Articolo metodologico

RGB e Imaging spettrale radice per pianta Phenotyping e ricerca fisiologica: messa a punto sperimentale e protocolli di Imaging

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DOI:

10.3791/56251

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8 agosto 2017

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1Division of Agronomy, Department of Crop Sciences, University of Natural Resources and Life Sciences, 2Carinthian Tech Research AG, High Tech Campus Villach, 3Computational Science Center, University of Vienna, 4Simulationswerkstatt

In questo articolo

Sommario

Un protocollo sperimentale è presentato per la valutazione del terreno coltivato pianta radice sistemi con RGB e l'imaging iperspettrale. Combinazione di tempo di immagine RGB serie con chemiometrica informazioni da iperspettrale scansioni ottimizza intuizioni nelle dinamiche di radice di pianta.

Abstract

Migliore comprensione delle dinamiche di radice di pianta è essenziale per migliorare l'efficienza di utilizzo delle risorse dei sistemi agricoli e aumentare la resistenza delle cultivar di raccolto contro stress ambientali. Un protocollo sperimentale è presentato per RGB e l'imaging iperspettrale degli apparati radicali. L'approccio utilizza rizobox dove le piante crescono in terreno naturale sopra un tempo maggiore per osservare completamente sviluppati sistemi della radice. Impostazioni sperimentali sono esemplificate per valutare rhizobox piante sotto stress idrico e studiare il ruolo delle radici. Un'installazione di imaging RGB è descritto per quantificazione economico e veloce lo sviluppo delle radici nel tempo. L'imaging iperspettrale migliora la segmentazione radice dallo sfondo del suolo rispetto alla soglia di colore basata RGB. Il punto di forza dell'imaging iperspettrale è l'acquisizione di chemiometrica informazioni sul sistema suolo-radice per comprensione funzionale. Questo è dimostrato con mapping contenuto di acqua di alta risoluzione. Formazione immagine spettrale, tuttavia, è più complessa in immagine acquisizione, elaborazione ed analisi rispetto all'approccio RGB. Una combinazione di entrambi i metodi in grado di ottimizzare una valutazione completa dell'apparato radicale. Per il contesto della ricerca fisiologica phenotyping e pianta della pianta sono riportati esempi di applicazione l'integrazione di radice e tratti fuori terra. Ulteriore miglioramento dell'imaging di radice può essere ottenuto ottimizzando la qualità di immagine RGB con un'illuminazione migliore utilizzando diverse fonti di luce e di estensione dei metodi di analisi di immagine per dedurre il proprietà di zona di radice da dati spettrali.

Introduzione

Le radici forniscono diverse funzioni essenziali per piante come deposito di assimila, ancoraggio delle piante terrestri nel suolo e l'assorbimento e il trasporto di acqua e sostanze nutritive1. Da un punto di vista evolutivo, la formazione degli assi di radice è considerata un presupposto fondamentale per l'origine della terra piante2. Nonostante questo ruolo importante, storicamente le radici hanno occupato solo una posizione marginale nella ricerca biologica. In tempi più recenti, tuttavia, vi è crescente interesse scientifico nei sistemi di radice di pianta come evidenziato nella Figura 1.

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Figura 1: Rilevanza degli studi radice in scienze botaniche.
Numero di radice studi collegati come percentuale di tutti gli studi di pianta pubblicati in riviste SCI negli ultimi decenni. Risultato da Scopus utilizzando parole chiave "impianto" e "pianta e radice" della ricerca. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Due motivi principali possono essere ipotizzati per sottendono i recenti progressi nella ricerca di radice. Prima vegetazione terrestre è esposta a stress ambientali più frequenti a seguito di cambiamenti globali3. Nel contesto della produzione agricola si stima che globalmente circa il 30% della superficie agricola sono limitati dall'acqua e fosforo4,5. Riduzione dello stress di resa delle colture sono delle ragioni principali per le lacune di rendimento significativo che ammontano globalmente a più basso 50% di produttività potenziale per rainfed agro-ecosistemi6. Oltre alla disponibilità di risorse in esaurimento, questo è anche legato all'efficienza di uso di risorsa scarsa, cioè insufficiente capacità di una pianta di sfruttare le risorse disponibili7. Questo si traduce in perdite di risorse mobili quali nitrati che possono influenzare negativamente altri ecosistemi. L'efficienza di uso corrente di azoto globale, ad esempio, è stimato a 47%8. Uso migliore delle risorse efficienza tramite i metodi di miglioramento della gestione e cultivar è pertanto di grande importanza per entrambi sostenuta crescita dei prodotti agricoli, anche per quanto riguarda la sostenibilità ambientale. In questa pianta contesto radici sono considerate di essere un obiettivo chiave per colture migliorate e ritaglio sistemi9,10.

Una seconda importante background per il recente interesse nelle radici della pianta è progresso tecnologico nei metodi di misurazione. Metodi di radice lunga sono stati limitati da due sfide chiave: per la misurazione delle radici da piante che crescono nel terreno dovevano essere isolato per quantificazione, principalmente mediante lavaggio11, perturbi la disposizione architettonica degli assi di radice. Osservazione di radice in situ mediante scavo metodi, quindi conservare la naturale posizione delle radici nel terreno, sono stati utilizzati per Descrizione botanica12. Ancora sono molto che richiede tempo e quindi non soddisfano i requisiti di velocità effettiva del sistema della radice strutturale-funzionale comparativa analisi. D'altra parte metodi ad alta resa per la radice architettura misura principalmente sono state fatte su diete artificiali e per semenzale piante13 dove l'estrapolazione all'ambiente naturale crescita delle piante è discutibile14.

Il recente boom di ricerca principale è collegato strettamente all'anticipo del metodi15di imaging. Approcci in studi di radice di imaging possono essere approssimativamente raggruppati in tre tipi. Prima ci sono metodi 3D ad alta risoluzione come il CT e MRI16. Questi metodi sono più adatti per lo studio dei processi di interazione delle radici delle piante con il suolo, come siccità indotta xilema embolia17. In genere vengono applicati a comparativamente piccoli campioni dove permettono osservazioni dettagliate. Viene fornito un confronto del CT e di MRI per vasi di dimensioni diverse e l'imaging di radice bene in18. In secondo luogo, ci sono di alto-rendimento imaging metodi19,20. Questi metodi sono per lo più basata su comuni RGB imaging 2D di radici che crescono su diete artificiali (gel, carta di germinazione) dove il contrasto elevato consente una dissezione comparativamente semplice tra radici e sfondo. Essi sono adatti per il confronto di throughput elevato tra tratti di radice semenzale di genotipi differenti colture sotto crescente artificiale standardizzata circostanze13. Tra questi due approcci sono metodi rhizobox: usano imaging 2D di radici che crescono nel terreno nel più lungo periodo di tempo ed hanno velocità effettiva media21,22. Una sfida risale all'imaging di radice (2D) è quello di catturare anche indicatori di funzionalità principale oltre a descrizione della struttura23.

Nel presente documento presentiamo i protocolli sperimentali per l'imaging rhizobox cresciuto sistemi della radice mediante (i) una semplice ed economico su misura RGB imaging installazione e (ii) una configurazione più complessa di imaging NIR. Risultati di esempio ottenuti da queste due configurazioni sono mostrati e discussi nel contesto della pianta phenotyping e ricerca fisiologica della pianta.

Protocollo

1. Scatole rizosferiche per la crescita delle piante

NOTA: Il sistema sperimentale utilizza rizobox per coltivare piante a fini di imaging radicale. In primo luogo vengono descritti il design delle scatole e il substrato utilizzato, seguiti dai dettagli relativi alla procedura di riempimento.

