Articolo metodologico

RGB e Imaging spettrale radice per pianta Phenotyping e ricerca fisiologica: messa a punto sperimentale e protocolli di Imaging

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DOI:

10.3791/56251

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8 agosto 2017

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1Division of Agronomy, Department of Crop Sciences, University of Natural Resources and Life Sciences, 2Carinthian Tech Research AG, High Tech Campus Villach, 3Computational Science Center, University of Vienna, 4Simulationswerkstatt

In questo articolo

Sommario

Un protocollo sperimentale è presentato per la valutazione del terreno coltivato pianta radice sistemi con RGB e l'imaging iperspettrale. Combinazione di tempo di immagine RGB serie con chemiometrica informazioni da iperspettrale scansioni ottimizza intuizioni nelle dinamiche di radice di pianta.

Abstract

Migliore comprensione delle dinamiche di radice di pianta è essenziale per migliorare l'efficienza di utilizzo delle risorse dei sistemi agricoli e aumentare la resistenza delle cultivar di raccolto contro stress ambientali. Un protocollo sperimentale è presentato per RGB e l'imaging iperspettrale degli apparati radicali. L'approccio utilizza rizobox dove le piante crescono in terreno naturale sopra un tempo maggiore per osservare completamente sviluppati sistemi della radice. Impostazioni sperimentali sono esemplificate per valutare rhizobox piante sotto stress idrico e studiare il ruolo delle radici. Un'installazione di imaging RGB è descritto per quantificazione economico e veloce lo sviluppo delle radici nel tempo. L'imaging iperspettrale migliora la segmentazione radice dallo sfondo del suolo rispetto alla soglia di colore basata RGB. Il punto di forza dell'imaging iperspettrale è l'acquisizione di chemiometrica informazioni sul sistema suolo-radice per comprensione funzionale. Questo è dimostrato con mapping contenuto di acqua di alta risoluzione. Formazione immagine spettrale, tuttavia, è più complessa in immagine acquisizione, elaborazione ed analisi rispetto all'approccio RGB. Una combinazione di entrambi i metodi in grado di ottimizzare una valutazione completa dell'apparato radicale. Per il contesto della ricerca fisiologica phenotyping e pianta della pianta sono riportati esempi di applicazione l'integrazione di radice e tratti fuori terra. Ulteriore miglioramento dell'imaging di radice può essere ottenuto ottimizzando la qualità di immagine RGB con un'illuminazione migliore utilizzando diverse fonti di luce e di estensione dei metodi di analisi di immagine per dedurre il proprietà di zona di radice da dati spettrali.

Introduzione

Le radici forniscono diverse funzioni essenziali per piante come deposito di assimila, ancoraggio delle piante terrestri nel suolo e l'assorbimento e il trasporto di acqua e sostanze nutritive1. Da un punto di vista evolutivo, la formazione degli assi di radice è considerata un presupposto fondamentale per l'origine della terra piante2. Nonostante questo ruolo importante, storicamente le radici hanno occupato solo una posizione marginale nella ricerca biologica. In tempi più recenti, tuttavia, vi è crescente interesse scientifico nei sistemi di radice di pianta come evidenziato nella Figura 1.

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Figura 1: Rilevanza degli studi radice in scienze botaniche.
Numero di radice studi collegati come percentuale di tutti gli studi di pianta pubblicati in riviste SCI negli ultimi decenni. Risultato da Scopus utilizzando parole chiave "impianto" e "pianta e radice" della ricerca. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Due motivi principali possono essere ipotizzati per sottendono i recenti progressi nella ricerca di radice. Prima vegetazione terrestre è esposta a stress ambientali più frequenti a seguito di cambiamenti globali3. Nel contesto della produzione agricola si stima che globalmente circa il 30% della superficie agricola sono limitati dall'acqua e fosforo4,5. Riduzione dello stress di resa delle colture sono delle ragioni principali per le lacune di rendimento significativo che ammontano globalmente a più basso 50% di produttività potenziale per rainfed agro-ecosistemi6. Oltre alla disponibilità di risorse in esaurimento, questo è anche legato all'efficienza di uso di risorsa scarsa, cioè insufficiente capacità di una pianta di sfruttare le risorse disponibili7. Questo si traduce in perdite di risorse mobili quali nitrati che possono influenzare negativamente altri ecosistemi. L'efficienza di uso corrente di azoto globale, ad esempio, è stimato a 47%8. Uso migliore delle risorse efficienza tramite i metodi di miglioramento della gestione e cultivar è pertanto di grande importanza per entrambi sostenuta crescita dei prodotti agricoli, anche per quanto riguarda la sostenibilità ambientale. In questa pianta contesto radici sono considerate di essere un obiettivo chiave per colture migliorate e ritaglio sistemi9,10.

Una seconda importante background per il recente interesse nelle radici della pianta è progresso tecnologico nei metodi di misurazione. Metodi di radice lunga sono stati limitati da due sfide chiave: per la misurazione delle radici da piante che crescono nel terreno dovevano essere isolato per quantificazione, principalmente mediante lavaggio11, perturbi la disposizione architettonica degli assi di radice. Osservazione di radice in situ mediante scavo metodi, quindi conservare la naturale posizione delle radici nel terreno, sono stati utilizzati per Descrizione botanica12. Ancora sono molto che richiede tempo e quindi non soddisfano i requisiti di velocità effettiva del sistema della radice strutturale-funzionale comparativa analisi. D'altra parte metodi ad alta resa per la radice architettura misura principalmente sono state fatte su diete artificiali e per semenzale piante13 dove l'estrapolazione all'ambiente naturale crescita delle piante è discutibile14.

Il recente boom di ricerca principale è collegato strettamente all'anticipo del metodi15di imaging. Approcci in studi di radice di imaging possono essere approssimativamente raggruppati in tre tipi. Prima ci sono metodi 3D ad alta risoluzione come il CT e MRI16. Questi metodi sono più adatti per lo studio dei processi di interazione delle radici delle piante con il suolo, come siccità indotta xilema embolia17. In genere vengono applicati a comparativamente piccoli campioni dove permettono osservazioni dettagliate. Viene fornito un confronto del CT e di MRI per vasi di dimensioni diverse e l'imaging di radice bene in18. In secondo luogo, ci sono di alto-rendimento imaging metodi19,20. Questi metodi sono per lo più basata su comuni RGB imaging 2D di radici che crescono su diete artificiali (gel, carta di germinazione) dove il contrasto elevato consente una dissezione comparativamente semplice tra radici e sfondo. Essi sono adatti per il confronto di throughput elevato tra tratti di radice semenzale di genotipi differenti colture sotto crescente artificiale standardizzata circostanze13. Tra questi due approcci sono metodi rhizobox: usano imaging 2D di radici che crescono nel terreno nel più lungo periodo di tempo ed hanno velocità effettiva media21,22. Una sfida risale all'imaging di radice (2D) è quello di catturare anche indicatori di funzionalità principale oltre a descrizione della struttura23.

Nel presente documento presentiamo i protocolli sperimentali per l'imaging rhizobox cresciuto sistemi della radice mediante (i) una semplice ed economico su misura RGB imaging installazione e (ii) una configurazione più complessa di imaging NIR. Risultati di esempio ottenuti da queste due configurazioni sono mostrati e discussi nel contesto della pianta phenotyping e ricerca fisiologica della pianta.

