Induce l'espressione del gene gfp .
2. Selezionare alte e basse concentrazioni di componenti multimediali per le proiezioni di sensibilità iniziale. Qui, sono stati scelti componenti da tre tipici gruppi di componenti multimediali. Le concentrazioni basse ed alte studiate per ogni componente sono:
   1. Fonte di azoto standard: (NH₄)₂SO₄ (8-32 g/L); la variazione della fonte dell'azoto è stata segnalata per essere promettente per l'ottimizzazione di biomassa specifiche GFP segnale⁸.
   2. Oligoelementi: FeSO₄ ∙ 7 H₂O (4-16 mg/L), MnSO₄ ∙ H₂O (4-16 mg/L), ZnSO₄ ∙ 7 H₂O (0.4-1.6 mg/L), CuSO₄ ∙ 5 H₂O (125-501 µ g/L), Burundi₂ ∙ 6 H₂O ( 8-32 µ g/L) e CoCl₂ ∙ 6 H₂O (52-208 µ g/L). La composizione degli oligoelementi è ereditata dalla prima pubblicazione di CgXII medie⁴¹. Inoltre, Na₂MoO₄ ∙ H₂O (26-104 µ g/L) e H₃BO₃ (20-80 µ g/L) sono stati inclusi come oligoelementi, come essi sono utilizzati in una variante pubblicata di CgXII media⁴².
   3. Macro elementi: MgSO₄ ∙ 7 H₂O (0,2-0,4 g/L), CaCl₂ ∙ 2 H₂O (5.3-21,2 mg/L). Questi sono stati trovati fra altri cationi bivalenti per aumentare la produzione di GFP secretiva in un altro studio¹⁴, dove è stato utilizzato c. glutamicum strain R con un diverso background medio e il peptide di segnale CgR0949 Tat.
3. Preparazione di materiali e procedure di definizione
   Nota: Si consiglia di definire e correggere i metodi sperimentali a livello dettagliato. Questa standardizzazione garantisce che risultati diversi possono essere fatta risalire a intrinseca variabilità biologica o medie diverse composizioni.
   Nota: Media soluzioni di riserva: preparare soluzioni individuali per tutti studiati componenti multimediali. Preparare scorte altamente concentrate per consentire per la diluizione di volumi diversi per tutti i componenti. Ciò significa che dopo la combinazione di tutte le soluzioni di riserva al loro volume massimo secondo il piano di progettazione, questo non può superare il volume finale di coltivazione, cfr. paragrafo "Generazione dell'elenco di pipettaggio di soluzione stock medio" passo 1.3.3. Se l'aggiunta di una soluzione altamente concentrata si traduce in un volume molto basso aggiunta, ad esempio < 1/100^th del volume finale coltivazione, diluire la soluzione madre di conseguenza. Per esempio, in questo studio un volume per il pipettaggio di meno di 10 µ l è stato definito per essere fattibile. In genere, sono più in alto concentrati come oligoelemento soluzioni 1,000fold rispetto alla concentrazione finale standard nel mezzo. È preferibile concentrarsi componenti media come multipli (X-fold) per quanto riguarda le concentrazioni nella ricetta riferimento. Così facendo, non fattibile volumi pipettaggio di frazionari decimali sono evitati. Ricette dettagliate per tutte le soluzioni di riserva di CgXII medie sono date nel documento complementare.
   1. Banca di cellule di lavoro (WCB)
      Nota: Per ogni esperimento di crescita, viene utilizzato un WCB aliquota. Se sono necessarie ulteriori aliquote, uso 100ml cervello cuore infusione (BHI) media in 1.000 mL sconcertato agitare boccette o inoculare più boccette di scossa, che si sono riuniti prima dell'aggiunta della soluzione di glicerolo.
      1. Preparare singole colonie dell'espressione ricombinante ceppo c. glutamicum pCGPhoD^Bs- GFP⁴³ su piastre di agar (polvere di BHI 37 g/L, agar 20 g/L, kanamicina 25 mg/L). Materiale di copertura possono provenire da trasformazione fresca o da un'aliquota crioconservata.

Incubare a 30 ° C fino alla comparsa delle singole colonie; Questo richiede di solito uno o due giorni.

Inoculare una cultura di boccetta di shaker (50 mL di liquido di BHI con kanamicina 25 mg/L, pallone sconcertato da 500 mL, 250 giri/min, 25 mm di diametro di agitazione, 30 ° C) con materiale di Colonia e incubare durante la notte (circa 16 h).

Un volume di sospensione cellulare risultante si combinano con un volume di 500 g/L di soluzione di glicerolo sterile e distribuire in aliquote di 2 mL in fiale sterili crioconservazione. Conservare a-80 ° C.

Protocollo di coltivazione di MBR
Nota: Per il sistema autonomo di BioLector MBR in questo studio, luce diffusa (biomassa) e fluorescenza GFP sono misure di intensità, che hanno bisogno di un certo valore di guadagno assegnato. Più alto è il guadagno, più alto è il segnale ottico viene amplificato; Questo è anche perché la diffusione della luce e fluorescenza sono misurati in unità arbitrarie (UA). Determinare i valori di guadagno adatto per il rilevamento di GFP in esperimenti preliminari, insieme adatto di frequenza di agitazione e di volume per evitare la limitazione dell'ossigeno alle più alte concentrazioni di biomassa durante le fasi successive del processo di riempimento e biomassa. Assicurate le condizioni di coltivazione autonomo ("Flowerplates", cioè, a forma di fiore MTPs 48-Beh, scuotendo la frequenza di 1.200 giri/min, volume di 1.000 µ l, 10 g/L glucosio come fonte di carbonio principale di riempimento) ossigeno illimitati coltivazioni. Per velocità di trasferimento massima di ossigeno derivanti da altre combinazioni di volumi di riempimento e scuotendo le frequenze in a forma di fiore MTPs 48-Beh, sono disponibili schede tecniche direttamente dall'offerente. Inoltre, difetti di crescita delle singole culture possono verificarsi a causa di basse quantità di substrati secondari (per esempio, azoto, oligoelementi). Pertanto, controllare le concentrazioni di biomassa all'estremità delle coltivazioni. In questo studio, sono stati osservati senza tali effetti di crescita.

