Preparazione del campione per l'analisi di Endopeptidomic in liquido cerebrospinale umano

Karl T. Hansson; Tobias Skillbäck; Elin Pernevik; Jessica Holmén-Larsson; Gunnar Brinkmalm; Kaj Blennow; Henrik Zetterberg; Johan Gobom

doi:10.3791/56244

Articolo metodologico

Preparazione del campione per l'analisi di Endopeptidomic in liquido cerebrospinale umano

DOI:

10.3791/56244

⸱

4 dicembre 2017

Karl T. Hansson¹ , Tobias Skillbäck¹^,² , Elin Pernevik¹ , Jessica Holmén-Larsson¹ , Gunnar Brinkmalm¹ , Kaj Blennow¹^,² , Henrik Zetterberg¹^,²^,³ , Johan Gobom¹^,²

¹Inst. of Neuroscience and Physiology, Dept. of Psychiatry and Neurochemistry, Sahlgrenska Academy at University of Gothenburg, ²Clinical Neurochemistry Laboratory, Sahlgrenska University Hospital, ³Department of Molecular Neuroscience, UCL Institute of Neurology

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Viene presentato un metodo per analisi spettrometria totale di peptidi endogeni in umana del liquido cerebrospinale (CSF). Impiegando la filtrazione di cut-off di peso molecolare, cromatografica pre-frazionamento, analisi spettrometria totale e una successiva combinazione di strategie di identificazione del peptide, è stato possibile ampliare il noto peptidome di CSF quasi dieci volte rispetto per gli studi precedenti.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive un metodo sviluppato per identificare peptidi endogeni in umana del liquido cerebrospinale (CSF). Per questo scopo, un metodo precedentemente sviluppato basato su filtrazione di cut-off (MWCO) di peso molecolare e analisi spettrometria totale è stato combinato con un passo di pre-frazionamento di HPLC in linea fase inversa di alto pH.

Secrezione nel CSF è la via principale per la rimozione di molecole capannone da cellule del sistema nervoso centrale. Così, molti processi nel sistema nervoso centrale si riflettono nel CSF, rendendolo un prezioso fluido diagnostico. CSF ha una composizione complessa, contenente proteine che coprono una gamma di concentrazione di 8-9 ordini di grandezza. Oltre a proteine, studi precedenti hanno dimostrato anche la presenza di un gran numero di peptidi endogeni. Mentre meno estesamente studiato rispetto alle proteine, questi potrà inoltre detenere potenziale interesse come biomarcatori.

Peptidi endogeni sono stati separati dal contenuto di proteina di CSF attraverso filtrazione MWCO. Rimuovendo una maggioranza del contenuto proteico del campione, è possibile aumentare il volume del campione studiato e quindi anche l'importo totale dei peptidi endogeni. La complessità della miscela peptide filtrato è stato risolto includendo una fase inversa (RP) HPLC pre-frazionamento passo a pH alcalino prima dell'analisi LC-MS. Il frazionamento è stato combinato con un sistema di concatenazione semplice dove 60 frazioni sono state riunite in 12, quindi potrebbe essere ridotto consumo di tempo di analisi, evitando ancora in gran parte co-eluizione.

Identificazione automatica del peptide è stato effettuato tramite tre programmi di software di identificazione di diversi peptidi/proteine e successivamente combinando i risultati. I diversi programmi erano complementari piuttosto che paragonabile con meno del 15% delle identificazioni sovrapposti tra i tre.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biomarcatori nel liquido cerebrospinale (CSF) ricerca attualmente stanno trasformando processi neurodegenerativi. Nel morbo di Alzheimer, la più comune malattia neurodegenerativa, che interessa oltre 60 milioni persone in tutto il mondo¹^,², un tripletto di biomarcatore costituito l'amiloide beta peptide, stabilizzazione dei microtubuli proteina tau e un fosforilato forma di tau, con alta sensibilità e specificità in grado di rilevare la malattia ed è stato incluso nei criteri diagnostici ricerca³. In altre malattie neurodegenerative, come il morbo di Parkinson e la sclerosi multipla, st....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo descritto di seguito è una versione raffinata di quello usato in uno studio precedente dove una grande quantità di peptidi endogeni sono stati identificati in umano CSF¹⁵. Aggiornamenti per il protocollo originale comportano alterazioni minori per il pre-trattamento chimico di CSF nonché ottimizzazione della sfumatura utilizzata per il non in linea pre-frazionamento di alto pH RP HPLC.

Considerazioni etiche

Tutti gli studi dei materiali paziente e controllo svedese sono stati approvati dai comitati etici: Göran St (Rif. 2005-554-31/3). I campioni di CSF della....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il metodo qui descritto è stato applicato e valutato in tre studi prima dell'introduzione del pre-frazionamento del campione (tabella 1). Il primo studio utilizzato non in linea LC per avvistare le frazioni CSF su una zolla di destinazione MALDI e 730 identificati peptidi endogeni¹¹ha provocato. Nei due studi seguenti, etichettatura isobarica è stato impiegato. Soprattutto in un caso/controllo lo studio simultaneo per l'identificazione e caratterizzazione di biomarcatori potenziali nel CSF endopep.......