Protocollo

1. Rizocasse per la crescita delle piante

NOTA: Il sistema sperimentale utilizza rhizobox per coltivare piante a fini di imaging radicale. In primo luogo vengono descritti il design delle scatole e il substrato utilizzato, seguiti dai dettagli sul procedimento di riempimento.

  1. Progettazione dei rhizobox
    1. Realizzare dei rhizobox (Figura 2) con una piastra posteriore e telai laterali in PVC grigio dello spessore di 15 mm. Utilizzare dimensioni della scatola di 300 mm x 1000 mm. Per la finestra frontale, usare vetro minerale da 6 mm fissato al telaio in PVC mediante guide metalliche avvitate alle pareti laterali.
    2. Praticare tre fori sul telaio inferiore per consentire lo scarico dell'acqua in eccesso. Questi fori possono essere chiusi opzionalmente con tappi di plastica filettati.
    3. Prima del riempimento, regolare il diametro interno del rhizobox (tra 10 mm e 30 mm) inserendo lastre in policarbonato alveolare. Per la maggior parte delle colture si raccomanda uno spazio interno di 10 mm, al fine di ridurre il peso complessivo del sistema (il peso del rhizobox senza terreno è di 13,2 kg).

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Figura 2: Sistema sperimentale a rizobox e i suoi componenti.
L'immagine a sinistra mostra le dimensioni di un rizobox e l'immagine a destra i singoli componenti: una piastra posteriore in PVC grigio con telaio laterale, un vetro minerale frontale, fogli a camere multiple per un diametro interno variabile e angolari metallici per fissare il vetro frontale al compartimento posteriore. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

  1. Substrato
    1. Riempire le rhizobox con terreno di campo (per questo esperimento: suolo limoso-argilloso superficiale proveniente da un chernozem calcareo) setacciato a una dimensione delle particelle di 2 mm.
    2. Aprire le rhizobox per riempire il compartimento interno (piatto posteriore con telai laterali) in posizione orizzontale utilizzando il substrato pre-umidificato. Riempire in orizzontale per evitare stratificazione e separazione tra particelle fini e grossolane, fenomeni che si verificano quando il riempimento avviene in posizione verticale versando il substrato dall'apertura superiore.
    3. Umidificare il substrato prima del riempimento. A seconda del tipo di substrato (in particolare del contenuto di limo e argilla), non superare un contenuto idrico di 0,12-0,18 cm3*cm-3 per evitare appiccicamento e degrado della struttura. Aggiungere la differenza tra il contenuto idrico iniziale e quello desiderato dopo aver riempito le rhizobox con il substrato.
      NOTA: Il riempimento con substrato (essiccato in stufa) completamente secco e l'aggiunta successiva di tutta l'acqua non è consigliato, poiché può causare un forte assestamento del substrato e la formazione di ampie fessurazioni.
  2. Esempio passo dopo passo del riempimento
    1. Definire il contenuto idrico desiderato. In questo caso è inizialmente impostato all'80% dell'acqua disponibile per le piante (PAW), condizione in cui le piante non soffrono di carenza idrica.
    2. Determinare la capacità di campo (FC) e il punto di appassimento permanente (PWP) del substrato. In questo caso, ottenere la FC utilizzando un tubo in PVC di altezza equivalente (100 cm) a quella delle rhizobox.
      1. Chiudere il tubo in basso con un tappo dotato di piccoli fori di drenaggio, aggiungere 1 cm di ghiaia per evitare l'occlusione dei fori da parte del substrato più fine e riempire con il substrato alla stessa densità apparente utilizzata per le rhizobox (1,3 g cm-3).
      2. Saturare il tubo con acqua fino a quando inizia il drenaggio e lasciarlo a riposo per due giorni per raggiungere l'equilibrio (il contenuto idrico risultante è, per definizione, equivalente alla capacità di campo), coprendo l'apertura superiore con pellicola trasparente per evitare l'evaporazione. Il valore di capacità di campo ottenuto per il suolo in questo esperimento è stato di 0,357 cm3 cm-3.
        NOTA: Il contenuto idrico al PWP deve essere noto in anticipo mediante metodi fisici standard del suolo (ad esempio misure con piatto sotto pressione24) o tramite funzioni pedotransfer basate sulla tessitura25). In questo caso, è pari a 0,12 cm3 cm-3 per il suolo utilizzato.
      3. Se si misura la FC anche mediante estrazione con piatto sotto pressione, considerare il contenuto idrico a un potenziale matriciale di h = -100 hPa e non h = -330 hPa, in modo da corrispondere alla geometria della rhizobox (altezza di 100 cm = 100 hPa).
      4. Calcolare il contenuto idrico (WC) all'80% di PAW: WC (cm3 cm-3) = 0,80 (FC-PWP) + PWP. Per i limiti idraulici del suolo utilizzato in questo esperimento, si ottiene un contenuto idrico volumetrico all'80% di PAW pari a 0,31 cm3 cm-3.
      5. Calcolare la quantità di acqua necessaria per un volume di rhizobox di 2850 cm3 (30 cm di larghezza, 1 cm di spazio interno, 95 cm di altezza, con i superiori 5 cm lasciati liberi per l'irrigazione). Si ottiene un volume di acqua di 883,5 cm3, pari a 883,5 g, considerando una densità dell'acqua di 1,0 g cm-3 a 20 °C.
    3. Definire la densità apparente (db) con cui riempire le rhizobox. In questo caso, impostata a 1,3 g cm-3, valore tipico riscontrato nei suoli agricoli di campo. La quantità di substrato secco necessaria per riempire un volume di rhizobox di 2850 cm3 a questa db corrisponde a 3705 g di suolo secco.
    4. Umidificare il suolo secco fino a un contenuto idrico gravimetrico di 0,108 g g-1 (equivalente a un contenuto idrico volumetrico di 0,14 cm3 cm-3) aggiungendo 400 g di acqua a 3705 g di suolo secco e mescolare delicatamente per ottenere una distribuzione omogenea dell'acqua. Rompere manualmente gli aggregati più grandi per mantenere la dimensione delle particelle ≤ 2 mm.
    5. Riempire le rhizobox aperte con il suolo pre-umidificato e compattarlo delicatamente utilizzando un foglio di polistirolo (30 x 10 x 1,5 cm) per coprire il volume interno della scatola, ottenendo così una db omogenea di 1,3 g cm-3.
    6. Aggiungere la quantità residua di acqua (483,2 g) per raggiungere il contenuto idrico desiderato di 0,31 cm3 cm-3 spruzzandola sulla superficie con un flacone spray. Assicurarsi che le gocce siano piccole per evitare il degrado della struttura superficiale e garantire un inumidimento omogeneo. Mantenere la scatola su una bilancia durante lo spruzzo per monitorare la quantità effettiva di acqua aggiunta al substrato.
    7. Lasciare che l'acqua si ridistribuisca per 10 minuti, quindi premere il vetro sulla superficie e fissarlo con le guide metalliche laterali. Il peso finale medio delle rhizobox con substrato umido è stato di 17818 ± 68 g (13230 g peso della rhizobox + 3705 g di suolo secco + 883 g di acqua).
      NOTA: Il contenuto idrico omogeneo presente nelle scatole orizzontali si ridistribuirà quando le scatole verranno posizionate nella loro posizione finale, in base al gradiente di potenziale risultante. Questo è un processo fisico presente in tutti i vasi per la crescita delle piante, in funzione della loro geometria (altezza), e gli sperimentatori devono essere consapevoli dell'idraulica dei loro vasi26.