1. Definire il protocollo di coltivazione per il sistema MBR ("BioLector") come segue:
2. The 1: Biomassa, guadagno 14. The 2: pH, guadagno è preimpostato. The 3: pO2, guadagno è preimpostato. 4: GFP, guadagnare 80.
3. Frequenza di agitazione: 1.200 giri/min.
4. Temperatura: 30 ° C.
5. Tempo di ciclo: 15 min.
6. Tempo di esperimento: manuale (coltivazione non si fermerà automaticamente).

Generazione dell'elenco di pipettaggio di soluzione stock medio
Nota: Quasi qualsiasi liquido robot sistema di movimentazione è in grado di leggere il pipettaggio azioni da file esterni. Fondamentalmente, le informazioni minime necessarie sono il volume di trasferimento e la posizione della sorgente di reagente, così come la destinazione di ciascuno rappresentato da una posizione di labware sul ponte robotico e una cavità specifica all'interno degli oggetti dal laboratorio. Tuttavia, diverse sintassi per liquidi diversi sistemi di movimentazione devono essere considerate. La figura 2 Mostra una struttura di file di esempio per il sistema di pipettaggio impiegato in questo studio.

1. Quattro tipi di soluzioni di riserva sono pipettati in ogni coltivazione ben:
   1. Soluzioni di componenti di media che sono di riserva varia ("Variazione delle scorte").
   2. Acqua per compensare differenti volumi cumulativi di sopra delle scorte.
   3. Una soluzione di riserva ("Resto Stock") contenente tutti i componenti che sono stati corretti. Questa soluzione può essere composta dalle scorte contenenti i diversi componenti che sono, per esempio, conservato a temperature diverse o sterilizzato con metodi diversi.
   4. Inoculo, che dovrebbe essere aggiunto come ultimo componente e mettere sul tavolo di lavoro appena prima dell'aggiunta per evitare la sedimentazione delle cellule.
2. Per coltivazione Beh, calcolare i volumi da trasferire per tutte le componenti multimediali secondo:
   
   Il volume da aggiungere per alcuni forse Variazione scorte zero, vale a dire, quando questa componente specifico viene omesso.
3. Rivedere tutti i volumi calcolati V_ho per numeri adatti. Pipettaggio con incrementi di volume nei passaggi a volume non devono essere troppo piccoli. Se necessario, regolare le concentrazioni di Variazione delle scorte. Per esempio, il volume minimo di pipettaggio qui è stato definito come 10 µ l, e l'incremento minimo è stato definito come 5 µ l. In generale, questi volumi devono essere definiti sulla base determinato sperimentalmente precisione e accuratezza per la stazione^15,44componenti liquidi usati.
4. Calcolare il volume del Resto Stock contenente i componenti fissi per tutti i pozzetti come segue:
   
   dove il volume cumulativo massimo di Variazione Stock viene utilizzato. Di conseguenza, calcolare le concentrazioni necessarie dei componenti fissi in Stock di resto come segue:
   
   Preparare il Brodo di resto di conseguenza.
5. Per coltivazione Beh, calcolare il volume di acqua per essere aggiunto come segue:
   
6. Per coltivazione ben, elenco tutti i volumi da aggiungere nel seguente ordine di addizione: V_H2O, V_RestStock, V_ho, V_Inok. Formattare il pipettaggio elenco secondo le specifiche del liquido Gestione stazione, come mostrato per un esempio in Figura 2.

Cultura di seme, preparazione automatizzata dei terreni e inizio della cultura principale

1. Creare un protocollo per il robot di manipolazione dei liquidi. Vedi Figura 3 e Figura 4 per un protocollo di esempio per un sistema di "Janus", implementato in software "WinPREP" corrispondente. Il protocollo dovrebbe considerare i seguenti aspetti:
   1. Includono un runtime sufficiente dell'alloggiamento sterile prima della preparazione dei terreni.
   2. Includere un iniziale eccessiva pulizia e lavaggio di tutti i suggerimenti di pipettaggio e tubazione.
   3. Scegliere contenitori da laboratorio appropriato per soluzioni di riserva. Qui, pozzi profondo piatti con 12 colonne sono idonei allo stoccaggio delle Scorte di variazione, come tutte le otto consigli di pipettaggio possono immergere in una disposizione parallela nelle colonne del bene. Questo accelera notevolmente preparazione media. Se provette da 15 mL o 50 mL sono utilizzate come serbatoi, solo un suggerimento di pipettaggio può immergere in una sola volta in esso.

Per gli altri stock come acqua e Resto Stock, depressioni di 100 mL sono usati, come queste soluzioni richiedono maggiori volumi in totale.

Fornire un sufficiente volume totale per ogni soluzione di riserva compensare il volume dei rifiuti, gli offset di pipettaggio di altezza, ecc.

Inserire un prompt utente prima del passaggio di inoculazione, garantendo che questo passaggio avvenga immediatamente prima della procedura di coltura del seme.

Preparare tutte le soluzioni di riserva in maniera sterile e negozio fino all'utilizzo, in appositi contenitori, ad esempio, sterile 15 mL e 50 mL provette.

Sterilizzare le piastre di pozzo profondo per la conservazione della soluzione di riserva su un tavolo di lavoro, ad esempio, strofinando con etanolo al 70% e successiva asciugatura in cappa a flusso laminare.