  1. Progettazione dei rhizobox
    1. Realizzare dei rhizobox (Figura 2) con una piastra posteriore e telai laterali in PVC grigio dello spessore di 15 mm. Utilizzare dimensioni della scatola di 300 mm x 1000 mm. Per la finestra frontale, usare vetro minerale da 6 mm fissato al telaio in PVC mediante guide metalliche avvitate alle pareti laterali.
    2. Praticare tre fori sul telaio inferiore per consentire lo scarico dell'acqua in eccesso. Questi fori possono essere chiusi opzionalmente con tappi di plastica.
    3. Prima del riempimento, regolare il diametro interno del rhizobox (tra 10 mm e 30 mm) inserendo lastre in policarbonato alveolare. Per la maggior parte delle colture si raccomanda uno spazio interno di 10 mm, al fine di ridurre il peso dell'intero sistema (il peso del rhizobox senza terreno è di 13,2 kg).

Diagramma della struttura della parete con PVC, vetro, lastre alveolari; progetto del drenaggio; dimensioni indicate.
Figura 2: Sistema sperimentale di rizobox e le sue componenti.
L'immagine a sinistra mostra le dimensioni di un rizobox e l'immagine a destra le singole componenti, costituite da una piastra posteriore in PVC grigio con telaio laterale, un vetro minerale frontale, lastre alveolari per un diametro interno variabile e angolari metallici per fissare il vetro frontale al compartimento posteriore. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

  1. Substrato
    1. Riempire le rhizobox con terreno di campo (per questo esperimento: suolo limoso-argilloso superficiale proveniente da un chernozem calcareo) setacciato a una dimensione delle particelle di 2 mm.
    2. Aprire le rhizobox per riempire il compartimento interno (piastra posteriore con telai laterali) in posizione orizzontale utilizzando il substrato pre-umidificato. Riempire in orizzontale per evitare stratificazione e separazione tra particelle fini e grossolane, fenomeni che si verificano quando il riempimento avviene in posizione verticale versando il substrato dall'apertura superiore.
    3. Umidificare il substrato prima del riempimento. A seconda del tipo di substrato (in particolare del contenuto di limo e argilla), non superare un contenuto idrico di 0,12-0,18 cm3*cm-3 per evitare appiccicamento e degrado della struttura. Aggiungere la differenza tra il contenuto idrico iniziale e quello desiderato dopo aver riempito le rhizobox con il substrato.
      NOTA: Il riempimento con substrato (essiccato in stufa) completamente secco e l'aggiunta successiva di tutta l'acqua non è consigliato, poiché può causare un forte assestamento del substrato e la formazione di ampie fessurazioni.
  2. Esempio passo dopo passo del riempimento
    1. Definire il contenuto idrico desiderato. In questo caso è inizialmente impostato all'80% dell'acqua disponibile per la pianta (PAW), condizione in cui le piante non soffrono di carenza idrica.
    2. Determinare la capacità di campo (FC) e il punto di appassimento permanente (PWP) del substrato. In questo caso, ottenere la FC utilizzando un tubo in PVC di altezza equivalente (100 cm) a quella delle rhizobox.
      1. Chiudere il tubo in basso con un tappo dotato di piccoli fori di drenaggio, aggiungere 1 cm di ghiaia per evitare l'occlusione dei fori da parte del substrato più fine e riempire con il substrato alla stessa densità apparente utilizzata per le rhizobox (1,3 g cm-3).
      2. Saturare il tubo con acqua fino a quando inizia il drenaggio e lasciarlo a riposo per due giorni per raggiungere l'equilibrio (il contenuto idrico risultante è per definizione equivalente alla capacità di campo), coprendo l'apertura superiore con pellicola trasparente per evitare l'evaporazione. Il valore di capacità di campo ottenuto per il suolo in questo esperimento è stato di 0,357 cm3 cm-3.
        NOTA: Il contenuto idrico al PWP deve essere noto in anticipo mediante metodi standard di fisica del suolo (ad esempio misure con piastra sotto pressione24) o tramite funzioni pedotransfer basate sulla tessitura25. In questo caso, è pari a 0,12 cm3 cm-3 per il suolo utilizzato.
      3. Se si misura la FC anche mediante estrazione con piastra sotto pressione, considerare il contenuto idrico a un potenziale matriciale di h = -100 hPa e non h = -330 hPa, per corrispondere alla geometria della rhizobox (altezza di 100 cm = 100 hPa).
      4. Calcolare il contenuto idrico (WC) all'80% PAW: WC (cm3 cm-3) = 0,80 (FC-PWP) + PWP. Per i limiti idraulici del suolo utilizzato in questo esperimento, si ottiene un contenuto idrico volumetrico all'80% PAW pari a 0,31 cm3 cm-3.
      5. Calcolare la quantità di acqua necessaria per un volume di rhizobox di 2850 cm3 (30 cm di larghezza, 1 cm di spazio interno, 95 cm di altezza, con i 5 cm superiori lasciati liberi per l'irrigazione). Si ottiene un volume di acqua di 883,5 cm3, pari a 883,5 g, considerando la densità dell'acqua pari a 1,0 g cm-3 a 20 °C.
    3. Definire la densità apparente (db) con cui riempire le rhizobox. In questo caso, impostata a 1,3 g cm-3, valore tipico riscontrato nei suoli agricoli di campo. La quantità di substrato secco necessaria per riempire un volume di rhizobox di 2850 cm3 a questa db è pari a 3705 g di suolo secco.
    4. Umidificare il suolo secco fino a un contenuto idrico gravimetrico di 0,108 g g-1 (equivalente a un contenuto idrico volumetrico di 0,14 cm3 cm-3) aggiungendo 400 g di acqua a 3705 g di suolo secco e mescolare delicatamente per ottenere una distribuzione omogenea dell'acqua. Rompere manualmente gli aggregati più grandi per mantenere la dimensione delle particelle ≤ 2 mm.
    5. Riempire le rhizobox aperte con il suolo pre-umidificato e compattare leggermente utilizzando un foglio di polistirene (30 x 10 x 1,5 cm) per coprire il volume interno della scatola, ottenendo così una db omogenea di 1,3 g cm-3.
    6. Aggiungere la quantità rimanente di acqua (483,2 g) per raggiungere il contenuto idrico desiderato di 0,31 cm3 cm-3 spruzzandola sulla superficie con un flacone spray. Assicurarsi che le gocce siano piccole per evitare il degrado della struttura superficiale e garantire un inumidimento omogeneo. Mantenere la scatola su una bilancia durante lo spruzzo per monitorare la quantità effettiva di acqua aggiunta al substrato.
    7. Lasciare che l'acqua si ridistribuisca per 10 minuti, quindi premere il vetro sulla superficie e fissarlo con le guide metalliche laterali. Il peso finale medio delle rhizobox con substrato umido era di 17818 ± 68 g (13230 g peso della rhizobox + 3705 g di suolo secco + 883 g di acqua).
      NOTA: Il contenuto idrico omogeneo presente nelle scatole orizzontali si ridistribuirà quando le scatole verranno posizionate nella loro posizione finale, in base al gradiente di potenziale risultante. Questo è un processo fisico presente in tutti i vasi per la crescita delle piante, in funzione della loro geometria (altezza), e gli sperimentatori devono essere consapevoli dell'idraulica dei loro vasi26.

2. Configurazione della stanza climatica

  1. Dotare la stanza climatica (Figura 3) di 8 lampade a LED che forniscono un'illuminazione omogenea di 450 μmol m-2 s-1 con picchi spettrali a 440 (blu) e 660 (rosso) nm per una crescita ottimale delle piante.