2. Configurazione della stanza climatica

  1. Dotare la stanza climatica (Figura 3) di 8 lampade a LED che forniscono un'illuminazione omogenea di 450 μmol m-2 s-1 con picchi spettrali a 440 (blu) e 660 (rosso) nm per una crescita ottimale delle piante.

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Figura 3: Camera climatica con rizocasse per l'esperimento di stress.
(A) Vista laterale dell'intera camera con illuminazione a LED, stazione meteorologica e PC (utilizzato qui per registrare gli igrometri fogliari); vista laterale con un primo piano della struttura metallica che sostiene le rizocasse con un'inclinazione di 45 ° e le lastre di legno utilizzate per schermare la finestra di vetro delle rizocasse dalla luce. (B) Esperimento di stress su barbabietola da zucchero che combina quattro fasi con stress indotti da diversa richiesta atmosferica (alta/bassa) e disponibilità di acqua nel suolo (alta/bassa). Le barre verdi della conduttanza media degli stomati forniscono un'indicazione della risposta delle piante allo stress. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

  1. Impostare i parametri ambientali in base alle esigenze della pianta o dell'esperimento. In questo caso, utilizzare un fotoperiodo di 14 ore di luce e 10 ore di buio. Durante l'acclimatamento delle piante e prima dell'inizio dei trattamenti di stress, impostare la temperatura a 20 °C durante il giorno e a 15 °C durante la notte, mantenendo l'umidità relativa al 50 ± 8%.
  2. Posizionare le rhizobox con un'inclinazione di 45° utilizzando un'apposita struttura metallica. Questo massimizza la crescita radicale verso la superficie di vetro grazie al gravitropismo.
  3. Coprire la finestra di vetro con una piastra di legno per mantenere la zona radicale al buio ed evitare la crescita di alghe causata dalla luce che penetra attraverso la superficie di vetro.

3. Configurazione e trattamenti dell'esempio con barbabietola da zucchero

  1. Far pre-germinare i semi di barbabietola su carta filtro umida per tre giorni a 20 °C in un incubatore, fino a quando emerge il radicolo. Questo garantisce la semina con piante vitali.
    NOTA: La pre-germinazione non è necessaria per piante con elevata vigoria di germinazione, evitando così il rischio di danneggiare il radicolo durante la semina. Per i semi di barbabietola con un pericarpo spesso, tuttavia, il rischio di semi non vitali è elevato e la pre-germinazione accelera significativamente l'emergenza del radicolo rispetto alla semina diretta nel suolo.
  2. Praticare un piccolo foro fino a una profondità di circa 1,5 cm al centro della rizocassetta con un cacciavite, posizionare un seme utilizzando pinzette con il radicolo orientato verso il basso e vicino alla finestra di vetro (questo migliora la visibilità iniziale) e ricoprirlo delicatamente con il suolo.
  3. Aggiungere uno strato di 0,5 cm di ghiaia fine (2-4 mm) sulla superficie del suolo per proteggere gli aggregati del suolo dal disfacimento durante l'irrigazione e ridurre le perdite per evaporazione. Per facilitare l'emergenza, mantenere la superficie del suolo priva di ghiaia nella zona in cui è stato posizionato il seme.
  4. Aggiungere 10 g di acqua per favorire l'attecchimento.
  5. Durante la fase di attecchimento e di crescita iniziale, fino all'inizio dei trattamenti sperimentali di stress, irrigare le rizocassette ogni 2-4 giorni per mantenere il contenuto iniziale di umidità del 80% PAW.
    1. Determinare la quantità di acqua di irrigazione necessaria pesando le rizocassette e aggiungendo acqua fino a raggiungere il peso iniziale di ciascuna cassetta. Per l'irrigazione manuale, utilizzare una pipetta per evitare il deterioramento della struttura superficiale durante l'annaffiatura.
  6. Sistemare le rizocassette secondo lo schema sperimentale stabilito all'interno della stanza climatica. Il protocollo qui riportato si basa su un esperimento con sei cultivar di barbabietola in cinque repliche, organizzato secondo un disegno completamente randomizzato (CRD).
    1. Riposizionare le rizocassette ogni volta che vengono estratte dal supporto metallico per la pesatura e l'irrigazione. Questo evita eventuali effetti derivanti da un'eventuale inomogeneità residua di luce all'interno della stanza climatica.
  7. Definire il momento di inizio dei trattamenti di stress e il tipo di stress. Vengono utilizzate le seguenti condizioni (Figura 4).
    1. Iniziare le misurazioni allo stadio BBCH 15 (cinque foglie completamente dispiegate), quando le radici coprono circa il 75% della profondità della rizocassetta e la chioma è sufficientemente sviluppata per consentire le misurazioni sulle foglie. Mantenere ciascuno stadio per almeno tre giorni per assicurare l'adattamento alle nuove condizioni ed effettuare le misurazioni.
    2. Per le osservazioni in assenza di stress, mantenere le condizioni iniziali con umidità ottimale del suolo (80% PAW) e condizioni ambientali (20 °C/15 °C di temperatura, 50 ± 8% di UR), ottenendo un deficit di pressione di vapore (VPD) diurno di 1,28 ± 0,1 kPa (cf. Figura 3 C).
    3. Aumentare la domanda atmosferica portando il VPD diurno a 2,45 ± 0,4 kPa, innalzando la temperatura a 27 °C/20 °C e riducendo l'UR al 35%, mantenendo l'umidità del suolo al 80% PAW.
    4. Successivamente, far asciugare le rizocassette fino al 40% PAW, corrispondente a un contenuto idrico di 0,215 cm3 cm-3, sospendendo l'irrigazione. Ripristinare le condizioni ambientali iniziali con bassa domanda atmosferica (VPD di 1,28 kPa).
    5. Combinare gli stress aumentando la domanda atmosferica a un VPD di 2,45 kPa e mantenendo l'umidità del suolo al 40% PAW.