Avviare la cultura di seme inoculando 50 mL liquido di BHI contenente kanamicina 25 mg/L con un'aliquota dal WCB. Prima la coltivazione di MBR, preparare fresca, vitale inoculo da colture di semi in una quantità sufficiente in crescita esponenziale.

Mettere tutte le atrezzature necessarie sul piano robotico e versare soluzioni di riserva degli oggetti dal laboratorio corrispondente.

Avviare il flusso di lavoro robotizzato per la preparazione di supporti, in modo che l'ultimo passo (inoculazione), viene raggiunto in tempo con l'inizio della cultura di seme. Il tempo di esecuzione totale del flusso di lavoro robotizzato deve essere valutato in precedenza. Qui, il tempo di esecuzione totale era circa 1,5 h.

Assaggiare la cultura di seme dopo circa 2 h, poi ogni ora, per monitorare la crescita di densità ottica (OD₆₀₀). Dopo circa 5 h, la cultura raggiunge 3-4 OD₆₀₀ e viene utilizzata per inoculare le principali culture.

Mettere la coltura di sementi sul piano liquido gestore e continuare il protocollo di preparazione media. Guarnizione di coltivazione MTP dopo l'inoculazione.

Posizionare la coltivazione sigillata MTP nel dispositivo BioLector e avviare il protocollo pre-definita di coltura.

Smaltire le soluzioni stock rimanente, secondo norme di biosicurezza, se necessario e la cultura dal worktable robotico del seme. Pulire l'attrezzatura di laboratorio riutilizzabile e avviare il protocollo di decontaminazione gestore liquido.

Quantificazione di prodotto e di pre-elaborazione dei dati grezzi per l'analisi

1. Interrompere la cultura principale dopo un runtime 17h.
2. Trasferire i dati di misurazione da BioLector MBR dispositivo al computer collegato utilizzando il pacchetto software BioLection secondo il manuale d'uso del produttore.
3. Uso la "gestione dei dati → trasformare dati" funzione del pacchetto software "BioLection" che accompagna il sistema MBR per convertire il file di dati raw in un formato di foglio di calcolo di facile accesso. Copiare i dati del segnale GFP per tutti i pozzi di coltivazione dalla colonna timestamp più vicina al 17 h. identificare la GFP segnali dai pozzi di coltivazione di riferimento e la media. Normalizzare tutti i rimanenti segnale GFP segnale di riferimento medio.
4. Quantificare il titolo GFP usando metodi aggiuntivi (se richiesto)
   1. Trasferire le sospensioni delle cellule da tutti i pozzetti di coltivazione in provette di reazione prelabeled e ottenere il supernatante senza cellula dopo centrifugazione per 10 min alla massima velocità utilizzando una centrifuga da banco.
   2. Trasferire 200 µ l di ciascun supernatante senza cellula in un nero MTP 96 pozzetti con fondo trasparente, e leggere la fluorescenza di GFP specifica a 488/520 nm utilizzando un lettore di micropiastre appropriato. Normalizzare il segnale GFP da tutti i pozzetti con segnale medio da coltivazioni di riferimento, come descritto al punto 1.5.3.
      Nota: I segnali di fluorescenza di GFP assoluti non possono essere paragonati per dispositivi di misurazione differenti. Di conseguenza, i 5 ceppi di riferimento da tutte le principali colture servono come standard interno. Il miglioramento del titolo GFP può essere espresso in relazione a standard interno. In questo modo per il confronto di risultati dagli esperimenti diversi e diversi metodi di quantificazione di GFP (vedere due passaggi successivi).
   3. Determinare il contenuto proteico dei surnatanti senza cellula con protocolli standard, ad es., analisi di Bradford o BCA. In combinazione con i risultati del passaggio 2, è possibile la determinazione di un titolo GFP specifica proteine.
      Nota: Dopo la misurazione della fluorescenza, utilizzare l'esempio direttamente da questo micropiastra. Uso di pipette multicanale facilita notevolmente la liquidi necessaria passaggi.
   4. Eseguire una visualizzazione di SDS-Page dei surnatanti senza cellula seguendo protocolli standard per verificare che la maggior parte del contenuto proteico aumento è dovuto la secrezione aumentata di GFP.
      Nota: SDS-Page è più laborioso rispetto ai metodi menzionati in precedenza, soprattutto con un carico di campionamento elevate. Ai fini della verifica, è spesso sufficiente eseguire che SDS-pagine dei surnatanti senza cellula da riferimento medio e finale ottimizzato coltivazioni medie¹⁵.

2. sensitivity Analysis (Figura 1: parte B).

Nota: L'obiettivo di questa parte è quello di identificare i fattori importanti che hanno un effetto significativo sull'obiettivo.

1. Scegliere un intervallo di concentrazione iniziale di componenti multimediali. La composizione media di riferimento dovrebbe trovarsi all'interno delle gamme di concentrazione selezionate.
2. Scegliere un'appropriata DOE. Tali disegni sono reperibili in letteratura, per esempio, dal NIST/SEMATECH e-manuale di metodi statistici (disponibile presso www.itl.nist.gov/div898/handbook/pri/section3/pri3347.htm). Il disegno scelto dipende dal numero di componenti multimediali di interesse (qui, 11) e il numero degli esperimenti effettuati (qui, 32). Nell'esempio dato, disegno "2_IV^11-6" è stato scelto che si traduce in 32 esperimenti e permette la stima dell'effetto dell'aumento della concentrazione di una delle undici componenti sull'obiettivo di interesse. Per essere più precisi, gli effetti principali non sono confusi con interazioni tra i fattori pairwise. Possono essere confusi con le interazioni di ordine superiore che sono, tuttavia, molto probabilmente non significativo.
3. Utilizzare i restanti pozzetti (qui, 16) per l'esecuzione di ripetizioni multiple con il mezzo di riferimento per valutare la riproducibilità del processo. Replica dovrebbe essere equamente ripartita sopra la piastra di scoprire effetti posizionali. Il valore medio dell'output misurato dagli esperimenti di riferimento viene utilizzato per la normalizzazione. Cioè, ogni uscita misurata di analisi di sensibilità è diviso per il valore medio dell'output di riferimento.
4. Calcolare il principale e se possibile gli effetti combinatoriali utilizzando software di statistiche appropriate. Il design classico dell'esperimento è basato su un' approssimazione polinomiale⁴⁵. Per esempio, il mvregress di funzione MATLAB può essere utilizzato per la stima dei coefficienti polinomiali.