Diagramma dell'esperimento sullo stress vegetale; configurazione LED, stazione meteorologica, conduttanza stomatica, grafico del deficit di vapore.
Figura 3: Camera climatica con rizocasse per l'esperimento sullo stress.
(A) Vista laterale dell'intera camera con illuminazione a LED, stazione meteorologica e PC (utilizzato qui per registrare gli igrometri fogliari); vista laterale con un primo piano della struttura metallica che sostiene le rizocasse con un'inclinazione di 45 ° e le lastre di legno utilizzate per schermare la finestra in vetro delle rizocasse dalla luce. (B) Esperimento sullo stress con barbabietola da zucchero che combina quattro fasi con stress dovuti a diverse richieste atmosferiche (alta/bassa) e disponibilità di acqua nel suolo (alta/bassa). Le barre verdi della conduttanza stomatica media indicano la risposta delle piante allo stress. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

  1. Impostare i parametri ambientali in base alle esigenze della pianta o dell'esperimento. In questo caso, utilizzare un fotoperiodo di 14 ore di luce e 10 ore di buio. Durante l'acclimatamento delle piante e prima dell'inizio dei trattamenti di stress, impostare la temperatura a 20° C durante il giorno e a 15° C durante la notte, mantenendo l'umidità relativa al 50 ± 8%.
  2. Posizionare le rhizobox con un'inclinazione di 45° utilizzando un'apposita struttura metallica. Questo massimizza la crescita radicale verso la superficie di vetro grazie al gravitropismo.
  3. Coprire la finestra di vetro con una piastra di legno per mantenere la zona radicale al buio ed evitare la crescita di alghe causata dalla luce che penetra attraverso la superficie di vetro.

3. Configurazione e trattamenti dell'esempio con barbabietola da zucchero

  1. Far germinare preventivamente i semi di barbabietola su carta filtro bagnata per tre giorni a 20 °C in un incubatrice fino all'emergenza della radichetta. Questo garantisce la semina con piante vitali.
    NOTA: La pre-germinazione non è necessaria per piante con elevata vigoria germinativa, evitando così il rischio di danneggiare la radichetta durante la semina. Per i semi di barbabietola con un pericarpo spesso, tuttavia, il rischio di semi non vitali è elevato e la pre-germinazione accelera significativamente l'emergenza della radichetta rispetto alla semina diretta nel terreno.
  2. Praticare un piccolo foro fino a una profondità di circa 1,5 cm al centro della rhizobox utilizzando un cacciavite, posizionare un seme con pinzette orientando la radichetta verso il basso e vicino alla finestra di vetro (questo migliora la visibilità iniziale) e ricoprirlo delicatamente con terreno.
  3. Aggiungere uno strato di 0,5 cm di ghiaia fine (2-4 mm) sulla superficie del terreno per proteggere gli aggregati del suolo dal disfacimento durante l'irrigazione e ridurre le perdite per evaporazione. Per facilitare l'emergenza, mantenere la superficie del terreno priva di ghiaia nella zona in cui è stato posizionato il seme.
  4. Aggiungere 10 g di acqua per favorire l'attecchimento.
  5. Durante l'attecchimento e la crescita iniziale, fino all'inizio dei trattamenti sperimentali di stress, irrigare le rhizobox ogni 2-4 giorni per mantenere il contenuto idrico iniziale dell'80% PAW.
    1. Determinare la quantità di acqua di irrigazione necessaria pesando le rhizobox e aggiungendo acqua fino al raggiungimento del peso iniziale di ciascuna scatola. Per l'irrigazione manuale, utilizzare una pipetta per evitare il degrado della struttura superficiale durante l'annaffiatura.
  6. Disporre le rhizobox secondo il disegno sperimentale stabilito nella stanza climatica. Il protocollo descritto qui si basa su un esperimento con sei cultivar di barbabietola in cinque repliche, organizzato secondo un disegno completamente randomizzato (CRD).
    1. Riposizionare le rhizobox ogni volta che vengono estratte dal supporto metallico per la pesatura e l'irrigazione. Questo evita eventuali effetti derivanti da una eventuale inomogeneità residua della luce all'interno della stanza climatica.
  7. Definire il momento d'inizio dei trattamenti di stress e il tipo di stress. Vengono utilizzate le seguenti condizioni (Figura 4).
    1. Iniziare le misurazioni al BBCH 15 (cinque foglie dispiegate), quando le radici coprono circa il 75% della profondità della rhizobox e la chioma è sufficientemente sviluppata per consentire le misurazioni sulle foglie. Mantenere ciascuna fase per almeno tre giorni per garantire l'adattamento alle nuove condizioni e procedere alle misurazioni.
    2. Per le osservazioni in assenza di stress, mantenere le condizioni iniziali con umidità ottimale del terreno (80% PAW) e condizioni ambientali (20 °C/15 °C di temperatura, 50 ± 8% UR), ottenendo un deficit di pressione di vapore diurno (VPD) di 1,28 ± 0,1 kPa (cf. Figura 3 C).
    3. Aumentare la domanda atmosferica fino a un VPD diurno di 2,45 ± 0,4 kPa innalzando la temperatura a 27 °C/20 °C e riducendo l'UR al 35%, mantenendo l'umidità del terreno all'80% PAW.
    4. Successivamente, ridurre progressivamente l'umidità delle rhizobox fino al 40% PAW, corrispondente a un contenuto idrico di 0,215 cm3 cm-3, sospendendo l'irrigazione. Ripristinare le condizioni ambientali iniziali con bassa domanda atmosferica (VPD di 1,28 kPa).
    5. Combinare gli stress aumentando la domanda atmosferica fino a un VPD di 2,45 kPa e mantenendo l'umidità del terreno al 40% PAW.