4. Metodi di imaging radicale

  1. Combinare metodi di imaging sfruttando i rispettivi vantaggi in base alle informazioni desiderate.
    1. Applicare l'imaging RGB nell'intervallo del visibile (VIS) per monitorare nel tempo la crescita, l'architettura e la morfologia delle radici, il che richiede implicitamente misurazioni frequenti. I vantaggi dell'imaging RGB sono: (i) costi ridotti, (ii) acquisizione rapida delle immagini, (iii) ridotto spazio su disco richiesto (dimensione immagine: 48 MB) e (iv) alta risoluzione (3648 x 5472 pixel).
    2. Utilizzare l'imaging iperspettrale (HSI) nell'intervallo del vicino infrarosso (NIR) quando sono richieste caratteristiche chemiometriche di radice e suolo. I vantaggi sono: (i) caratteristiche spettrali per la segmentazione tra radice e fondo del suolo e (ii) accesso alle proprietà fisico-chimiche del sistema (ad esempio contenuto idrico del suolo, età della radice). Gli svantaggi sono: (i) tempo di scansione maggiore (circa 16 minuti per rizobox), (ii) dimensioni elevate dei dataset (13,7 GB per immagine di rizobox), (iii) risoluzione inferiore della telecamera NIR (320 x 256 pixel) e (iv) maggiore complessità nell'analisi dei dati.
  2. Imaging RGB delle radici
    1. Utilizzare una scatola di imaging (Figura 4) schermata dalla luce ambientale e che fissa la posizione della fotocamera, costituita da un telaio metallico largo 1 m e alto 1 m, con pareti laterali rivestite in pressopan. All'estremità frontale, fissare la fotocamera in due posizioni distanti 80 cm dal rizobox.
      1. Fissare un nastro metrico sul telaio del rizobox con nastro adesivo trasparente e posizionare il rizobox nel supporto della scatola di imaging.
      2. Illuminare il rizobox utilizzando quattro tubi fluorescenti da 24 W posizionati a 80 cm dal rizobox. Montare inoltre quattro tubi UV da 15 W a 20 cm dal rizobox come illuminazione alternativa, sfruttando l'autofluorescenza delle radici in caso di basso contrasto tra radice e fondo del substrato (di colore chiaro).
      3. Acquisire due immagini (posizione superiore e inferiore) per coprire la metà superiore e quella inferiore di un rizobox, con un'area di sovrapposizione di circa 3 cm.
    2. Acquisire immagini RGB con una fotocamera reflex digitale a obiettivo singolo, fissata mediante piastre a sgancio rapido sulle rispettive posizioni della scatola di imaging.
      1. Applicare le seguenti impostazioni quando si utilizzano i tubi fluorescenti. Adattare queste impostazioni di esempio a eventuali variazioni delle dimensioni, dell'illuminazione o del modello della fotocamera.
        1. Disattivare l'autofocus e lo stabilizzatore sull'obiettivo della fotocamera. Impostare la fotocamera in modalità manuale.
        2. Impostare la sensibilità ISO a 500. Impostare il tempo di posa a 13. Impostare il diaframma a 5,6.
        3. Disattivare il blocco dello specchio. Impostare il bilanciamento del bianco su Bilanciamento Automatico del Bianco.
      2. Utilizzare le seguenti impostazioni per l'illuminazione con tubi UV:
        1. Disattivare l'autofocus e lo stabilizzatore sull'obiettivo della fotocamera. Impostare la fotocamera in modalità manuale.
        2. Impostare la sensibilità ISO a 1000. Impostare il tempo di posa a 13. Impostare il diaframma a 5,6.
        3. Disattivare il blocco dello specchio. Impostare il bilanciamento del bianco su Fluorescenza.
    3. Unire le immagini RGB acquisite dalla parte superiore e inferiore del rizobox in un'unica immagine tramite un editor fotografico (ad esempio Adobe Photoshop). Utilizzare il nastro metrico sul telaio laterale dei rizobox e verificare gli elementi sovrapposti (radici e caratteristiche del suolo).
      1. Copiare le due immagini separate, ciascuna con dimensione di 3648 x 5472 pixel, in un nuovo file di dimensioni 3648 x 10944 pixel con sfondo bianco.
      2. Ridurre l'opacità del livello di un'immagine al 60% e allineare le parti sovrapposte delle immagini (nastro metrico, oggetti). Successivamente ripristinare l'opacità del livello al 100%.
      3. Sulla base del righello presente nell'immagine, aggiungere due linee rosse di esattamente 1 cm nella parte superiore dell'immagine, dove non sono presenti radici. Queste linee verranno successivamente utilizzate nell'analisi delle immagini per scalare correttamente le dimensioni lineari.
      4. Unire tutti i livelli e rimuovere le parti dell'immagine al di fuori della finestra contenente il suolo, utilizzando lo strumento di ritaglio.
      5. Salvare l'immagine come file tiff per ulteriori analisi.
      6. Nel caso di immagini acquisite con illuminazione UV, ridurre i colori a scala di grigi prima del salvataggio, utilizzando la barra degli strumenti Regolazioni-Nero & Bianco e selezionando il filtro predefinito Alto Contrasto Blu.
    4. Per la segmentazione tra radici e fondo del suolo e per la quantificazione dei tratti radicali di interesse (ad esempio lunghezza, superficie, diametro, ramificazione), utilizzare un qualsiasi software di analisi radicale (vedere www.plant-image-analysis.org per gli strumenti disponibili). In questo caso si utilizza WinRhizo.
      1. Aprire l'immagine tiff del rizobox nel software.
      2. Calibrare la scala delle lunghezze dell'immagine utilizzando le barre di calibrazione aggiunte all'immagine.
      3. Selezionare In base al colore nel menu Analisi, scegliendo Distinzione Radice & Fondo.
      4. Definire un file di calibrazione con classi cromatiche corrispondenti a radici e suolo (fondo). Per le immagini di esempio utilizzate qui (cf. Figura 8) vengono definite tre classi di colore per le radici (laterali vecchie, laterali giovani, radice principale) e tre classi di colore per il suolo.
      5. Per le immagini in scala di grigi (illuminazione UV), selezionare (i) In base ai livelli di grigio e (ii) Radice chiara su sfondo nero nel menu Distinzione Radice & Fondo e utilizzare una soglia di intensità locale Lagarde per la segmentazione.
      6. Aprire un file dati in cui salvare i risultati.
      7. Eseguire l'analisi e successivamente verificare la presenza di aree (ad esempio ai bordi) mal classificate. In tal caso, definire un'area di esclusione e riavviare l'analisi. Per radici non classificate, aggiungere ulteriori classi cromatiche e riavviare l'analisi. Per elementi erroneamente classificati come radici, attivare/aumentare le opzioni di filtro Detriti & Bordi Irregolari.

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Figura 4: Scatola per acquisire immagini RGB delle rhizobox.
Vista sinistra del lato frontale, dove le rhizobox sono fissate per l'acquisizione delle immagini con sorgenti luminose all'interno; vista destra del lato posteriore, dove è montata la fotocamera. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