La funzione di mvregress fa parte delle statistiche e della casella degli strumenti di apprendimento automatico.

Identificare gli effetti rilevanti dei vari componenti di media sull'obiettivo utilizzando un test t. Nell'esempio, NH₄⁺ ha un significativo effetto negativo e Ca^{2 +} e Mg^{2 +} Visualizza i più forti effetti positivi (Figura 5). Perché il segnale GFP è stato normalizzato, i coefficienti rappresentano la variazione relativa media del segnale di GFP quando si aumenta la concentrazione del componente particolare rispetto al valore di centro, , al suo valore massimo.

Componenti fissi senza un effetto rilevante sono al loro valore di riferimento durante l'ottimizzazione.

3. iterativo ottimizzazione (Figura 1: parte C)

Nota: lo strumento MATLAB KriKit è stato utilizzato per l'interpretazione e l' analisi di dati statistici³⁶. KriKit consente all'utente di costruire un modello di Kriging basate sui dati. Questo modello Kriging predice la relazione funzionale tra i componenti multimediali e l'obiettivo. Fornisce inoltre informazioni sull'incertezza di previsione. Elevata incertezza indica dati rumorosi e/o densità di dati insufficienti.

1. DOE
   Nota: Nuovi esperimenti in modo iterativo sono progettati, sulla base dei risultati dell'esecuzione precedente.
   1. Nella prima iterazione, progettare nuovi esperimenti per indagine dettagliata dei componenti identificati media di interesse. Risultati sperimentali da sezione 2 non possono essere trasferiti all'ottimizzazione iterativa (sezione 3), come le concentrazioni dei componenti senza effetti rilevanti sono ora fissate per il valore di riferimento. Di conseguenza, gli esperimenti dell'analisi di sensibilità e l'ottimizzazione iterativa non sono paragonabili.
   2. In caso contrario, seguire lo schema illustrato nella Figura 1, telaio "Ottimizzazione iterativa". Se il potenziale ottima si trova all'interno dell'intervallo di concentrazione definita, nuovi esperimenti sono progettati utilizzando il miglioramento previsto^40,46. Il disegno sperimentale basato sul miglioramento previsto è integrato nel pannello degli strumenti KriKit. Se l'optimum si trova sul confine, ampliare la gamma di concentrazione.
2. Eseguire esperimenti presso i punti campione progettato secondo metodi sperimentali definiti nella sezione 2.
3. Analisi statistica
   1. Costruire un modello di Kriging usando i dati combinati da tutte le iterazioni, tra cui la corrente.
   2. Esaminare l'output del modello di visualizzazione utilizzando gli strumenti completi di KriKit (interpolazione 2/3D, analisi di film, lo screening di trama, ecc.).
4. Se un'area ottima è stata stimata con sufficiente precisione, smettere di ottimizzazione. In caso contrario, continuare con il passaggio 3.1.
   Nota: La figura 6 illustra l'ottimizzazione iterativa per lo studio di prova. La gamma di concentrazione è stato successivamente ampliata fino a un altopiano è stato trovato (iterazione 1-6). L'iterazione di settimo è stato utilizzato per esplorare i confini più dettagliatamente.

4. Verifica dei risultati (Figura 1: parte D)

Nota: Dopo aver terminato l'ottimizzazione iterativa, le ipotesi iniziali devono essere verificata la validità.

1. Ripeti analisi di sensitività (sezione 2) per la composizione media ottimale. Cioè, le concentrazioni dei componenti che vengono studiati in Figura 1 (parte C) sono fissate ai valori ottimali. Le concentrazioni di altri componenti sono variate secondo un'appropriata DOE.
   Nota: Risultati simili in entrambi proiezioni indicano che i livelli di concentrazione dei componenti studiati non alterano l'effetto degli altri componenti. Se lo screening evidenzia le differenze significative ai risultati da parte B, componenti con un effetto modificato devono essere aggiunto al pool di componenti studiati e parte C deve essere ripetuta.
2. In caso di misurazione indiretta (ad es., fluorescenza come indicatore per la concentrazione del prodotto), si applicano metodi di misurazione ortogonali (ad es., analisi di attività, Bradford o quantificazione della proteina BCA, SDS page) per confermare la modifica in L'obiettivo di interesse confrontando i risultati dal mezzo di riferimento e il medio ottimizzato¹⁵.

Results

Il protocollo introdotto è stato applicato per massimizzare il titolo di GFP secrete. In particolare, il titolo GFP dopo 17h di coltivazione è stato scelto come l'obiettivo di ottimizzazione. Rilevazione della fluorescenza online di GFP ammessi quantificazione semplice prodotto. Tuttavia, la normalizzazione del segnale GFP con dati da una coltura di riferimento è indispensabile per garantire la riproducibilità e la comparabilità dei risultati. Una pre-selezione di componenti multimediali è stata effettuata su una base razionale, come descritto nella sezione 1. Gli esperimenti sono stati effettuati seguendo le istruzioni della sezione 1: sono stati definiti i parametri delle procedure di laboratorio bagnato per lo studio di tutto assicurando la coerenza e la riproducibilità dei risultati.