4. Metodi di imaging delle radici

  1. Combinare metodi di imaging per sfruttarne i rispettivi vantaggi, in base alle informazioni desiderate.
    1. Applicare l'imaging RGB nell'intervallo del visibile (VIS) per monitorare nel tempo la crescita, l'architettura e la morfologia delle radici, il che richiede implicitamente misurazioni frequenti. I vantaggi dell'imaging RGB sono: (i) costi ridotti, (ii) acquisizione rapida delle immagini, (iii) bassi requisiti di spazio su disco rigido (dimensione dell'immagine: 48 MB) e (iv) alta risoluzione (3648 x 5472 pixel).
    2. Utilizzare l'imaging iperspettrale (HSI) nell'intervallo del vicino infrarosso (NIR) quando sono richieste informazioni chemiometriche su radici e suolo. I vantaggi sono: (i) caratteristiche spettrali utili per la segmentazione tra radici e sfondo del suolo e (ii) accesso a proprietà fisico-chimiche del sistema (ad esempio contenuto idrico del suolo, età delle radici). Gli svantaggi sono: (i) tempo di scansione maggiore (circa 16 minuti per rizobox), (ii) dimensioni elevate dei dataset (13,7 GB per immagine di rizobox), (iii) risoluzione inferiore della telecamera NIR (320 x 256 pixel) e (iv) maggiore complessità nell'analisi dei dati.
  2. Imaging RGB delle radici
    1. Utilizzare una scatola per imaging (Figura 4) che schermi dalla luce ambientale e fissi la posizione della fotocamera, costituita da una struttura metallica larga 1 m e alta 1 m, con pareti laterali rivestite in truciolato. All’estremità frontale, fissare la fotocamera in due posizioni a una distanza di 80 cm dal rizobox.
      1. Applicare un nastro metrico sul telaio del rizobox con nastro adesivo trasparente e posizionare il rizobox nel supporto della scatola per imaging.
      2. Illuminare il rizobox utilizzando quattro tubi fluorescenti da 24 W montati a una distanza di 80 cm dal rizobox. Montare inoltre quattro tubi UV da 15 W a 20 cm dal rizobox come illuminazione alternativa, sfruttando l'autofluorescenza delle radici in caso di basso contrasto tra radice e sfondo del substrato (di colore chiaro).
      3. Acquisire due immagini (posizione superiore e inferiore) per coprire la metà superiore e quella inferiore di un rizobox, con un’area di sovrapposizione di circa 3 cm.
    2. Acquisire immagini RGB con una fotocamera reflex digitale a obiettivo singolo, fissata alle rispettive posizioni della scatola per imaging mediante piastre a sgancio rapido.
      1. Applicare le seguenti impostazioni quando si utilizzano i tubi fluorescenti. Adattare tali impostazioni di esempio a eventuali variazioni nelle dimensioni, nell'illuminazione o nel modello della fotocamera.
        1. Disattivare l'autofocus e lo stabilizzatore sull'obiettivo della fotocamera. Impostare la fotocamera in modalità manuale.
        2. Impostare la sensibilità ISO a 500. Impostare il tempo di posa a 13. Impostare il diaframma a 5,6.
        3. Disattivare il blocco dello specchio. Impostare il bilanciamento del bianco su Bilanciamento del bianco automatico.
      2. Utilizzare le seguenti impostazioni per l'illuminazione con tubi UV:
        1. Disattivare l'autofocus e lo stabilizzatore sull'obiettivo della fotocamera. Impostare la fotocamera in modalità manuale.
        2. Impostare la sensibilità ISO a 1000. Impostare il tempo di posa a 13. Impostare il diaframma a 5,6.
        3. Disattivare il blocco dello specchio. Impostare il bilanciamento del bianco su Fluorescenza.
    3. Unire le immagini RGB acquisite dalla parte superiore e inferiore del rizobox in un'unica immagine mediante un editor fotografico (ad esempio Adobe Photoshop). Utilizzare il nastro metrico sul telaio laterale dei rizobox e verificare gli oggetti sovrapposti (radici e caratteristiche del suolo).
      1. Copiare le due immagini separate, ciascuna con dimensione di 3648 x 5472 pixel, in un nuovo file di dimensione 3648 x 10944 pixel con sfondo bianco.
      2. Ridurre l'opacità del livello di un'immagine al 60% e allineare le parti sovrapposte delle immagini (nastro metrico, oggetti). Successivamente ripristinare l'opacità del livello al 100%.
      3. In base al righello presente nell'immagine, aggiungere due linee rosse di esattamente 1 cm nella parte superiore dell'immagine, dove non sono presenti radici. Queste linee verranno utilizzate successivamente nell'analisi delle immagini per scalare correttamente le dimensioni lineari.
      4. Unire tutti i livelli e rimuovere le parti dell'immagine esterne alla finestra contenente il suolo, utilizzando lo strumento di ritaglio.
      5. Salvare l'immagine in formato tiff per ulteriori analisi.
      6. Nel caso di immagini acquisite con illuminazione UV, ridurre i colori a scala di grigi prima del salvataggio, utilizzando la barra degli strumenti Regolazioni-Nero & Bianco e selezionando il filtro predefinito Alto contrasto blu.
    4. Per la segmentazione tra radici e sfondo del suolo e per la quantificazione di caratteristiche radicali di interesse (ad esempio lunghezza, superficie, diametro, ramificazione), utilizzare un qualsiasi software di analisi radicale (vedere www.plant-image-analysis.org per gli strumenti disponibili). In questo caso si utilizza WinRhizo.
      1. Aprire l'immagine tiff del rizobox nel software.
      2. Calibrare la scala delle lunghezze dell'immagine utilizzando le barre di riferimento aggiunte all'immagine.
      3. Selezionare In base al colore nel menu Analisi, quindi scegliere Distinzione radice e sfondo.
      4. Definire un file di calibrazione con classi di colore corrispondenti a radici e suolo (sfondo). Per le immagini di esempio utilizzate qui (cf. Figura 8) vengono definite tre classi di colore per le radici (laterali vecchie, laterali giovani, radice principale) e tre classi di colore per il suolo.
      5. Per le immagini in scala di grigi (illuminazione UV), selezionare (i) In base ai livelli di grigio e (ii) Radice chiara su sfondo nero nel menu Distinzione radice e sfondo e utilizzare una soglia di intensità locale Lagarde per la segmentazione.
      6. Aprire un file dati in cui salvare i risultati.
      7. Eseguire l'analisi e successivamente verificare la presenza di aree (ad esempio ai bordi) mal classificate. In tal caso, definire un'area di esclusione e riavviare l'analisi. Per le radici non classificate, aggiungere ulteriori classi di colore e riavviare l'analisi. Per gli elementi erroneamente classificati come radici, attivare/aumentare le opzioni di filtro Detriti e bordi irregolari.

Impianto di acquisizione immagini della pianta con lampade UV e alogene; supporto per rhizobox, montaggi per fotocamera per l'analisi di radici e chioma.
Figura 4: Scatola per l'acquisizione di immagini RGB dei rhizobox.
Vista sinistra del lato frontale, dove i rhizobox sono fissati per l'acquisizione delle immagini con le sorgenti luminose all'interno; vista destra del lato posteriore, dove è montata la fotocamera. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