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'introduzione di un passaggio di pre-frazionamento di RP HPLC alto pH per un protocollo precedentemente sviluppato per il recupero di peptidi endogeni di peso molecolare ultrafiltrazione¹¹ ridotta complessità relativa del campione e quindi consentito per un 5 volte maggiore volume di campione da studiare. Questo, a sua volta, ha aumentato la concentrazione del sottoinsieme di peptidi presenti in ogni frazione e quindi migliorato la probabilità di rilevare peptidi abbondanti bassi.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interessi concorrenti, finanziari o di altro, tra gli autori non sono stati segnalati.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Molte grazie Tanveer Batth e colleghi per la consulenza in impostare il metodo di pre-frazionamento.

Quest'opera è stata sostenuta da finanziamenti dal Consiglio svedese della ricerca, la Wallström e Sjöblom Foundation, la pistola e Bertil Stohne Fondazione Stiftelse, la Fondazione di Bergwall Magnus, Åhlén Foundation, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stiftelsen för Gamla Tjänarinnor, Knut e Alice Wallenberg Foundation, Frimurarestiftelsen e FoU-Västra Götalandsregionen.

I principali destinatari dei finanziamenti per questo progetto erano Kaj Blennow, Henrik Zetterberg e Johan Gobom.

....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1 M Bicarbonato di trietilammonio	Fluka, Sigma-Aldrich	17902-100ML	TEAB
8 M Guanidinium cloridrato	Sigma-Aldrich	G7294-100ML	GdnHCl
Tris(2-carbossietil)fosfina cloridrato	Pierce	20490	TCEP
Iodoacetamide	SIGMA	I1149-5G	IAA
Idrossilammina 50% (con / p)	Sigma-Aldrich	457804-50ML
Acetonitrile, lontano UV, grado di gradiente HPLC	Sigma-Aldrich	271004-2L	AcN
Acido formico	Fluka, Sigma-Aldrich	56302-1mL-F	FA
Acido trifluoroacetico	Sigma-Aldrich	T6508-10AMP	TFA
Soluzione di idrossido di ammonio	Sigma-Aldrich	30501-1L-1M	NH₄OH
Unità filtrante centrifuga Amicon Ultra-15 con membrana Ultracel-30	Merck Millipore	UFC903024	MWCO-filtro
Sep-Pak C18, 100 mg	Waters	WAT023590	colonna SPE
Resprep Collettore SPE a 12 porte	Restek	26077	Collettore per vuoto
TMT10plex Set di reagenti per etichette isobariche	Thermo Fisher Scientific	90110	TMT10plex
UltiMate 3000 RSLCnano LC System	Dionex	5200.0356	Separazione online dei campioni
Ultimate 3000 RPLC Sistema binario a separazione rapida	Dionex	IQLAAAGABHFAPBMBEZ	Frazionamento offline ad alto pH
Orbitrap Fusion Tribrid spettrometro di massa	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFADBMBCX	Spettrometro di massa per analisi di campioni
Proteome Discoverer 2.0	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGABSFAKJMAUH	Piattaforma di ricerca di proteomica
Mascotte v2.4	Matrix Science	-	Motore di ricerca per proteomica
Sequest HT	Thermo	-	Motore di ricerca per proteomica
PICCHI v7.5	Soluzioni bioinformatiche Inc.)	-	Motore di ricerca per proteomica
Acclaim PepMap 100, 75 & micro; m x 2 cm, C₁₈, 100 Å dimensione dei pori, 3 & micro; m granulometria	Thermo Fisher Scientific	164535	Colonna trappola (nano HPLC)
Acclaim PepMap C18, 75 &; m x 500 mm, 100Å dimensione dei pori, 2 µ m granulometria	Thermo Fisher Scientific 164942		Colonna di separazione (nano HPLC)
Concentratori ad alta capacità Savant SpeedVac	Thermo Fisher Scientific	SC210A-230	SpeedVac/Concentratore a vuoto
XBridge Peptide BEH C18 Colonna, 130Å, 3,5 &; m, 2,1 mm X 250 mm	Colonne	di separazione per 186003566	(micro HPLC)

acque

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wimo, A., et al. The worldwide costs of dementia 2015 and comparisons with 2010. Alzheimers Dement. 13 (1), 1-7 (2017).
Scheltens, P., et al. Alzheimer's disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
Dubois, B., et al.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Filtrazione MWCO HPLC a fase inversa analisi LC MS pre frazionamento dei peptidi peptidi endogeni spettrometria di massa identificazione dei peptidi

Preparazione del campione per l'analisi di Endopeptidomic in liquido cerebrospinale umano

In questo articolo

Sommario

Abstract

Introduzione

Protocollo

Risultati

Discussione

Dichiarazioni

Ringraziamenti

Materiali

Riferimenti

Ristampe e permessi

Tag

Articoli correlati