Come descritto nella sezione 2, è stato effettuato un primo screening per l'identificazione di componenti rilevanti mostrano un impatto significativo sull'obiettivo ottimizzazione per lo studio ulteriore e più dettagliato. Il sistema MBR basati su MTP permette 48 esperimenti per essere eseguite in parallelo. Tenendo conto del massimo numero possibile di esperimenti paralleli su un MTP (48) e il numero totale di marche di supporti componenti (11) il 2_IV^11-6 frazionario progettare una scelta appropriata. Questo disegno sperimentale comprende 32 esperimenti e permette la stima dell'effetto principale per ciascuno dei componenti multimediali studiati. I restanti pozzetti di coltivazione (16) sono stati utilizzati per più ripetizioni di esperimenti con il mezzo di riferimento per valutare la riproducibilità ed effetti posizionali. Cioè, ogni esperimento è condotto una volta (non repliche), salvo l'esperimento di riferimento (cinque repliche).

La tabella 1 riassume i risultati dell'analisi di screening. Nella gamma di concentrazione considerata, variando la maggior parte dei componenti media non ha mostrato un effetto evidente sull'obiettivo. Componente di NH₄⁺ Mostra un forte effetto negativo, mentre Ca^{2 +} e Mg^{2 +} mostrano la più forte tendenza positiva. L'effetto di Mg^{2 +} non è significativo per l'attuale gamma di concentrazione, ma potrebbe essere per una più ampia gamma di concentrazione. Di conseguenza, è stato deciso di omettere NH₄⁺ dal mezzo e per studiare l'effetto di Ca^{2 +} e Mg^{2 +} in ulteriori esperimenti.

Sezione 3 descrive la procedura di ottimizzazione iterativa che viene utilizzata per massimizzare il segnale di fluorescenza di GFP pur variando le concentrazioni di Ca^{2 +} e Mg^{2 +}. Nell'iterazione 1, è stato testato l'ipotesi che NH₄⁺ può essere omesso. L'intervallo di concentrazione per Ca^{2 +} e Mg^{2 +} è stato adottato dall'analisi di screening. La concentrazione minima di NH₄⁺ è stata impostata su zero e la concentrazione massima è stata adottata dall'esperimento lo screening. Nei seguenti esperimenti, le concentrazioni di componente sono state distribuite sopra un 3 × 3 × 3 griglia all'interno dell'intervallo di concentrazione definita, con conseguente 27 esperimenti. Durante tutte le colture, cinque repliche di medie di riferimento sono stati inclusi, che ha servito come standard interno e per garantire che si è verificato nessun effetti posizionali sopra il MTP. Per i restanti 16 pozzetti, le concentrazioni di NH₄⁺, Ca^{2 +}e Mg^{2 +} sono state distribuite in modo casuale all'interno delle gamme data.

Figura 5 A Visualizza i risultati delle prime iterazioni. Le etichette dell'asse si riferiscono alle concentrazioni componente utilizzate nel mezzo di riferimento originale, indicato dalla x Ref. Le superfici blue rappresentano le interpolazioni Kriging che sono state calcolate utilizzando il software KriKit. Ogni superficie è associato un livello di concentrazione relativa per NH₄⁺ (blu scuro: 0 x Ref, a scacchi: 1 x Ref, blu chiaro: 2 x Ref). Questa rappresentazione visiva rivela che è favorevole per omettere NH₄⁺. Superfici di interpolazione mostrano anche gli effetti positivi di Mg^{2 +} e Ca^{2 +}, come tutti gli aerei aumento con concentrazioni crescenti.

Sulla base dei risultati dell'iterazione 1, si decise di espandere la concentrazione gamma di Ca^{2 +} e Mg^{2 +} raddoppiando le concentrazioni massime e spostando la finestra di progettazione sperimentale verso l'angolo superiore destro, vedere la Figura 5 B. all'interno di questa gamma, le concentrazioni sono state distribuite su una 6x6 griglia. Ciò garantisce una distribuzione uniforme sopra la gamma di piena concentrazione, portando a risultati ottimali di interpolazione Kriging. Figura 5 B Mostra la trama di interpolazione Kriging basata su dati combinati misurato in entrambe le iterazioni (puntini rossi e quadrati gialli). Per entrambi, Ca^{2 +} e Mg^{2 +}, continua l'effetto positivo delle loro concentrazioni aumentanti. Di conseguenza, la procedura è stata ripetuta raddoppiando la massima concentrazione e così, la finestra di progettazione sperimentale è stata spostata per esplorare i confini dell'angolo superiore destro.

Figura 6 A dà una panoramica della procedura di ottimizzazione rimanenti. L'analisi del set di dati raccolti fino a iterazione 3 ha rivelato che una limitazione dell'effetto positivo di Mg^{2 +}, cioè, una concentrazione ottimale gamma di Mg^{2 +} è stata identificata. Si decise pertanto di ampliare ulteriormente la gamma di concentrazione solo per Ca^{2 +} (iterazione 4). Questa procedura è stata ripetuta due volte (iterazione 5 e 6) fino a quando non è stata trovata una saturazione del segnale GFP. Questa saturazione è spiegata dalla precipitazione di sali di Ca per le concentrazioni applicate di Ca^{2 +}, che non sono disponibili per le cellule.