  1. Imaging iperspettrale delle radici
    1. Configurazione hardware
      1. Utilizzare un sistema di imaging iperspettrale per radici (Figura 5) composto da (i) una telecamera NIR monocromatica raffreddata termoelettricamente a 14 bit, con un intervallo spettrale da 900 nm a 1700 nm, risoluzione di 320 per 256 pixel e frequenza di acquisizione di 100 Hz, e (ii) uno spettrografo di imaging con intervallo spettrale da 900 nm a 2500 nm e risoluzione spettrale di 3,6 nm. Disporre una sorgente di illuminazione a linea di alogenuri (quattro faretti alogeni da 50 W) in geometria 45°/-45°. Montare il sensore di imaging su un sistema di posizionamento a due assi. La finestra di scansione ha dimensioni di 240 x 1000 mm, ovvero 30 mm su ciascun lato della rizocassetta non sono coperti dall'immagine.
      2. Controllare il sistema tramite uno script Matlab per (i) l'acquisizione degli standard bianco e scuro, (ii) l'impostazione del tempo di integrazione della telecamera, (iii) la selezione della risoluzione spaziale (dimensione del pixel 0,1 mm; dimensione del pixel 1,0 mm) e spettrale (tutte e 222 le bande spettrali con risoluzione di 3,6 nm; spettro smussato con 54 bande e risoluzione di 14,8 nm), e (iv) la definizione dell'area di scansione sulla rizocassetta.
      3. Salvare le immagini come file SIF. Per evitare problemi durante il salvataggio di file di grandi dimensioni, suddividere ogni passo di scansione (9 passi per rizocassetta) in quattro segmenti (tre di lunghezza 300 mm, uno di lunghezza 100 mm) e salvarli separatamente con un nome univoco composto dal numero del passo (da 1 a 9) e dalla parte (da 1 a 4), oltre alla data e all'ora (AAAA.MM.GG HH:MM:SS). Un'intera scansione di rizocassetta richiede uno spazio su disco rigido di 13,7 GB.
    2. Acquisizione e analisi delle immagini.
      NOTA: Figura 6 mostra i passaggi di acquisizione, segmentazione e analisi delle immagini.
      1. L'acquisizione delle immagini comprende la selezione delle impostazioni della telecamera per una qualità ottimale dell'immagine e la definizione dei parametri di scansione.
        1. Determinare i tempi di integrazione della telecamera per la scansione della rizocassetta e per lo standard bianco tramite il software della telecamera.
          1. Aprire l'interfaccia grafica di imaging e spostare la telecamera in una posizione della rizocassetta in cui sono presenti radici.
          2. Regolare il tempo di integrazione della telecamera puntando un oggetto chiaro (ad esempio una radice) in modo che circa l'85% dell'intervallo dinamico completo della telecamera sia utilizzato sull'istogramma visualizzato dal software. Ripetere l'operazione per lo standard bianco spostando il sistema di posizionamento della telecamera in modo da puntare lo standard bianco. Chiudere quindi il software della telecamera.
        2. Aprire l'interfaccia grafica di imaging Matlab ed effettuare tutte le impostazioni per la scansione corrente della rizocassetta. Per i dati riportati qui, utilizzare le seguenti impostazioni:
          Tempo di integrazione standard bianco: 1000
          Tempo di integrazione rizocassetta: 4000
          Risoluzione spettrale: Risoluzione completa (ovvero 222 bande spettrali a intervallo stretto)
          Risoluzione spaziale completa (dimensione del pixel di 0,1 mm)
          1. Acquisire gli standard scuro e bianco prima di ogni sessione di imaging, ad esempio una volta al giorno. Lo standard scuro rappresenta il rumore della telecamera, mentre lo standard bianco fornisce la massima riflettanza. Questi dati sono necessari per la normalizzazione delle immagini durante la pre-elaborazione.
          2. Definire se viene scansionata l'intera rizocassetta o solo una sua parte. Nel caso attuale, vengono acquisite immagini di rizocassette complete. Avviare quindi la scansione.
      2. Elaborare l'immagine con uno script Matlab. Di seguito sono descritte le operazioni eseguite dallo script.
        NOTA: Gli script sono attualmente in una versione non documentata e possono essere ottenuti dall'autore corrispondente. Dopo una documentazione adeguata, saranno disponibili per il download dal sito web dell'istituzione dell'autore corrispondente (www.dnw.boku.ac.at/pb/).
        1. Comporre un intero passo di immagine dal centro della rizocassetta (contenente radici) unendo le quattro parti del passo.
          NOTA: A questo stadio non è né necessario né consigliabile utilizzare un'immagine spettrale di un'intera rizocassetta (ovvero tutti e 9 i passi), poiché le dimensioni del file renderebbero ogni passaggio di calcolo in Matlab molto lento, e le informazioni contenute in un singolo passo centrale sono sufficienti per i primi passaggi di analisi delle immagini.
        2. Normalizzare l'immagine utilizzando gli standard scuro e bianco acquisiti e tenendo conto dei diversi tempi di integrazione degli standard bianco e della rizocassetta, che vengono salvati automaticamente durante la scansione in un file.
        3. Facoltativamente, applicare un filtro di smoothing per rimuovere il rumore dall'immagine. Attualmente lo script offre un filtro mediano con kernel 3x3 e una correzione multipla della diffusione. Per la valutazione delle immagini presentata qui, non viene applicato alcun filtro.
        4. Visualizzare l'immagine in tutte le bande spettrali registrate per ottenere una prima visione d'insieme e decidere la lunghezza d'onda da utilizzare per selezionare le regioni di interesse (cf. segmentazione delle immagini).
      3. Eseguire la segmentazione tra radici e sfondo del suolo in uno script separato seguendo i passaggi seguenti.
        1. Selezionare le regioni di interesse (ROI) per radici e suolo per individuare le caratteristiche spettrali utili alla segmentazione. Utilizzare lo strumento di selezione libera per delimitare una ROI sull'immagine visualizzata a una lunghezza d'onda precedentemente identificata come quella con buon contrasto tra radici e suolo. In questo caso, utilizzare tre ROI sulle radici (laterali vecchie e giovani, radice principale) e due ROI nel suolo (zona secca e zona umida).
        2. Visualizzare un rettangolo con le ROI selezionate e la parte restante come maschera nera e mostrare l'immagine delle ROI selezionate a tutte le lunghezze d'onda.
        3. Eliminare tutte le righe nella matrice dell'immagine contenenti pixel con intensità spettrale = 0 (pixel neri).
        4. Unire le ROI di radice e suolo in una singola matrice di primo piano (radice) e una singola matrice di sfondo (suolo) per la segmentazione.
        5. Cercare le bande spettrali (intensità di singoli spettri o rapporti spettrali) che forniscono la migliore separazione tra primo piano (radice) e sfondo (suolo)27. Quantificare la distinzione tra gli istogrammi dei pixel risultanti per radice e suolo utilizzando la distanza di Bhattacharyya28.
        6. Selezionare un valore di intensità soglia che separi gli istogrammi.
        7. Creare un'immagine binaria applicando la soglia selezionata all'immagine originale. Questo imposta a zero tutti i pixel con intensità inferiore alla soglia e a uno quelli con intensità superiore (operazione eseguita automaticamente dallo script).
        8. Salvare l'immagine binaria come file tiff.
      4. Aprire l'immagine binaria e analizzare le caratteristiche delle radici. Selezionare (i) In base ai livelli di grigio e (ii) Radice chiara su sfondo nero nel menu Distinzione Radice & Sfondo e utilizzare la soglia di intensità globale (l'immagine è già binarizzata).
      5. Per mappare il contenuto idrico dai dati iperspettrali, acquisire un set di dati di calibrazione e applicare un'equazione di calibrazione a un'immagine della rizocassetta.
        1. Suddividere una rizocassetta in compartimenti di 5 cm utilizzando fogli di polistirolo per riempirli con suolo (stesso substrato e densità apparente db utilizzati per l'esperimento) a diversi contenuti idrici (Figura 8).
        2. Calcolare le rispettive quantità di acqua da mescolare al suolo e riempire i compartimenti (stesso procedimento descritto nel punto 1.3. per l'intera rizocassetta).
        3. Scansionare la rizocassetta di calibrazione con le stesse impostazioni utilizzate per le rizocassette piantumate.
        4. Eseguire i seguenti passaggi utilizzando uno script.
          1. Unire le quattro parti di un passo dalla scatola di calibrazione dell'acqua in un unico passo e normalizzarlo con gli standard scuro e bianco.
          2. Selezionare delle aree rettangolari in ciascun compartimento con diverso contenuto idrico e salvarle in un array strutturato.
          3. Determinare la caratteristica spettrale che meglio separa i compartimenti con diverso contenuto idrico. Questo viene fatto con un algoritmo di ricerca del massimo globale delle differenze di intensità tra gli spettri medi di contenuti idrici adiacenti.
          4. Calcolare il valore medio di intensità spettrale per questa caratteristica in ciascun compartimento della rizocassetta di calibrazione.
          5. Adattare un'equazione di regressione attraverso il contenuto idrico misurato direttamente e il rispettivo quantificatore spettrale.
          6. Applicare l'equazione di regressione a ogni pixel non classificato come radice in un'immagine della rizocassetta, per la caratteristica spettrale (banda) determinata in precedenza che meglio si correla al contenuto idrico.