  1. Imaging iperspettrale delle radici
    1. Configurazione hardware
      1. Utilizzare un sistema di imaging iperspettrale per radici (Figura 5) composto da (i) una telecamera NIR monocromatica raffreddata termoelettricamente da 14 bit, con un intervallo spettrale da 900 nm a 1700 nm, risoluzione di 320 per 256 pixel e frequenza di acquisizione di 100 Hz, e (ii) uno spettrografo di imaging con intervallo spettrale da 900 nm a 2500 nm e risoluzione spettrale di 3,6 nm. Disporre una sorgente di illuminazione a linea alogena (quattro faretti alogeni da 50 W) in geometria 45°/-45°. Montare il sensore di imaging su un sistema di posizionamento a due assi. La finestra di scansione ha dimensioni di 240 x 1000 mm, ovvero 30 mm su ciascun bordo della rizocassa non sono coperti dall'immagine.
      2. Controllare il sistema mediante uno script Matlab per (i) l'acquisizione degli standard bianco e scuro, (ii) l'impostazione del tempo di integrazione della telecamera, (iii) la selezione della risoluzione spaziale (dimensione del pixel 0,1 mm; dimensione del pixel 1,0 mm) e spettrale (tutte le 222 bande spettrali con risoluzione di 3,6 nm; spettro filtrato con 54 bande e risoluzione di 14,8 nm), e (iv) la definizione dell'area di scansione sulla rizocassa.
      3. Salvare le immagini in formato SIF. Per evitare problemi durante il salvataggio di file di grandi dimensioni, suddividere ogni passo di scansione (9 passi per rizocassa) in quattro segmenti (tre di lunghezza 300 mm, uno di lunghezza 100 mm) e salvarli separatamente con un nome univoco composto dal numero del passo (da 1 a 9), dalla parte (da 1 a 4), dalla data e dall'ora (AAAA.MM.GG HH:MM:SS). Un'intera scansione della rizocassa richiede uno spazio su disco rigido di 13,7 GB.
    2. Acquisizione e analisi delle immagini.
      NOTA: Figura 6 mostra i passaggi di acquisizione, segmentazione e analisi delle immagini.
      1. L'acquisizione delle immagini comprende la selezione delle impostazioni della telecamera per una qualità ottimale e la definizione dei parametri di scansione.
        1. Determinare i tempi di integrazione della telecamera per la scansione della rizocassa e per lo standard bianco tramite il software della telecamera.
          1. Aprire l'interfaccia grafica di imaging e spostare la telecamera in una posizione della rizocassa in cui sono presenti radici.
          2. Regolare il tempo di integrazione della telecamera puntando un oggetto chiaro (ad esempio una radice) in modo che circa l'85% del range dinamico completo della telecamera venga utilizzato sull'istogramma mostrato dal software. Ripetere l'operazione per lo standard bianco spostando il sistema di posizionamento della telecamera in modo da puntare lo standard bianco. Chiudere quindi il software della telecamera.
        2. Aprire l'interfaccia grafica di imaging Matlab e impostare tutti i parametri per la scansione corrente della rizocassa. Per i dati riportati qui, utilizzare le seguenti impostazioni:
          Tempo di integrazione standard bianco: 1000
          Tempo di integrazione rizocassa: 4000
          Risoluzione spettrale: Risoluzione completa (ovvero 222 bande spettrali a intervallo stretto)
          Risoluzione spaziale completa (dimensione del pixel di 0,1 mm)
          1. Acquisire gli standard scuro e bianco prima di ogni sessione di imaging, ad esempio una volta al giorno. Lo standard scuro rappresenta il rumore della telecamera, mentre lo standard bianco fornisce la massima riflettanza. Questi dati sono necessari per la normalizzazione delle immagini durante la pre-elaborazione.
          2. Definire se viene scansionata l'intera rizocassa o solo una parte di essa. Nel caso attuale, vengono acquisite immagini di rizocasse complete. Avviare quindi la scansione.
      2. Elaborare l'immagine con uno script Matlab. Di seguito sono descritte le operazioni eseguite dallo script.
        NOTA: Gli script attualmente sono in una versione non documentata e possono essere ottenuti dal corrispondente autore. Dopo una corretta documentazione, saranno disponibili per il download dal sito web dell'istituzione del corrispondente autore (www.dnw.boku.ac.at/pb/).
        1. Comporre un intero passo di scansione dal centro della rizocassa (contenente radici) unendo le quattro parti del passo.
          NOTA: A questo stadio non è né necessario né consigliabile utilizzare un'immagine spettrale di un'intera rizocassa (ovvero tutti e 9 i passi), poiché le dimensioni del file renderebbero ogni passaggio di calcolo in Matlab molto dispendioso in termini di tempo, e le informazioni contenute in un singolo passo centrale sono sufficienti per i primi passaggi di analisi delle immagini.
        2. Normalizzare l'immagine utilizzando gli standard scuro e bianco acquisiti, tenendo conto dei diversi tempi di integrazione degli standard bianco e della rizocassa, che vengono salvati automaticamente durante la scansione in un file.
        3. Facoltativamente, applicare un filtro di smoothing per rimuovere il rumore dall'immagine. Attualmente lo script offre un filtro mediano con kernel 3x3 e una correzione multipla della diffusione. Per la valutazione delle immagini presentata qui, non viene applicato alcun filtro.
        4. Visualizzare l'immagine in tutte le bande spettrali registrate per ottenere una prima analisi e decidere la lunghezza d'onda da visualizzare per selezionare le regioni di interesse (cf. segmentazione delle immagini).
      3. Eseguire la segmentazione tra radici e fondo del suolo in uno script separato seguendo i passaggi seguenti.
        1. Selezionare le regioni di interesse (ROI) per radice e suolo al fine di individuare caratteristiche spettrali per la segmentazione. Utilizzare lo strumento di selezione a mano libera per delimitare una ROI sull'immagine visualizzata a una lunghezza d'onda precedentemente identificata con un buon contrasto tra radici e suolo. In questo caso, utilizzare tre ROI sulla radice (laterali vecchie e giovani, radice principale) e due ROI nel suolo (zona secca, zona umida).
        2. Visualizzare un rettangolo con le ROI selezionate e la parte restante come maschera nera e mostrare l'immagine delle ROI selezionate a tutte le lunghezze d'onda.
        3. Eliminare tutte le righe nella matrice dell'immagine contenenti pixel con intensità spettrale = 0 (pixel neri).
        4. Unire le ROI di radice e suolo in una matrice unica di primo piano (radice) e una di sfondo (suolo) per la segmentazione.
        5. Cercare bande spettrali (intensità di singoli spettri o rapporti spettrali) che offrano la migliore separazione tra primo piano (radice) e sfondo (suolo)27. Quantificare la distinzione tra gli istogrammi dei pixel risultanti per radice e suolo utilizzando la distanza di Bhattacharyya28.
        6. Selezionare un valore di intensità soglia che separi gli istogrammi.
        7. Creare un'immagine binaria applicando la soglia selezionata all'immagine originale. Ciò imposta a zero tutti i pixel con intensità inferiore alla soglia e a uno quelli con intensità superiore (operazione eseguita automaticamente dallo script).
        8. Salvare l'immagine binaria in formato tiff.
      4. Aprire l'immagine binaria e analizzare le caratteristiche delle radici. Selezionare (i) Basato sui livelli di grigio e (ii) Radice chiara su sfondo nero nel menu Distinzione Radice & Sfondo e utilizzare soglia di intensità globale (l'immagine è già binarizzata).
      5. Per mappare il contenuto idrico dai dati iperspettrali, acquisire un set di dati di calibrazione e applicare un'equazione di calibrazione a un'immagine della rizocassa.
        1. Suddividere una rizocassa in compartimenti da 5 cm utilizzando fogli di polistirene per riempirli con suolo (stesso substrato e db utilizzati per l'esperimento) a diversi contenuti idrici (Figura 8).
        2. Calcolare le quantità corrispondenti di acqua da mescolare al suolo e riempire i compartimenti (stesso procedimento descritto al punto 1.3. per l'intera rizocassa).
        3. Scansionare la rizocassa di calibrazione con le stesse impostazioni utilizzate per le rizocasse piantumate.
        4. Eseguire i seguenti passaggi utilizzando uno script.
          1. Unire le quattro parti di un passo dalla scatola di calibrazione dell'acqua in un unico passo e normalizzarlo con gli standard scuro e bianco.
          2. Selezionare riquadri rettangolari in ciascun compartimento con diverso contenuto idrico e salvarli in un array strutturato.
          3. Individuare la caratteristica spettrale che meglio separa i compartimenti con diverso contenuto idrico. Questo viene fatto con un algoritmo di ricerca del massimo globale delle differenze di intensità tra gli spettri medi di contenuti idrici adiacenti.
          4. Calcolare il valore medio di intensità spettrale per questa caratteristica in ciascun compartimento della rizocassa di calibrazione.
          5. Adattare un'equazione di regressione attraverso il contenuto idrico misurato direttamente e il corrispondente quantificatore spettrale.
          6. Applicare l'equazione di regressione a ciascun pixel non classificato come radice in un'immagine della rizocassa e per la caratteristica spettrale (banda) determinata in precedenza, che meglio si correla al contenuto idrico.

Configurazione dello spettrografo per l'analisi ottica; illuminazione alogena, rizobox, unità di controllo alimentazione/movimento.
Figura 5: Scanner iperspettrale per radici.
Sono indicati i componenti principali dello scanner. L'immagine più piccola mostra la telecamera durante l'acquisizione di un rizobox. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Diagramma dell'analisi di imaging iperspettrale: configurazione dell'acquisizione, segmentazione, mappatura dell'acqua, analisi chemiometrica.
Figura 6: Passaggi nell'imaging iperspettrale delle radici.
L'imaging iperspettrale delle radici comprende tre fasi principali: (i) acquisizione delle immagini, (ii) segmentazione delle immagini e (iii) analisi dei dati spettrali. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Esperimento sulla germinazione dei semi; gradienti di umidità su polistirolo e carta per germinazione.
Figura 7: Rhizobox per la calibrazione dell'acqua.
Il rhizobox contiene compartimenti con substrato a diverso contenuto idrico, suddivisi da fogli di polistirolo. La carta per germinazione nei compartimenti asciutti garantisce che le particelle di suolo non si spostino nei compartimenti adiacenti. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

5. Esempi di applicazione

NOTA: Le informazioni quantitative relative alle radici vengono applicate nel contesto della fenotipizzazione vegetale (confronto tra cultivar) e della ricerca fisiologica vegetale. I seguenti dati sopra il livello del suolo sono riportati per illustrare questi casi.