Come risultati sperimentali sono sempre turbati dal rumore, l'interpolazione Kriging risultante appare irregolare e ispezione visiva potrebbe condurre a conclusioni false. Tuttavia, la gamma di concentrazione ottimale di componenti multimediali per il segnale GFP saturo può essere identificata attendibilmente con lo statistica z -test, che viene inoltre implementato in KriKit. Il test z -utilizza direttamente le intrinseche informazioni statistiche fornite da Kriging metodo, cioè, i valori di previsione e incertezze di pronostico. Figura 6 B Mostra l'altopiano identificato, come determinato e visualizzati utilizzando KriKit casella degli strumenti.Casella degli strumenti KriKit è liberamente disponibile³⁶ e viene fornito con un dettagliato tutorial che spiega come utilizzare le sue caratteristiche.

Se vengono trovati più di due componenti rilevanti, visualizzazione 3D raggiunge il limite. KriKit fornisce diversi altri metodi di rappresentazione visiva possibile quali film o "trama di screening". Se il potenziale ottima si trova all'interno dell'intervallo di concentrazione definita, nuovi esperimenti automaticamente sono progettati utilizzando il miglioramento previsto^40,46. Il disegno sperimentale basato sul miglioramento previsto è integrato nel pannello degli strumenti KriKit. Informazioni più dettagliate si trovano nella documentazione del software.

Dopo la procedura iterativa, è stata condotta una verifica dei risultati, come descritto nella parte D. La validità dell'ipotesi iniziale era controllata eseguendo un'analisi di sensibilità aggiuntivi utilizzando la composizione media ottimale. Cioè, tutti i componenti di media iniziale di interesse sono state varie, ma Ca^{2 +} e Mg^{2 +} sono stati impostati i livelli di concentrazione ottimale. In questo studio, le concentrazioni ottimali = 32 x Ref e = 6,8 x Ref sono stati scelti. La tabella 2 Mostra i risultati dello screening convalida. Simile alla sensibilità iniziale di screening (cfr. tabella 1), NH₄⁺ ancora ha una notevole influenza negativa e restanti effetti sono ancora trascurabili.

Grazie al facile accesso, il segnale di fluorescenza di GFP dalla sospensione di coltivazione è stato utilizzato per quantificare il titolo GFP extracellulare durante tutti gli esperimenti. Per motivi di verifica, fluorescenza GFP è stata convalidata contro altre misurazioni. Perché GFP è secreta via la via di Tat, il segnale di fluorescenza non può discriminare tra intra - ed extracellulare GFP. Così, coltivazioni sono state riprodotte utilizzando il mezzo di riferimento e il supporto ottimizzato. Oltre alla misura di fluorescenza da surnatanti di coltura senza cellula, contenuto proteico è stato quantificato dall'analisi di Bradford e (semi)-miglioramento qualitativo di GFP visualizzata da SDS-Page¹⁵. Misura risultante tutti i segnali erano approssimativamente raddoppiato per coltivazioni con mezzo ottimizzato rispetto alle medie di riferimento e convalidato i circa 100% di miglioramento delle prestazioni di secrezione del mezzo ottimizzato. Di conseguenza, la fluorescenza specifica GFP della sospensione di coltivazione può essere considerata una metrica adatta per l'obiettivo di ottimizzazione, vale a dire, il titolo GFP extracellulare.

Figura 2 : Screenshot dall'elenco per analisi di sensitività pipettaggio volume. Le voci nella prima colonna assegna un identificatore univoco a tutti i volumi di una riga; Questo identificatore è il MTP ben numero della coltivazione destinazione MTP sul piano liquido gestore, cfr . Figura 4C. Restanti colonne encode volumi per diverse soluzioni ("Sln-01" a "Sln-15") per essere dispensato. Il volume cumulativo di una riga corrisponde al volume finale di coltivazione del corrispondente bene. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : Screenshot dal liquido gestione software di controllo "WinPREP". Sinistra: Ordinato da riga comandi, tra cui un comando di trasferimento per ogni soluzione di riserva essere dispensato. Prima il comando finale per aggiunta di inoculo, è inserito un prompt utente affinché che la cultura di seme è posto al tavolo giusto in tempo. A destra: Disegno schematico del worktable, compresi l'attrezzatura di laboratorio di origine per variazione delle scorte (due piastre pozzi profondo con 12 pozzetti colonna-like), il trogolo di reagente per resto Stock, acqua e inoculo e la coltivazione di destinazione di preparazione media MTP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 : Compilazione delle schermate dettagliate per l'installazione del pipettaggio di una soluzione di riserva. (A) comando per il pipettaggio di Stock in Fe da scartare. Labware fonte e origine ben all'interno sono contrassegnati sul piano di lettura telaio e colonna rossa della piastra pozzo profondo corrispondente. Labware destinazione e pozzi di destinazione all'interno sono contrassegnati dal telaio blu intorno e blu pozzi della coltivazione destinazione MTP. (B) Vedi esempio dettagliato su incarico di pipettaggio volumi per questo passaggio (soluzione Fe). Numero di destinazioni viene letto dall'elenco pipettaggio, quale ha 48 righe. I volumi di erogazione per tutti i pozzi di destinazione per la soluzione Fe è individuato nella colonna 4 l'elenco pipettaggio. Si noti che la prima colonna nell'elenco pipettaggio contiene gli identificatori e non volumi per essere trasferiti, Vedi Figura 2. (C) Dettagli sulla destinazione ben numerazione. Volumi scritti nella riga #1 dell'elenco pipettaggio corrispondente verranno essere pipettati in pozzo contrassegnato come #1 e così via. Wells #01, #08, #41 e #48 corrispondono a pozzi A01, A08, F01 e F08 per la codifica alfa-numerico, che è anche stampato in coltivazione MTP stessa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5 : Risultati dalla prima iterazione dettagliati. (A) interpolazione Kriging basata su dati sperimentali di iterazione 1. Punti rossi indicano il set di dati. Per confronto, tutte le superfici di interpolazione tre sono sovrapposti in una trama (blu scuro: 0 x Ref, a scacchi: 1 x Ref, blu chiaro: 2 x Ref). Una rappresentazione alternativa dei risultati può essere trovata altrove¹⁵. (B) interpolazione Kriging basata sugli esperimenti eseguiti in iterazione 1 (punti rossi) e iterazione 2 (quadrati gialli).Parti dei dati presentati in questa figura sono stati precedentemente pubblicati¹⁵. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6 : Rappresentazione dei risultati di ottimizzazione in modo iterativo raccolti. Kriging finale (A) modello di previsione. (B) Identificazione statistica dell'area ottima (rosso) basato sulla statistica z-test, che è fornito da KriKit. Riquadri indicano le fasi successive di progettazione iterativa ed esecuzione degli esperimenti. Parti dei dati presentati in questa figura sono stati precedentemente pubblicati¹⁵. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Componente	Valore medio coefficiente normalizzato
Fe2 +	-0,08
MN2 +	-0,05
Zn2 +	-0.21
Cu2 +	-0.21
NH4+	-2.04
NI2 +	-0.11
Co2 +	-0,10
MoO42-	0,03
BO33-	0,06
CA2 +	1.00
Mg2 +	0.45