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Figura 5: Scanner iperspettrale per radici.
I componenti principali dello scanner sono indicati. L'immagine più piccola mostra la telecamera durante l'acquisizione di un immagine di una rhizobox. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 6: Fasi dell'imaging iperspettrale delle radici.
L'imaging iperspettrale delle radici comprende tre fasi principali: (i) acquisizione delle immagini, (ii) segmentazione delle immagini e (iii) analisi dei dati spettrali. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 7: Rhizobox per la calibrazione dell'acqua.
Il rhizobox contiene compartimenti con substrato a diverso contenuto idrico, suddivisi da fogli di polistirene. La carta da germinazione nei compartimenti asciutti garantisce che le particelle di suolo non si spostino nei compartimenti adiacenti. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

5. Esempi di applicazione

NOTA: Le informazioni quantitative relative alle radici vengono applicate nel contesto della fenotipizzazione vegetale (confronto tra cultivar) e della ricerca fisiologica vegetale. I seguenti dati sopra il livello del suolo sono riportati per illustrare questi casi.

  1. Area fogliare: Misurare l'area fogliare in modo non distruttivo in fasi selezionate durante l'esperimento, utilizzando la lunghezza e la larghezza delle foglie come parametro indicativo. In alternativa, possono essere utilizzate immagini della chioma29.
    1. Al termine dell'esperimento, misurare la lunghezza e la larghezza delle foglie insieme all'area delle foglie campionate, utilizzando un misuratore di area fogliare. Calibrare il metodo non distruttivo applicando un'equazione di regressione alle coppie di dati.
  2. Materia secca: Al termine dell'esperimento, misurare la materia secca aerea tagliando le piante con forbici e asciugandole per 24 ore a 105 °C in una stufa.
  3. Conduttanza stomatica: Misurare la conduttanza stomatica con un porometro fogliare. Prima della misurazione, mantenere lo strumento per almeno un'ora nella camera climatica per permettere ai sensori di equilibrarsi con le condizioni ambientali e calibrare lo strumento ogni volta che le condizioni ambientali nella camera climatica cambiano. Effettuare le misurazioni su almeno tre foglie per pianta.

Risultati

Vengono presentati risultati di esempio per la segmentazione delle radici basata su immagini RGB e HS. Per l'immagine spettrale, viene fornito un esempio di mappatura ad alta risoluzione dell'acqua. Infine, vengono mostrati risultati che dimostrano il contesto scientifico in cui i dati delle radici basati su immagini vengono applicati.

Misurazione della radice basata su RGB

Figura 8 mostra una serie temporale di immagini RGB delle radici della coltivar di barbabietola da zucchero Ferrara. Le immagini rivelano alcuni artefatti derivanti da un'illuminazione non omogenea delle rizocasse, con aree più luminose lungo il lato sinistro e diverse intensità luminose nella zona di sovrapposizione tra le immagini superiori e inferiori.

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Figura 8: Serie temporale della crescita delle radici ottenuta dall'imaging RGB.
Le immagini mostrano la coltivar di barbabietola da zucchero Ferrara in diversi giorni dopo la semina (DAS). Le immagini evidenziano alcuni artefatti dovuti a un'illuminazione non omogenea sul lato sinistro dell'immagine e tra le immagini superiori e inferiori. Le barre della scala corrispondono a 2 cm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 9 mostra i dettagli sulla segmentazione delle radici basata sulla soglia di colore per la varietà Ferrara al giorno dopo la semina (DAS) 35. Come riferimento (Figura 9A), viene utilizzata un'immagine binaria in cui tutte le radici sono state tracciate manualmente mediante una tavoletta grafica. Il tempo necessario per il tracciamento manuale dell'intero sistema radicale, completamente sviluppato e fitto, della barbabietola da zucchero è stato di circa quattro ore. Figura 9B fornisce un'immagine dettagliata di un'area selezionata nella parte superiore dell'immagine, dove sono presenti radici laterali vecchie. In questo caso, diversi assi radicali non vengono classificati sulla base della soglia di colore. Al contrario, nella parte inferiore (Figura 9C), dove predominano le radici giovani di colore bianco, la segmentazione basata sul colore classifica correttamente tutti gli assi radicali. Il sistema radicale binarizzato (Figura 9D) mostra un'area nera sul lato sinistro, dovuta a un artefatto di illuminazione, che è stata definita come regione di esclusione prima dell'analisi quantitativa. Figura 9E mostra gli istogrammi dei pixel corrispondenti alle caratteristiche selezionate (radici vs. suolo) per il canale rosso dell'immagine RGB di Ferrara al DAS 35. I pixel delle radici (colore blu) mostrano chiaramente tre picchi corrispondenti alle laterali giovani luminose, alle laterali vecchie scure e alla radice principale. L'overlap tra le laterali vecchie e lo sfondo del suolo è molto intenso, causando assi radicali non classificati (cf. Figura 9B).

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Figura 9: Segmentazione delle radici mediante soglia cromatica.
(A) Sistema radicale segmentato manualmente utilizzando una tavoletta grafica, (B) area con assi radicali vecchi mal segmentati nella parte superiore e (C) assi giovani correttamente segmentati nella parte inferiore dell'immagine, e (D) immagine binaria ottenuta mediante sogliatura basata sul colore. (E) Istogrammi dei pixel per le caratteristiche selezionate dell'immagine RGB. Le radici sono rappresentate dalle barre blu con indicazione dei diversi tipi radicali; il suolo è rappresentato dalle barre rosse. Le barre della scala in A e D, 2 cm; le barre della scala in B e C, 1 cm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

La lunghezza totale delle radici visibili risultante quantificata per l'immagine di riferimento segmentata manualmente è di 1534,1 cm, mentre la segmentazione automatizzata basata sul colore fornisce una lunghezza totale delle radici di 1427,6 cm.

Le immagini in scala di grigi ottenute con illuminazione UV non offrono vantaggi nel caso qui mostrato, risultando peggiori rispetto alla sogliatura del colore (lunghezza delle radici: 1679,7 cm). Le radici vecchie non sono state segmentate correttamente e nell'immagine era presente un rumore maggiore, probabilmente dovuto all'intensità luminosa inferiore delle lampade UV. Tuttavia, nel caso di radici giovani con elevata autofluorescenza e un substrato di fondo chiaro, l'illuminazione UV può comunque rappresentare un'opzione, come mostrato da un'immagine ottenuta da un altro esperimento in cui la sabbia è stata utilizzata come substrato di fondo (Figura 10).

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Figura 10: Illuminazione UV per visualizzare le radici su sfondo chiaro.
Esempio di un sistema radicale di grano duro in crescita in una rhizobox riempita con sabbia di quarzo. La rhizobox è stata immaginata utilizzando un'illuminazione a (A) luce UV e (B) luce fluorescente (giorno). Barre della scala, 2 cm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Misurazioni della radice basate sull'HSI

Figura 11 mostra gli spettri medi per tre aree di interesse (ROI) delle radici (laterali vecchie e giovani, radice principale) e due ROI del suolo (parte superiore e inferiore della rizocassetta).