  1. Area fogliare: Misurare l'area fogliare in modo non distruttivo in fasi selezionate durante l'esperimento, utilizzando la lunghezza e la larghezza delle foglie come parametro indicativo. In alternativa, possono essere utilizzate immagini della chioma29.
    1. Al termine dell'esperimento, misurare la lunghezza, la larghezza e l'area delle foglie campionate mediante un misuratore di superficie fogliare. Calibrare il metodo non distruttivo applicando un'equazione di regressione alle coppie di dati.
  2. Materia secca: Alla fine dell'esperimento, misurare la materia secca aerea tagliando le piante con forbici e asciugandole per 24 ore a 105 °C in una stufa.
  3. Conduttanza stomatica: Misurare la conduttanza stomatica con un porometro fogliare. Prima della misurazione, mantenere lo strumento per almeno un'ora nella camera climatica per permettere ai sensori di equilibrarsi con le condizioni ambientali e calibrare lo strumento ogni volta che le condizioni ambientali nella camera climatica cambiano. Effettuare le misurazioni su almeno tre foglie per pianta.

Risultati

Vengono presentati risultati di esempio per la segmentazione delle radici basata su immagini RGB e HS. Per l'immagine spettrale, viene fornito un esempio di mappatura ad alta risoluzione dell'acqua. Infine, vengono mostrati risultati che dimostrano il contesto scientifico in cui i dati delle radici basati su immagini vengono applicati.

Misurazione della radice basata su RGB

Figura 8 mostra una serie temporale di immagini RGB delle radici della coltivar di barbabietola da zucchero Ferrara. Le immagini rivelano alcuni artefatti dovuti a un'illuminazione non omogenea delle rizocasse, con aree più luminose lungo il lato sinistro e diverse intensità luminose nella zona di sovrapposizione tra le immagini superiori e inferiori.

Studio della crescita delle radici in RGB, barbabietola da zucchero 'Ferrara,' giorni 20-35, analisi in time-lapse, diagramma di crescita.
Figura 8: Serie temporale della crescita radicale ottenuta dall'imaging RGB.
Le immagini mostrano la cultivar di barbabietola da zucchero Ferrara a diversi giorni dopo la semina (DAS). Le immagini mostrano alcuni artefatti dovuti a un'illuminazione non omogenea sul lato sinistro dell'immagine e tra le immagini superiori e inferiori. Le barre della scala corrispondono a 2 cm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 9 mostra i dettagli della segmentazione delle radici basata sulla soglia di colore per la varietà Ferrara al giorno dalla semina (DAS) 35. Come riferimento (Figura 9A), viene utilizzata un'immagine binaria in cui tutte le radici sono state tracciate manualmente mediante una tavoletta grafica. Il tempo necessario per il tracciamento manuale dell'intero sistema radicale, completamente sviluppato e denso, della barbabietola da zucchero è stato di circa quattro ore. Figura 9B fornisce una vista dettagliata di un'area selezionata nella parte superiore dell'immagine, dove sono presenti radici laterali vecchie. In questo caso, diversi assi radicali non vengono classificati sulla base della soglia di colore. Al contrario, nella parte inferiore (Figura 9C), dove prevalgono le radici giovani di colore bianco, la segmentazione basata sul colore classifica correttamente tutti gli assi radicali. Il sistema radicale binarizzato (Figura 9D) mostra un'area nera sul lato sinistro, dovuta a un artefatto di illuminazione, definita come regione di esclusione prima dell'analisi quantitativa. Figura 9E mostra gli istogrammi corrispondenti dei pixel relativi a caratteristiche selezionate (radici vs. suolo) per il canale rosso dell'immagine RGB di Ferrara al DAS 35. I pixel delle radici (colore blu) mostrano chiaramente tre picchi corrispondenti a laterali giovani luminose, laterali vecchie scure e radice principale. L'overlap tra le laterali vecchie e lo sfondo del suolo è molto intenso, portando a radici non classificate (cf. Figura 9B).

Diagramma di segmentazione delle radici basato sui colori RGB con analisi istogrammica dei tipi di radici e differenziazione del suolo.
Figura 9: Segmentazione delle radici mediante soglia cromatica.
(A) Sistema radicale segmentato manualmente utilizzando una tavoletta grafica, (B) area con assi radicali vecchi scarsamente segmentati nella parte superiore e (C) assi giovani correttamente segmentati nella parte inferiore dell'immagine, e (D) immagine binaria ottenuta mediante sogliatura basata sul colore. (E) Istogrammi dei pixel per le caratteristiche selezionate dell'immagine RGB. Le radici sono rappresentate dalle barre blu con indicazione dei diversi tipi radicali; il suolo è rappresentato dalle barre rosse. Barre della scala in A e D, 2 cm; barre della scala in B e C, 1 cm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

La lunghezza totale delle radici visibili risultante quantificata per l'immagine di riferimento segmentata manualmente è di 1534,1 cm, mentre la segmentazione automatizzata basata sul colore fornisce una lunghezza totale delle radici di 1427,6 cm.

Le immagini in scala di grigi ottenute con illuminazione UV non offrono vantaggi nel caso qui mostrato e hanno prestato peggio rispetto alla sogliatura a colori (lunghezza delle radici: 1679,7 cm). Le radici vecchie non sono state segmentate e nell'immagine era presente un rumore maggiore, probabilmente a causa dell'intensità luminosa inferiore delle lampade UV. Tuttavia, nel caso di radici giovani con elevata autofluorescenza e un substrato di fondo luminoso, l'illuminazione UV può comunque rappresentare un'opzione, come mostrato da un'immagine ottenuta da un altro esperimento in cui la sabbia è stata utilizzata come substrato di fondo (Figura 10).

Microscopia a fluorescenza; struttura della radice; a sinistra: immagine confocale con tonalità blu, a destra: immagine in campo chiaro.
Figura 10: Illuminazione UV per visualizzare le radici su sfondo chiaro.
Esempio di un sistema radicale di grano duro in crescita in una rizocassa riempita con sabbia di quarzo. La rizocassa è stata immaginata con illuminazione per (A) luce UV e (B) luce fluorescente (diurna). Le barre della scala corrispondono a 2 cm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Misurazioni della radice basate sull'HSI

Figura 11 mostra gli spettri medi di tre aree di interesse radicale (laterale vecchia e giovane, radice principale) e di due aree di interesse del suolo (parte superiore e inferiore della rizobox).

Grafico dell'analisi spettrale delle radici, riflettanza normalizzata rispetto alla lunghezza d'onda, confronti tra suolo e radici.
Figura 11: Spettri medi di radice e suolo.
Spettri provenienti da regioni di interesse (ROI) sulla radice (tre tipi di radice) e nel suolo (parte superiore e inferiore del rizobox). Le ROI sono selezionate per determinare un criterio ottimale di segmentazione tra radice e suolo. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

È evidente che le radici principali e le radici laterali giovani differiscono sostanzialmente dal fondo per l'intensità della maggior parte delle bande spettrali. Per le radici laterali vecchie, le differenze di intensità sono molto più basse. Una caratteristica che può essere dedotta visivamente è la diversa pendenza dello spettro nella regione di assorbimento dell'acqua (1450 nm). In questa zona, la pendenza degli spettri delle radici è maggiore rispetto a quella degli spettri del suolo. Inoltre, si può osservare un cambiamento negli spettri della radice principale e delle radici laterali giovani nella regione intorno a 1100 nm, che non si verifica nelle radici laterali vecchie.