Tabella 1: risultati delle analisi di sensibilità. Valori del coefficiente che rappresenta l'effetto medio quando si aumenta la concentrazione del componente rispettivi media rispetto al valore di centro al suo valore massimo. Per ottimale disegni sperimentali, come trovato in letteratura standard e utilizzato qui, la deviazione standard rappresenta direttamente la variazione sperimentale a causa della replica dell'esperimento di riferimento. Valori del coefficiente sono stati normalizzati dal valore maxium (0,0422 per componente Ca^{2 +}). Deviazione standard coefficiente normalizzato e assoluto è 0.54 e 0.0226, rispettivamente.

Componente	Valore medio coefficiente normalizzato
Fe2 +	-1.00
MN2 +	1.00
Zn2 +	-3.48
Cu2 +	-0,52
NH4+	-15.95
NI2 +	0,69
Co2 +	-0,51
MoO42-	-0,45
BO33-	-1.11

Tabella 2: risultati delle analisi di sensibilità finale. Valori del coefficiente che rappresenta l'effetto medio quando si aumenta la concentrazione del componente rispettivi media rispetto al valore di centro al suo valore massimo. Come è stato utilizzato un disegno sperimentale Ottimo, la deviazione standard dipende solo la variazione sperimentale utilizzando la composizione media ottimizzata. Variazione sperimentale è leggermente aumentato rispetto la variazione utilizzando il mezzo di riferimento. Valori del coefficiente sono stati normalizzati dal valore maxium (0.0106 per componente Mn^{2 +}). Deviazione standard coefficiente normalizzato e assoluto è 3.63 e 0.0385, rispettivamente.

Discussion

Il carattere generico del protocollo presentato permette vari adattamenti, ad esempio, per studiare altri espressione microbica ospita^{9,47,48,49,50, 51}, o per ottimizzare altre proprietà della proteina dell'obiettivo, come le obbligazioni di pattern o bisolfuro di glicosilazione. Il protocollo inoltre devono essere adattati per l'attrezzatura di laboratorio disponibili. L'integrazione di un sistema MBR permette di aumentare il throughput sperimentale, che consente un grande risparmio nel tempo. Tuttavia, quando sostituisce completamente strumentati e controllabile bioreattori di sistemi MBR, scalabilità dei risultati deve essere considerata^8,37,52,53. L'utilizzo di metodologie DOE e modellazione matematica aiuta a massimizzare il contenuto informativo dei dati di misurazione rispetto l' oggettiva studiati⁵⁴ da un'efficiente pianificazione sperimentale e interpretazione di dati basati su modello¹⁵.

Modifiche al metodo
Accanto a multi-purpose ed espandibile robotica manipolazione dei liquidi sistemi come quello utilizzato in questo studio, va ricordato che ci sono parecchi più piccolo liquido sistemi disponibili in commercio che sono in grado di eseguire questa operazione e possono essere inseriti all'interno di movimentazione di banchi di lavoro a flusso laminare. Se nessun sistema di pipettaggio automatizzato è disponibile, composizioni di diversi media secondo il disegno DOE possono essere realizzate anche pipettando manuale utilizzando pipette mono e/o multi-canale. Poiché la preparazione manuale è più soggetto a errori e richiederà un lavoro altamente concentrato per un tempo abbastanza lungo, si consiglia di preparare un numero inferiore di composizioni di diversi media.

