I oligodendrocytes myelinating promuovono la propagazione del potenziale d'azione rapida e la sopravvivenza neuronale. È descritto qui un protocollo per l'espressione del oligodendrocyte-specific di proteine fluorescenti in organotipiche fette del cervello con formazione immagine successiva di time-lapse. Inoltre, una procedura semplice per la visualizzazione non macchia mielina è presentata.
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Articolo metodologico
Visualizzazione e Live Imaging del Oligodendrocyte organelli in fettine di cervello Organotypic utilizzando Virus Adeno-associati e microscopia confocale
In questo articolo
Sommario
Abstract
I neuroni si basano sull'isolamento elettrico e supporto trofico dei oligodendrocytes myelinating. Nonostante l'importanza degli oligodendrociti, gli strumenti avanzati attualmente usati per studiare i neuroni, sono state prese solo parzialmente dai ricercatori del oligodendrocyte. Cella tipo-specifica colorazione di trasduzione virale è un approccio utile per studiare la dinamica dell'organello dal vivo. Questo articolo descrive un protocollo per la visualizzazione di mitocondri del oligodendrocyte nelle fette del cervello organotipiche di trasduzione con virus adeno-associato (AAV) portatori di geni per le proteine fluorescenti mirate mitocondriale sotto il controllo trascrizionale del il promotore di proteina basica della mielina. Esso comprende il protocollo per rendere organotipiche fette di cervello del topo coronale. Una procedura per time-lapse imaging dei mitocondri quindi segue. Questi metodi possono essere trasferiti ad altri organelli e possono essere particolarmente utili per lo studio di organelli nella guaina mielinica. Infine, descriviamo una tecnica prontamente disponibile per la visualizzazione della mielina non macchia in fette di vita da microscopia Confocal di riflessione (CoRe). CoRe non richiede nessun equipaggiamento supplementare e può essere utile per identificare la guaina mielinica durante la formazione immagine dal vivo.
Introduzione
Materia bianca del cervello è composto di cellule nervose assoni avvolti nella mielina, una membrana di plasma estesa specializzata formata da oligodendrociti. Mielina è necessaria per la propagazione del potenziale d'azione veloce e affidabile e sopravvivenza a lungo termine degli assoni myelinated e una perdita di mielina può causare disfunzione neurologica. Nonostante la loro importanza, le proprietà degli oligodendrociti sono meno conosciuti rispetto con i neuroni e astrociti. Di conseguenza, meno strumenti sono stati sviluppati per lo studio di oligodendrociti.
Live imaging di organelli cellulari come i mitocondri, reticolo endoplasmat....
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Protocollo
le procedure qui descritte sono state approvate dall'autorità norvegese per la ricerca animale. I fornitori e i numeri di catalogo per i materiali di consumo e altre richieste attrezzature sono disponibili nell'elenco materiali alla fine del documento.
1. preparazione di organotipiche fette
Nota: questa ricetta utilizza due cuccioli di topo postnatale giorno 7-9 (p7-9), che producono 24 fette organotipiche divisi su due piastre di coltura di sei-pozzo. Salvo diversa indicazione, tutte le procedure dovrebbero essere fatto in una cappa sterile e guanti in lattice o nitrile dovrebbero essere usati. Dovrebbero esser....
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Risultati
Fettine di cervello organotipiche che sono state coltivate e trasdotte come sopra descritto ha mostrato una distribuzione sparsa di oligodendrociti corticali esprimendo mito_dsred e GFP. Immunostaining con gli anticorpi contro Olig2 e MBP ha confermato che l'espressione era specifico per gli oligodendrociti (Figura 1).
Per l'imaging in vivo, gli oligodendrociti trasdotte sono stati riconosciuti dall.......