Figura 12A mostra il risultato dell'algoritmo di ricerca che identifica un rapporto spettrale con il massimo contrasto tra primo piano e sfondo. Il rapporto tra gli spettri a 1476 nm e 1076 nm fornisce la migliore separazione tra radici e suolo. L'istogramma risultante dei pixel relativi al primo piano delle radici e allo sfondo del suolo è mostrato in Figura 12B. Sebbene vi sia un certo sovrapposizione, la maggior parte dei pixel è chiaramente separata dallo sfondo del suolo. Adattando una curva gaussiana bimodale all'istogramma e utilizzando la distanza di Bhattacharyya per la quantificazione, si ottiene un valore di 7,80. Un valore superiore a 3,0 indica un forte contrasto dell'immagine, che permette una separazione affidabile28.

Mappa termica spettrale e istogramma per l'analisi dell'intensità delle lunghezze d'onda; analisi dei dati di emissione ottica.
Figura 12: Differenza di riflettanza tra la porzione di radice in primo piano e lo sfondo del suolo per diversi rapporti spettrali e istogramma dei pixel al rapporto spettrale utilizzato per la segmentazione.
(A) I colori chiari (giallo) indicano un alto contrasto tra primo piano e sfondo, mentre i colori scuri (blu) indicano un basso contrasto. Le prime 15 bande sono state rimosse a causa del rumore. Le linee rosse indicano il rapporto tra bande con il contrasto più elevato. (B) Istogramma dei pixel delle radici (blu) e del suolo (rosso) al rapporto spettrale di segmentazione. Le barre blu rappresentano la radice e le barre rosse il suolo. Il valore di intensità corrisponde al rapporto tra la banda spettrale 160 e la banda spettrale 49. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

L'immagine binaria (Figura 13) viene creata applicando una soglia di intensità globale al rapporto spettrale identificato con un valore di 1,008 calcolato dalla distanza dell'istogramma27. L'analisi della lunghezza delle radici di questa immagine fornisce una lunghezza totale di 1557,3 cm, che corrisponde a un errore del solo 1,5% rispetto all'immagine di riferimento tracciata manualmente.

Diagramma della struttura della rete neurale; albero dendritico; immagine al microscopio; visualizzazione della connettività neuronale.
Figura 13: Immagine binaria del sistema radicale della varietà di barbabietola da zucchero Ferrara.
L'immagine è stata ottenuta applicando una soglia spettrale globale. Barra della scala (angolo in basso a sinistra), 2 cm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Sebbene la segmentazione delle radici si sia migliorata utilizzando informazioni spettrali rispetto a quelle basate sul colore, l'obiettivo principale dell'immagine iperspettrale è l'analisi delle proprietà chimicometriche dell'immagine. Questo viene illustrato tramite la mappatura del contenuto di acqua di un'immagine di una rhizobox.

Figura 14A mostra gli spettri medi dei compartimenti nella rizocassa di calibrazione (cf. Figura 7) riempita con suolo a diverso contenuto idrico. La forma degli spettri è simile tra i compartimenti, pertanto in questo caso un rapporto spettrale non fornisce necessariamente un criterio di classificazione più stabile. Di conseguenza, l'intensità in una singola banda spettrale (1680 nm), in corrispondenza della quale la differenza media tra contenuti idrici adiacenti è massimizzata, viene identificata come il criterio migliore per la separazione. Gli istogrammi dei pixel risultanti per questa lunghezza d'onda spettrale sono mostrati in Figura 14B.

Grafici di analisi spettrale; (A) spettri di assorbimento, (B) distribuzione dell'intensità per gli stati umido-secco.
Figura 14: Caratteristiche spettrali per la calibrazione del contenuto di acqua.
(A) Spettri medi di nove compartimenti di acqua dalla scatola radicale di calibrazione con diversi contenuti idrici; (B) Istogrammi dei pixel per i compartimenti di acqua alla banda 216, dove la distanza media tra compartimenti adiacenti è massima. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

La relazione tra l'intensità media del pixel a 1680 nm e il contenuto di acqua misurato è mostrata nella Figura 15.

Grafico dell'umidità del suolo; adattamento esponenziale e lineare. Contenuto d'acqua rispetto alla riflettanza; capacità di campo, punto di appassimento.
Figura 15: Relazione tra riflettanza spettrale e contenuto volumetrico d'acqua.
La figura mostra coppie di dati di contenuto d'acqua misurato e riflettanza spettrale, con curve empiriche (lineare ed esponenziale) adattate ai dati escludendo i contenuti d'acqua più elevati (triangoli rossi). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

La differenziazione di contenuti idrici più elevati in base all'intensità spettrale diventa difficile. Una regressione significativa (lineare o esponenziale) con alto valore di R2 può essere adattata ai contenuti idrici fino a circa 0,30 cm3 cm-3. Le condizioni di suolo più umido non possono essere previste in modo affidabile tramite il valore di intensità. Un comportamento simile, caratterizzato da una relazione esponenziale tra riflettività e contenuto idrico con una risposta decrescente per contenuti idrici superiori a 0,30 cm3 cm-3, è stato riscontrato anche in altri studi30.

Un'immagine di una rizocassa con una mappatura dettagliata del contenuto idrico è mostrata in Figura 16. Vanno evidenziati quattro aspetti. Primo, si può osservare una regione con contenuto idrico inferiore nelle parti della rizocassa con radici. Secondo, il maggiore esaurimento è concentrato nelle vicinanze di assi radicali singoli. Terzo, si verificano zone di deplezione anche dove non sono visibili assi radicali sulla superficie, indicando aree in cui le radici sono nascoste nel suolo. Quarto, la mappatura dell'acqua senza ulteriore elaborazione dell'immagine produce un aspetto irregolare a causa dell'aggregazione del suolo. Ciò può indicare una distribuzione eterogenea del contenuto idrico alla scala dell'aggregato, ma anche effetti della morfologia superficiale sulla qualità dell'immagine. Tecniche chemiometriche di elaborazione delle immagini rappresentano un'opzione per superare tali effetti morfologici nelle immagini spettrali31, ma finora non sono state implementate negli script Matlab utilizzati in questo contesto.

Diagramma della struttura del neurone; dettaglio dei rami dendritici nell'analisi della rete neurale.
Figura 16: Mappatura del contenuto idrico in un rhizobox.
Le tonalità blu scuro rappresentano aree con elevato contenuto idrico, mentre le zone verdi fino al rosso indicano regioni con basso contenuto idrico. La radice della pianta è sovrapposta all'immagine in nero. Scala grafica (angolo in basso a sinistra), 2 cm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Esempi di applicazione

Figura 17 mette in relazione tratti radicali quantitativi ottenuti dall'analisi delle immagini con misurazioni della parte aerea.

Analisi dei dati sulla crescita delle piante; grafici della lunghezza delle radici, rapporto area superficiale, materia secca, conduttanza degli stomi.
Figura 17: Esempi tipici di applicazione per i dati radicolari.
(A) e (B) mostrano informazioni sulle radici utilizzate per la caratterizzazione della parte aerea e sotterranea della pianta in un contesto di fenotipizzazione. (A) rappresenta la crescita radicale della varietà di barbabietola da zucchero Ferrara, (B) confronta sei varietà di barbabietola da zucchero coltivate in rizobox utilizzando il rapporto tra area fogliare e area radicale (dati da un'unica replica). (C) e (D) sono relazioni funzionali tra caratteri come si riscontrano nella ricerca fisiologica vegetale. (C) mostra l'influenza del rapporto tra area fogliare e area radicale sulla produzione di materia secca e (D) la relazione tra area superficiale radicale e conduttanza stomatica. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 17A e 17B sono pertinenti per la fenotipizzazione incentrata sulla caratterizzazione completa della parte aerea e della parte sotterranea della pianta. Figura 17A mostra la crescita radicale del cultivar di barbabietola da zucchero Ferrara (cf. Figura 8 per le immagini). L'espansione del sistema radicale indica la capacità di un cultivar di esplorare il volume del suolo in un determinato lasso di tempo del periodo vegetativo. Figura 17B mostra il rapporto tra superficie fogliare e superficie radicale di sei cultivar di barbabietola da zucchero, fornendo un parametro descrittivo dell'equilibrio tra fornitura (radice) e domanda (foglia) della pianta.