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Figura 11: Spettri medi di radice e suolo.
Spettri provenienti da regioni di interesse (ROI) sulla radice (tre tipi di radice) e nel suolo (parte superiore e inferiore del rizobox). Le ROI vengono selezionate per determinare un criterio ottimale di segmentazione tra radice e suolo. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

È evidente che le radici principali e le radici laterali giovani differiscono sostanzialmente dal fondo per l'intensità della maggior parte delle bande spettrali. Per le radici laterali vecchie, le differenze di intensità sono molto più basse. Una caratteristica che può essere rilevata visivamente è la diversa pendenza dello spettro nella regione di assorbimento dell'acqua (1450 nm). In questo caso, la pendenza degli spettri delle radici è maggiore rispetto a quella degli spettri del suolo. Inoltre, si può osservare un cambiamento negli spettri della radice principale e delle radici laterali giovani nella regione intorno a 1100 nm, che non si verifica nelle radici laterali vecchie.

Figura 12A mostra il risultato dell'algoritmo di ricerca che identifica un rapporto spettrale con il massimo contrasto tra primo piano e sfondo. Il rapporto tra gli spettri a 1476 nm e 1076 nm fornisce la migliore separazione tra radici e suolo. L'istogramma risultante dei pixel relativi al primo piano (radici) e allo sfondo (suolo) è mostrato in Figura 12B. Sebbene vi sia un certo sovrapposizione, la maggior parte dei pixel è chiaramente distinta dallo sfondo del suolo. Adattando una curva gaussiana bimodale all'istogramma e utilizzando la distanza di Bhattacharyya per la quantificazione, si ottiene un valore di 7,80. Un valore superiore a 3,0 indica un forte contrasto dell'immagine, che permette una separazione affidabile28.

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Figura 12: Differenza di riflettanza tra primo piano radicale e sfondo del suolo per diversi rapporti spettrali e istogramma dei pixel al rapporto spettrale utilizzato per la segmentazione.
(A) Colori chiari (giallo) indicano un alto contrasto tra primo piano e sfondo, colori scuri (blu) indicano un basso contrasto. I primi 15 canali sono stati rimossi a causa del rumore. Le linee rosse indicano il rapporto spettrale con il contrasto più elevato. (B) Istogramma dei pixel delle radici (blu) e del suolo (rosso) al rapporto spettrale di segmentazione. Le barre blu rappresentano le radici e le barre rosse il suolo. Il valore di intensità corrisponde al rapporto tra il canale spettrale 160 e il canale spettrale 49. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

L'immagine binaria (Figura 13) viene creata applicando una soglia di intensità globale al rapporto spettrale identificato, con un valore di 1,008 calcolato dalla distanza dell'istogramma27. L'analisi della lunghezza delle radici di questa immagine fornisce una lunghezza totale di 1557,3 cm, che corrisponde a un errore del solo 1,5% rispetto all'immagine di riferimento tracciata manualmente.

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Figura 13: Immagine binaria del sistema radicale della cultivar di barbabietola da zucchero Ferrara.
L'immagine è ottenuta applicando una soglia spettrale globale. Barra della scala (angolo in basso a sinistra), 2 cm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Sebbene la segmentazione delle radici sia migliorata grazie alle informazioni spettrali rispetto a quelle basate sul colore, l'obiettivo principale dell'imaging iperspettrale è l'analisi delle proprietà chimio metriche delle immagini. Questo viene illustrato tramite la mappatura del contenuto di acqua di un'immagine di una rhizobox.

Figura 14A mostra gli spettri medi delle compartimentazioni nella rizocassetta di calibrazione (cf. Figura 7) riempita con suolo a diverso contenuto idrico. La forma degli spettri è simile tra le diverse compartimentazioni, pertanto un rapporto spettrale non fornisce necessariamente un criterio di classificazione più stabile. Di conseguenza, l'intensità in una singola banda spettrale (1680 nm), in corrispondenza della quale la differenza media tra contenuti idrici adiacenti è massimizzata, viene identificata come il criterio migliore per la separazione. Gli istogrammi risultanti dei pixel per questa lunghezza d'onda spettrale sono mostrati in Figura 14B.

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Figura 14: Caratteristiche spettrali per la calibrazione del contenuto di acqua.
(A) Spettri medi di nove compartimenti di acqua dalla scatola radicale di calibrazione con diversi contenuti di acqua; (B) Istogrammi dei pixel per i compartimenti di acqua alla banda 216, dove la distanza media tra compartimenti adiacenti è massima. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

La relazione tra l'intensità media del pixel a 1680 nm e il contenuto di acqua misurato è mostrata nella Figura 15.

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Figura 15: Relazione tra riflettanza spettrale e contenuto volumetrico di acqua.
La figura mostra coppie di dati relative al contenuto di acqua misurato e alla riflettanza spettrale, con curve empiriche (lineari ed esponenziali) adattate ai dati escludendo i contenuti di acqua più elevati (triangoli rossi). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

La differenziazione di contenuti idrici più elevati a partire dall'intensità spettrale diventa difficile. Si può adattare una regressione significativa (lineare o esponenziale) con un alto valore di R2 ai contenuti idrici fino a circa 0,30 cm3 cm-3. Le condizioni di suolo più umido non possono essere previste in modo affidabile a partire dal valore di intensità. Un comportamento simile, con una relazione esponenziale tra riflettività e contenuto idrico e una risposta decrescente per contenuti idrici superiori a 0,30 cm3 cm-3, è stato riscontrato anche in altri studi30.

Un'immagine di una rizocassa con una mappatura dettagliata del contenuto idrico è mostrata in Figura 16. Vanno evidenziati quattro aspetti. Primo, si può osservare una regione con contenuto idrico inferiore nelle parti della rizocassa con radici. Secondo, il maggiore esaurimento è concentrato nelle vicinanze di assi radicali singoli. Terzo, si verificano zone di deplezione anche dove non sono visibili assi radicali sulla superficie, indicando regioni in cui le radici sono nascoste nel suolo. Quarto, la mappatura dell'acqua senza ulteriore elaborazione dell'immagine produce un aspetto irregolare a causa dell'aggregazione del suolo. Ciò può indicare una distribuzione non omogenea del contenuto idrico alla scala dell'aggregato, ma anche effetti della morfologia superficiale sulla qualità dell'immagine. Tecniche chemiometriche di elaborazione delle immagini rappresentano un'opzione per superare tali effetti morfologici nelle immagini spettrali31, ma non sono ancora state implementate negli script Matlab utilizzati in questo caso.

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Figura 16: Mappatura del contenuto idrico in una rhizobox.
Le tonalità blu scuro rappresentano aree con elevato contenuto idrico, mentre le zone verdi fino al rosso indicano regioni con basso contenuto idrico. La radice della pianta è sovrapposta all'immagine in nero. Scala grafica (angolo in basso a sinistra), 2 cm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Esempi di applicazione

Figura 17 mette in relazione tratti radicali quantitativi ottenuti dall'analisi delle immagini con misurazioni della parte aerea.