A seconda delle capacità del sistema MBR autonomo, varierà il corrispondente protocollo di coltivazione. Ad esempio, se non è disponibile alcuna misurazione online di formazione di biomassa, può essere sufficiente a misurare la concentrazione di biomassa dopo il completamento dell'esperimento di crescita. In combinazione con monitoraggio on-line il pH e l'ossigeno disciolto, che viene implementato in diversi sistemi MBR, la saturazione di crescita può essere determinata in modo sicuro. In linea di principio, gli esperimenti di crescita possono essere condotti in MTPs da solo collocato all'interno di agitazione incubatori, senza l'uso di un sistema MBR. In questo caso, le condizioni di corretta coltivazione necessario garantire: (1) ossigeno limitato coltivazioni possono essere evitato utilizzando MTPs con geometrie adatte, in combinazione con adeguata agitazione frequenze e scuotendo diametri, ad esempio, Piazza 96 o 24 profonda piatti ben operato a 1.000 giri/min a tiro di 3 mm o a 250 rpm a passi di 25 mm, rispettivamente. D'importanza, più basso i tassi di trasferimento di ossigeno massimo realizzabile, minore sarà la fonte principale di carbonio deve essere concentrata. Come accennato in precedenza, per questo studio, l'uso di 10 g/L glucosio era idoneo a prevenire la limitazione di ossigeno per le condizioni di coltivazione impiegato; (2) il campionamento delle culture MTP per quantificazione biomassa e prodotto dovrebbe essere ridotto al minimo. Ogni volta che il MTP è rimosso dall'incubatrice agitazione, trasferimento di ossigeno sarà immediatamente ripartizione che può provocare condizioni di coltivazione sfavorevole; (3) nel parere degli autori, l'uso dei lettori MTP come dispositivi di coltivazione non è raccomandato come questi dispositivi non sono stati sviluppati per questo scopo. Ad esempio, agitazione meccanica sono stati costruiti per la miscelazione occasionale di micropiastre dopo l'aggiunta del reagente e così, spesso mancanza di robustezza per lunghe percorrenze di agitazione continua durare per giorni. Inoltre, non può essere realizzato sufficienti input di alimentazione necessario per colture microbiche in questi lettori. L'integrazione delle letture di densità ottica in breve intervalli di tempo richiede arresto del movimento d'agitazione, conseguente a ripetuti periodi di prescrizione di ossigeno. Inoltre, evaporazione in tali sistemi su periodi lunghi coltivazione sarà falsare i risultati. Per maggiori dettagli sull'argomento sorprendentemente complesso sull'utilizzo MTPs per colture microbiche, si rimanda il lettore alla letteratura citata^{22,23,24,25,26} e bibliografia citata.

Ulteriori considerazioni
Per fasi di ottimizzazione iterativa di Speed-up, si consiglia di selezionare con attenzione il metodo analitico per la quantificazione del prodotto. Veloci e semplici metodi dovrebbero essere preferiti al costo di precisione e accuratezza, come la strategia di disegno sperimentale iterativo tollera sperimentale inesattezza. Tuttavia, i risultati finali devono essere verificati contro metodi di quantificazione del prodotto sufficientemente precise ed accurate che potrebbero essere più complicati. In generale, un'attenta valutazione e il processo decisionale circa le procedure di studio richiedono impegno all'inizio dello studio, ma pagare a lungo termine, dopo i metodi di routine sono stati stabiliti.

Si consiglia di definire un esperimento di riferimento che è rispetto a tutti gli esperimenti durante l'ottimizzazione. Cioè, le concentrazioni medie applicate componente così come uscita misurata è normalizzato tramite dividendo per i valori di riferimento. In questo modo, ciascuno applicato e il valore misurato può essere interpretato come la x-piega del valore di riferimento. Per tener conto delle variazioni tra le piastre, cinque esperimenti di riferimento vengono eseguiti su ogni piatto. Il valore medio dei risultati misurati viene utilizzato per la normalizzazione.

Non può generalmente essere garantito che il mezzo sviluppato è anche ottimo per altri ceppi. Tuttavia, il mezzo migliore probabilmente sarà anche appropriato per coltivare ceppi di espressione con piccole differenze genetiche, per esempio, quando produrre varianti di enzima con singolo amminoacido sostituzioni ottenuti da (studi di mutagenesi anche se per effetto di metabolismo cellulare e l'espressione eterologa prestazioni^55,56, sono state descritte anche singole mutazioni puntiformi). In questo caso, il protocollo presentato può essere un primo passo, seguito da protocolli per espressione high-throughput screening⁵⁷. Se il protocollo viene utilizzato per lo sviluppo medio con successiva scala-fino a coltivazioni di fed-batch, il supporto ottimizzato deve essere verificato per le corrispondenti condizioni di bioprocessi, come clone campagne a Microscala di screening identificato diversi top interpreti per diverse strategie d'alimentazione e coltivazione media^52,58. Inoltre, l'introdotto KriKit³⁶ generalmente possono contribuire alla ottimizzazione migliorata bioprocessi olistico.Solo di recente, le abilità di strumento sono estesi per supportare anche ottimizzazione multi-obiettivo⁴⁰, che può essere importante per l'ottimizzazione di entrambi i processi a Monte e a valle^59,60.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioLector	m2p-labs	G-BL-100
Flowerplate	m2p-labs	MTP-48-BOH	Per la coltivazione nel dispositivo BioLector
Foglio sigillante	m2p-labs	F-GP-10	Sigillatura sterile per Flowerplate
MATLAB	Mathworks	2016b
KriKit	Forschungszentrum Jü lich	n/a	Disponibile gratuitamente, è richiesta l'installazione di MATLAB
Robot di pipettaggio Janus	Perkin Elmer	n/a	Include l'installazione del software "WinPrep"
Micropiastra a pozzetti profondi a 12 colonne	E& K Scientific	EK-2034	Contenitore per soluzioni stock medie
Micropiastre a 96 pozzetti, trasparente, F-bottom	Greiner	655101	Per il dosaggio delle proteine Bradford
µ micropiastre trasparenti a 96 pozzetti, corpo nero, fondo F trasparente	Greiner	655087	Per la misurazione della fluorescenza in surnatanti privi di cellule
Ricerca su pipette  più pipette multicanale	Eppendorf	n/a	Facilita la manipolazione manuale dei liquidi con micropiastre
TruPAG  Gel prefabbricati	Sigma	PCG2002	Per l'analisi SDS-Page di supernanti privi di cellule
Bradford Reagente	Sigma	B6916
C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP	n/a	n/a Trasporta	plasmide pEKEx2 con fusione del gene GFP e del peptide del segnale PhoD da B.subtilis come inserto di espressione. Il plasmide fornisce resistenza alla kanamicina. Descritto e pubblicato da Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633– 42 (2007)