Figure 17C e 17D mostrano esempi di relazioni funzionali di interesse nella ricerca fisiologica. In Figura 17C il rapporto tra superficie fogliare e radicale è correlato alla massa secca formata durante l'esperimento, indicando il ruolo predominante della superficie assimilante come fattore limitante per l'accumulo di massa secca. La mancanza di significatività, nonostante un valore di R2 relativamente alto, è legata al ridotto numero di dati accoppiati (n=6) utilizzati in questo caso. Figura 17D rivela che i cultivar con maggiore superficie radicale (assorbimento migliorato) presentano una conduttanza stomatica media più elevata nel corso dell'esperimento. L'area radicale maggiore sostiene evidentemente l'estrazione d'acqua, prolungando così l'apertura degli stomi.

Discussione

I protocolli prevedono due approcci complementari terreno coltivato imaging system di root. Un passaggio fondamentale per ottenere risultati sperimentali affidabili si sta riempiendo di rizobox che deve garantire un livello di substrato uniforme ed omogeneo nel vetro anteriore per offrire suolo-radice stretto contatto nella finestra di osservazione ed evitare vuoti d'aria. Questo è il motivo principale per utilizzare terra comparativamente fine setacciata di < 2 mm: più grandi aggregati provocare la morfologia superficiale superiore alla finestra di osservazione con i vuoti tra gli aggregati. Oltre ad un elevato rischio di disidratazione di punta di radice, questo richiede anche più complesse tecniche di elaborazione di immagini per acqua mappatura31.

Modifiche del protocollo, pertanto concentrano sul migliore e rapido riempimento di rizobox. Attualmente il tempo di riempimento è circa 30 minuti per scatola. Inoltre l'uso di rizobox con due finestre di vetro per l'imaging da entrambi i lati e modifiche per ottimizzare l'omogeneità di illuminazione per ottenere immagini migliori RGB vengono testati. Ulteriore estensione hardware anche considerare l'integrazione di planare optodi32 , nonché capacità di imaging33 nel sistema rhizobox. Si tratta tuttavia oltre le attività di aggiornamento corrente.

Modifiche del software di concentrano sulla registrazione automatica dell'immagine per fondere la parte superiore e inferiore RBG immagini34. Hyperspectral imaging avanzate funzione senza supervisione di estrazione si avvicina per28 , nonché metodi di rilevazione più sensibile obiettivo sorvegliato come SVMs35 sono testati. Quindi i dati iperspettrali potenzialmente consentono per la valutazione di più terreno, rizosfera e radice di proprietà36. Inoltre si intende sviluppare un (semi) automatizzato software per rhizobox radice immagini basato su una versione modificata di radice sistema analizzatore37 quantificare morfologiche (lunghezza, diametro, superficie) e tratti architettonici (frequenza ramificazione, ramificazione angoli).

La principale limitazione del protocollo rispetto ad approcci di imaging 3D è la restrizione per la superficie visibile radice e la proprietà di rizosfera. Tuttavia è stato dimostrato che i tratti visibili radice sono un proxy affidabile per l' intero sistema della radice21. La tecnica di rhizobox è facilmente combinato con campionamento distruttivo tradizionale (lavatrice) alla fine di una crescita dinamica imaging al fine di convalidare la relazione di visibile vs totale radice sistema tratti. Come questa relazione potrebbe variare tra specie21, campionamento distruttivo è consigliabile per garantire affidabile inferenza dai tratti visibili per qualsiasi nuova serie fenotipizzazione con una specie di colture diverse.

Il vantaggio fondamentale del protocollo presentato qui è la combinazione di condizioni di crescita realistiche (suolo), potenziale relativamente alto throughput per la temporaneamente risolto dell'imaging RGB e inferenza sulla funzionalità di radice (ad esempio l'assorbimento di acqua) tramite i dati di radice e rizosfera chemiometrica da imaging iperspettrale. Quindi i metodi supera le restrizioni di inferenza in semenzale elevato throughput e fuori suolo radice imaging metodi14, mentre permette parzialmente intuizioni profonde che phenotyping processi funzionali con complessità meno sperimentale e un throughput più elevato rispetto ai metodi avanzati 3D15.

Nei prossimi esperimenti utilizzerà il protocollo per studiare l'effetto di Micorriza sullo sviluppo del sistema della radice e funzionalità dei legumi anche per quanto riguarda le caratteristiche di radice fenotipizzazione di coltura di copertura specie in relazione alla struttura del suolo, di azoto e di carbonio in bicicletta.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori riconoscono finanziamenti dal fondo austriaco scienza FWF tramite il progetto numero P 25190-B16 (le radici della resistenza alla siccità). Istituzione dell'infrastruttura imaging iperspettrale è stato sostenuto finanziariamente dal federale governo della Bassa Austria (Land Niederösterreich) tramite il progetto K3-F-282/001-2012. Finanziamenti supplementari per l'esperimento di barbabietola da zucchero è stato ricevuto dalla ricerca AGRANA & Innovation Center GmbH (ARIC). Gli autori ringraziano Craig Jackson per il supporto tecnico durante l'esperimento e inglese correzione del manoscritto. Riconosciamo anche Markus Freudhofmaier che hanno contribuito alla istituzione l'installazione di immagini RGB e Josef Schodl per la costruzione del supporto del rhizobox.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
RhizoboxTechnisches Bü ro fü r BodenkulturCostruttore
Lampade LED ATUM HORTI 600KlutronicAHI10600F
Tubo luminoso fluorescente HiLite T5 DayJuwel Aquarium86324
Tubo luminoso UV Eurolite 45cm slim 15 WConrad593384 - 62
Canon EOS 6DCanon Austria GmbH8035B024
Adobe Photoshop CS5 Extended Version 12.0 x 32Adobe Systems Software Ireland Ltd.
WinRhizo Pro v. 2013Regent Instruments Inc.
Xeva-1.7-320 Telecamera SWIRXenicsXEN-000105
Spettrografo Imspector N25ESpecim
Scanner di imaging iperspettraleCarinthian Tech Research AGCostruttore sperimentaleProgettazione e assemblaggio di scanner e software di imaging iperspettrale
Matlab R2106aMathworksComprese le cassette degli attrezzi per l'elaborazione delle immagini, l'elaborazione dei segnali, le statistiche e l'apprendimento automatico
AP4 PoromoeterDelta-T-Devices
LI-3100C Misuratore di areaLI-COR
BASF Fogli di polistirene StyradurObi Baumarkt9706318È possibile utilizzare diversi tipi di fogli di polistirene o altro materiale che separano il terreno con umidità diversa
sperimentale

Riferimenti

  1. Kutschera, L. Wurzelatlas mitteleuropäischer Ackerunkräuter und Kulturpflanzen. , DLG-Verlags-GmbH, Frankfurt am Main. (1960).
  2. Kenrick, P., Strullu-Derrien, C. The origin and early evolution of roots. Plant Physiol. 166, 570-580 (2014).
  3. Franklin, J., Serra-Diaz, J. M., Syphard, A. D., Regan, H. M. Global change and terrestrial plant community dynamics. PNAS. 113, 3725-3734 (2016).
  4. MacDonald, G. K., Bennett, E. M., Potter, P. A., Ramankutty, N. Agronomic phosphorus imbalances across the world's croplands. PNAS. 108, 3086-3091 (2011).
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