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Figura 17: Esempi tipici di applicazione per i dati radicolari.
(A) e (B) mostrano informazioni sulle radici utilizzate per la caratterizzazione della parte aerea e sotterranea della pianta in un contesto di fenotipizzazione. (A) rappresenta la crescita radicale della cultivar di barbabietola da zucchero Ferrara, (B) confronta sei cultivar di barbabietola da zucchero coltivate in rizobox utilizzando il rapporto tra area fogliare e area radicale (dati provenienti da un replicato). (C) e (D) mostrano relazioni funzionali tra caratteri come quelle riscontrate nella ricerca fisiologica vegetale. (C) illustra l'influenza del rapporto tra area fogliare e area radicale sulla produzione di materia secca e (D) la relazione tra superficie radicale e conduttanza stomatica. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 17A e 17B sono pertinenti per la fenotipizzazione, con un focus sulla caratterizzazione completa della parte aerea e della parte sotterranea della pianta. Figura 17A mostra l'accrescimento radicale del cultivar di barbabietola da zucchero Ferrara (cf. Figura 8 per le immagini). L'espansione dell'apparato radicale indica la capacità di un cultivar di esplorare il volume del suolo in un determinato arco temporale del periodo vegetativo. Figura 17B mostra il rapporto tra superficie fogliare e superficie radicale di sei cultivar di barbabietola da zucchero, fornendo un indice dell'equilibrio tra fornitura (radice) e domanda (foglia).

Figure 17C e 17D mostrano esempi di relazioni funzionali di interesse nella ricerca fisiologica. In Figura 17C il rapporto tra superficie fogliare e radicale è correlato alla massa secca formata durante l'esperimento, indicando il ruolo predominante della superficie assimilante come fattore limitante per l'accumulo di massa secca. La mancanza di significatività, nonostante un valore di R2 relativamente alto, è legata al ridotto numero di dati accoppiati (n=6) utilizzati in questo caso. Figura 17D rivela che i cultivar con una maggiore superficie radicale (assorbimento migliorato) presentano una conduttanza stomatica media più elevata nel corso dell'esperimento. L'area radicale maggiore sostiene evidentemente l'estrazione d'acqua, prolungando così l'apertura degli stomati.

Discussione

I protocolli prevedono due approcci complementari terreno coltivato imaging system di root. Un passaggio fondamentale per ottenere risultati sperimentali affidabili si sta riempiendo di rizobox che deve garantire un livello di substrato uniforme ed omogeneo nel vetro anteriore per offrire suolo-radice stretto contatto nella finestra di osservazione ed evitare vuoti d'aria. Questo è il motivo principale per utilizzare terra comparativamente fine setacciata di < 2 mm: più grandi aggregati provocare la morfologia superficiale superiore alla finestra di osservazione con i vuoti tra gli aggregati. Oltre ad un elevato rischio di disidratazione di punta di radice, questo richiede anche più complesse tecniche di elaborazione di immagini per acqua mappatura31.

Modifiche del protocollo, pertanto concentrano sul migliore e rapido riempimento di rizobox. Attualmente il tempo di riempimento è circa 30 minuti per scatola. Inoltre l'uso di rizobox con due finestre di vetro per l'imaging da entrambi i lati e modifiche per ottimizzare l'omogeneità di illuminazione per ottenere immagini migliori RGB vengono testati. Ulteriore estensione hardware anche considerare l'integrazione di planare optodi32 , nonché capacità di imaging33 nel sistema rhizobox. Si tratta tuttavia oltre le attività di aggiornamento corrente.

Modifiche del software di concentrano sulla registrazione automatica dell'immagine per fondere la parte superiore e inferiore RBG immagini34. Hyperspectral imaging avanzate funzione senza supervisione di estrazione si avvicina per28 , nonché metodi di rilevazione più sensibile obiettivo sorvegliato come SVMs35 sono testati. Quindi i dati iperspettrali potenzialmente consentono per la valutazione di più terreno, rizosfera e radice di proprietà36. Inoltre si intende sviluppare un (semi) automatizzato software per rhizobox radice immagini basato su una versione modificata di radice sistema analizzatore37 quantificare morfologiche (lunghezza, diametro, superficie) e tratti architettonici (frequenza ramificazione, ramificazione angoli).

La principale limitazione del protocollo rispetto ad approcci di imaging 3D è la restrizione per la superficie visibile radice e la proprietà di rizosfera. Tuttavia è stato dimostrato che i tratti visibili radice sono un proxy affidabile per l' intero sistema della radice21. La tecnica di rhizobox è facilmente combinato con campionamento distruttivo tradizionale (lavatrice) alla fine di una crescita dinamica imaging al fine di convalidare la relazione di visibile vs totale radice sistema tratti. Come questa relazione potrebbe variare tra specie21, campionamento distruttivo è consigliabile per garantire affidabile inferenza dai tratti visibili per qualsiasi nuova serie fenotipizzazione con una specie di colture diverse.

Il vantaggio fondamentale del protocollo presentato qui è la combinazione di condizioni di crescita realistiche (suolo), potenziale relativamente alto throughput per la temporaneamente risolto dell'imaging RGB e inferenza sulla funzionalità di radice (ad esempio l'assorbimento di acqua) tramite i dati di radice e rizosfera chemiometrica da imaging iperspettrale. Quindi i metodi supera le restrizioni di inferenza in semenzale elevato throughput e fuori suolo radice imaging metodi14, mentre permette parzialmente intuizioni profonde che phenotyping processi funzionali con complessità meno sperimentale e un throughput più elevato rispetto ai metodi avanzati 3D15.

Nei prossimi esperimenti utilizzerà il protocollo per studiare l'effetto di Micorriza sullo sviluppo del sistema della radice e funzionalità dei legumi anche per quanto riguarda le caratteristiche di radice fenotipizzazione di coltura di copertura specie in relazione alla struttura del suolo, di azoto e di carbonio in bicicletta.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori riconoscono finanziamenti dal fondo austriaco scienza FWF tramite il progetto numero P 25190-B16 (le radici della resistenza alla siccità). Istituzione dell'infrastruttura imaging iperspettrale è stato sostenuto finanziariamente dal federale governo della Bassa Austria (Land Niederösterreich) tramite il progetto K3-F-282/001-2012. Finanziamenti supplementari per l'esperimento di barbabietola da zucchero è stato ricevuto dalla ricerca AGRANA & Innovation Center GmbH (ARIC). Gli autori ringraziano Craig Jackson per il supporto tecnico durante l'esperimento e inglese correzione del manoscritto. Riconosciamo anche Markus Freudhofmaier che hanno contribuito alla istituzione l'installazione di immagini RGB e Josef Schodl per la costruzione del supporto del rhizobox.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
RhizoboxTechnisches Bü ro fü r BodenkulturCostruttore
Lampade LED ATUM HORTI 600KlutronicAHI10600F
Tubo luminoso fluorescente HiLite T5 DayJuwel Aquarium86324
Tubo luminoso UV Eurolite 45cm slim 15 WConrad593384 - 62
Canon EOS 6DCanon Austria GmbH8035B024
Adobe Photoshop CS5 Extended Version 12.0 x 32Adobe Systems Software Ireland Ltd.
WinRhizo Pro v. 2013Regent Instruments Inc.
Xeva-1.7-320 Telecamera SWIRXenicsXEN-000105
Spettrografo Imspector N25ESpecim
Scanner di imaging iperspettraleCarinthian Tech Research AGCostruttore sperimentaleProgettazione e assemblaggio di scanner e software di imaging iperspettrale
Matlab R2106aMathworksComprese le cassette degli attrezzi per l'elaborazione delle immagini, l'elaborazione dei segnali, le statistiche e l'apprendimento automatico
AP4 PoromoeterDelta-T-Devices
LI-3100C Misuratore di areaLI-COR
BASF Fogli di polistirene StyradurObi Baumarkt9706318È possibile utilizzare diversi tipi di fogli di polistirene o altro materiale che separano il terreno con umidità diversa
sperimentale

Riferimenti

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