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Discussione
Il protocollo per la fabbricazione di colture organotipiche descritti qui è una versione modificata18 del protocollo descritto da De Simoni e Yu (2006)5. Le modifiche più importanti sono state delineate di seguito. Tampone Tris è aggiunto al terreno di coltura, che migliora la sopravvivenza delle fette quando di fuori dell'incubatore durante la trasduzione virale e dalla sostituzione della medium delle cellule. La procedura di sterilizzazione per confetti è anche cambiata. .......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Ringraziamo Linda Hildegard Bergersen e Magnar Bjørås per l'accesso alla cella laboratorio e attrezzature, personale Janelia biologia molecolare ha condiviso la risorsa per la produzione di virus e plasmide e Koen Vervaeke per assistenza con le misure di potenza del laser. Questo lavoro è stato finanziato dall'associazione salute norvegese, Norwegian Research Council e l'apparecchiatura di microscopia è stato finanziato da Norbrain.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Agarosio | Sigma | A9539 | |
| BD Microlance 19G | BD | 301500 | Aghi utilizzati per l'ingresso e l'uscita del bagno |
| Biossido di gas | AGA | 105701 | |
| Lampadine per pipette di marca | Sigma-Aldrich Z615927 | Lampadine per pipette | |
| Bruciatore Bunsen (bruciatore a propano liquido) | VWR | 89038-530 | |
| Cavo assemblato per controller del riscaldatore | Warner Instruments | 64-0106 | Regolatore di temperatura - parte termometro |
| CaCl2 | Fluka | 21100 | |
| CO2 | AGA | 100309 | CO2 per |
| incubatore Vetro di copertura, quadrato Corning | Thermo Fischer Scientific | 13206778 | Da collegare sotto il bagno per l'imaging dal vivo. Sigillare con colla o vaselina. |
| D-(+)-glucosio | Sigma | G7021 | |
| pinza delicata | Finescience | 11063-07 | Per la dissezione |
| Penna a graffio a diamante | Ted Pella Inc. | 54463 | |
| Pipette monouso in vetro Pasteur 230 mm | VWR | 612-1702 | Pipette in vetro Lama |
| di rasoio in acciaio inossidabile a doppio bordo | Microscopia elettronica Sciences | #7200 | Lama di rasoio per vibratomo |
| Soluzione salina bilanciata di Earle (EBSS) | Gibco-Invitrogen | 24010-043 | |
| Cerchi di carta da filtro | Schleicher & Schuell | 300.220 | Carta da filtro utilizzata per la filtrazione di PFA |
| Fun tack | Loctite | 1270884 | Utilizzare per collegare / regolare la posizione degli ingressi e delle uscite nel bagno |
| Asciugamano C-Fold 2 | Katrin | 344388 | |
| Harp, piatto per camera RC-41, | Warner Instruments | 64-1418 | Arpa per tenere giù i coriandoli nel bagno. Tagliare i fili prima dell'uso con fette organotipiche. 1,5 mm, 13 mm, SHD-41/15 |
| HEPES, FW: 260,3 | Sigma | H-7006 | |
| Holten LaminAir, modello 1.2 | Heto-Holten | 96004000M | Cappa a flusso laminare |
| Siero di cavallo, inattivato a caldo | Gibco-Invitrogen | 26050-088 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Membrana LCR, PTFE, | Millipore | FHLC0130 | Confetti |
| Leica VT1200 | Leica | 14048142065 | Vibratomo |
| MEM-Glutamax con HEPES | Thermo Fischer Scientific | 42360024 | |
| MgCl2 | R.P. Normapur | 25 108.295 | |
| Micro Spoon Heyman Tipo B | Microscopia elettronica Sciences | 62411-B | Piccola spatola arrotondata con estremità affilata per dissezione |
| Unità filtrante Millex-GP | SLGPM33RA Millipore | Unità filtrante per siringa | |
| Inserto per colture cellulari Millicell, 30 mm | Millipore | PICM03050 | Inserti per colture cellulari |
| Modulo di controllo a 3 velocità Minipuls | GILSON | F155001 | Pompa peristaltica per imaging dal vivo - Parte del modulo di controllo (collegare alla testa a due cannel) |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nunclon Delta Surface | Thermo Fischer Scientific 140675 | Piastra di coltura | |
| Sospensione di nistatina | Sigma-Aldrich | N1638 | |
| Obiettivo W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | Obiettivo ad immersione in acqua utilizzato per l'imaging dal vivo. (WD=2,5 mm), VIS-IR |
| Parafilm | VWR | 291-1211 | |
| Paraformaldeide, microscopia elettronica granulare | Sciences | #19208 | |
| Camera di perfusione PC-R | SiSkiYou | 15280000E | Bagno per imaging dal vivo |
| Penicillina-Streptomicina, liquido | Invitrogen | 15070-063 | |
| Piastra di Petri 140 mm | Heger | 1075 | Capsula di Petri grande |
| Piastra Petri 92x16 mm | Sarstedt | 82.1473 | Piastra di Petri media |
| Petridish 55x14,2 mm | VWR | 391-0868 | Piastra di Petri piccola |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Sigma | P4417 | PBS compresse |
| R2 Testina a due canali | GILSON | F117800 | Pompa peristaltica per l'imaging dal vivo - Parte della testa a due canali (richiede modulo di controllo) |
| Spatole rotonde/piatte, acciaio inossidabile | VWR | 82027-528 | Spatola grande per la dissezione |
| Carta vetrata | VWR | MMMA63119 | Opzionale, per levigare pipette di vetro rotte |
| Forbici, 17,5 cm | Finescience | 14130-17 | Forbici grandi per la dissezione |
| Forbici, 8,5 | Finescience | 14084-08 | Forbici piccole e affilate per la dissezione |
| Lama singola per gemma | Microscopia elettronica Sciences | #71972 | Lama di rasoio a lama |
| singola Riscaldatore per soluzione in linea singola SH-27B | Warner Instruments | 64-0102 | Regolatore di temperatura - parte riscaldante |
| Unità filtrante Steritop-GP, 500 ml, filtro | SCGPT05RE | millipore | per sterilizzare soluzioni |
| Super colla di precisione | Loctite | 1577386 | |
| Lama per bisturi chirurgico n. 22 | Swann Morton Ltd. | 209 | Lama di bisturi arrotondata |
| Regolatore di temperatura TC324B | Warner Instruments | 64-0100 | Regolatore di temperatura per imaging dal vivo (richiede riscaldatore soluzione e assemblaggio cavi) |
| Base Trizma | Sigma | T1503 | |
| Trizma HCl | Sigma | T3253 | |
| Incubatrice con rivestimento d'acqua serie II | Forma Scientific | 78653-2882 | Incubatrice |
Riferimenti
- Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo. Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).
- Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T.
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Ristampe e permessi
