Questo articolo descrive un protocollo per l'individuazione di uno o più del plasma e/o proteine di membrana intracellulare mediante microscopia ad alta super-risoluzione stato fondamentale lo svuotamento (GSD) in cellule di mammifero. Andremo a discutere i vantaggi e le considerazioni di utilizzare tali approcci per la visualizzazione e la quantificazione delle proteine cellulari.
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Articolo metodologico
Stato fondamentale lo svuotamento super-resolution Imaging in cellule di mammifero
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli avanzamenti nella biologia delle cellule e microscopia fluorescente sono intimamente correlati, con l'avanzata capacità di visualizzare eventi cellulari causando spesso drammatici salti nella nostra comprensione di come le cellule funzione. Lo sviluppo e la disponibilità della microscopia di Super-risoluzione ha notevolmente ampliato i limiti di risoluzione ottica da ~ 250-20 nm. I biologi non sono più limitati a descrivere le interazioni molecolari in termini di colocalizzazione all'interno di una zona di diffrazione limitata, piuttosto è ora possibile visualizzare le interazioni dinamiche delle singole molecole. Qui, descriviamo un protocollo per la visualizzazione e la quantificazione delle proteine cellulari da microscopia di svuotamento di stato fondamentale per l'imaging cellulare fisso. Forniamo esempi da due proteine di membrana diversi, un elemento del Traslocone il reticolo endoplasmatico, sec61β e un membrana plasmatica localizzato tensione-gated L-tipo Ca2 + canale (CaV1.2). Vengono descritti il microscopio specifici parametri, metodi di fissazione, foto-commutazione formulazione di buffer e insidie e sfide di elaborazione delle immagini.
Introduzione
Le reazioni cellulari di segnalazione traducono cambiando ambienti interni ed esterni per avviare una risposta cellulare. Esse regolano tutti gli aspetti della fisiologia umana, che serve da base per l'ormone e rilascio di neurotrasmettitori, il battito cardiaco, visione, fertilizzazione e funzione conoscitiva. Rottura di queste cascate di segnalazione può avere gravi conseguenze sotto forma di condizioni patologiche tra cui cancro, morbo di Parkinson e di Alzheimer. Per decenni, gli investigatori biologici e medici sono utilizzati con successo le proteine fluorescenti, sonde e biosensori accoppiati con microscopia di fluorescenza come i principali strumenti per compr....
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Protocollo
1. lavaggio vetrini coprioggetti
- il giorno prima dell'elaborazione del campione, pulire #1.5 vetrini coprioggetti di sonicating in una soluzione 1 M di KOH per 1 h. Questa operazione rimuove qualsiasi fluorescente contaminanti che possono essere presenti sui coprioggetti.
- Risciacquare accuratamente il KOH da lamelle con acqua deionizzata.
- Una volta puliti in KOH, conservare i coprioggetti in etanolo al 70% fino all'uso.
2. Lamelle di vetro di rivestimento
Nota: passaggi in questa sezione devono essere eseguiti in una cappa di coltura cellulare per ....
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Risultati
Come documentato nell'introduzione, ci sono molti microscopia di Super-risoluzione diverse modalità di formazione immagine. Questo protocollo, si concentra su formazione immagine di Super-risoluzione GSD. Immagini rappresentative e mappe di localizzazione sono mostrate in Figura 2 e Figura 3.
La figura 2 Mostra delle cellule COS-7 transfett.......
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Discussione
La recente esplosione di tecnologie che permettono la formazione immagine oltre il limite di diffrazione hanno offerto nuove finestre nella complessità della cellula di mammiferi segnalazione nello spazio e nel tempo. Queste tecnologie includono tempesta, STED, PALM, GSD, SIM e le loro varianti (ad es., dSTORM, FPALM). L'ingegnosità degli scienziati dietro queste tecniche ha permesso di eludere i limiti imposti dalle leggi della fisica che regolano la diffrazione della luce. Nonostante questo risultato enorme, o.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno concorrenti interessi di divulgare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione AHA a r.e.d. (15SDG25560035). Gli autori si desidera ringraziare Dr. Fernando Santana per l'uso del suo microscopio 3D Leica SR GSD e Dr. Johannes Hell per gentilmente fornire l'anticorpo FP1.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| KOH | Thermo Scientific | P250-500 | Per pulire il vetro di copertura |
| #1.5 vetro di copertura 18 x 18 mm | Marienfeld Superior | 0107032) | Per crescere/elaborare/visualizzare le cellule |
| 10x PBS | Thermo Scientific | BP3994 | Diluire a 1x con acqua deionizzata |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4832 | Aiuta con l'adesione delle cellule per coprire |
| laminina | di vetroSigma | 114956-81-9 | Ausili con adesione cellulare al vetro di copertura |
| Medium 199 | Thermo Scientific | 11150-059 | Terreni di coltura di miociti ventricolari |
| DMEM 11995 | Gibco | 11995 | Terreni di coltura cellulare |
| Siero fetale bovino (FBS) | Thermo Scientific | 10437028 | Integratore di terreni |
| Penicillina/streptomicina | Sigma | P4333 | Media integratore |
| 0,05% tripsina-EDTA | Corning | 25-052-CL | Soluzione per colture cellulari |
| Lipofectamina 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Reagente di trasfezione transitoria |
| Ca2+-free PBS | Gibco | 1419-144 | Coltura cellulare |
| 100 % Metanolo | Thermo Fisher Scientific | A414-4 | Fissazione cellulare |
| Paraformaldeide | Elettrone Microscopia Scienze | 15710 | Fissazione cellulare |
| Glutaraldeide | Sigma Aldrich | SLBR6504V | Fissazione cellulare |
| SEAblock | Thermo Scientific | 37527 | BSA o altre alternative di soluzione bloccante esistono |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | Detergente per permeabilizzare le cellule |
| Coniglio anti-CaV1.2 (FP1) | Regalo | N/A | Esistono anticorpi anti-CaV1.2 commerciali come Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003) |
| Mouse monoclonal anti-RFP | Rockland Inc. | 200-301-379 | Anticorpo primario |
| Alexa Fluor 647 donket anti-coniglio IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A31573 | Anticorpo secondario |
| Alexa Fluor 568 capra anti-topo IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A11031 | Anticorpo secondario |
| Sodio azide | Sigma | S2002 | Previene la crescita microbica per la conservazione a lungo termine dei campioni |
| Catalasi | Sigma | C40 | Ingrediente tampone fotocommutante |
| Glucosio ossidasi | Sigma | G2133 | Ingrediente tampone fotocommutante |
| Tris | Sigma | T6066 | Ingrediente tampone fotocommutante |
| beta-Mercaptoetilammina cloridrato | Fisher | BP2664100 | Ingrediente tampone fotocommutante |
| β-mercaptoetanolo | Sigma | 63689 | Ingrediente tampone fotocommutante |
| NaCl | Fisher | S271-3 | Componente tampone fotocommutante |
| Destrosio | Fisher | D14-212 | Componente tampone fotocommutante |
| Vetrini a depressione | Neolab | 1 – 6293 | Per montare campioni |
| Twinsil | Picodent | 13001000 | Per sigillare il vetro coprioggetto |
| sec61β- mCherry plasmid | Addgene | 49155 | |
| Leica SR GSD Microscopio 3D | Leica | ||
| ImageJ | |||
| Soluzione di blocco | 20 % in PBS | ||
| Soluzione di incubazione | 0,5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, in PBS | ||
| Soluzione | di incubazione di anticorpi secondari1:1000 in PBS |
Riferimenti
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).
- Gustafsson, M. G.
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Ristampe e permessi
