In Vivo Test per la determinazione della funzione citolitica di cellule T antigene-specifiche utilizzando un modello di vaccinazione

Protocolli multipli esistono per valutare il potenziale citolitica (CTL) di un CD8⁺ o CD4⁺ T-cellula. Questa valutazione può essere facilmente fatto in vitro sotto condizioni controllate^1,2,3. Inoltre, modelli di malattia infettiva, come LCMV, classicamente hanno esaminato la funzione CTL attraverso l'uso di differenzialmente CFSE (5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) etichettati cellule bersaglio dove il CFSE^Ciao-sono cellule con etichettate ha pulsato con un peptide e CFSE^lo-pulsati cellule rimangono contrassegnati dell'obiettivo. Le cellule sono poi iniettate con un rapporto 1:1 e valutate per la perdita della CFSE^Ciao-etichettato pulsati obiettivi di flusso cytometry⁴. Modelli di vaccino e rifiuto hanno utilizzato anche strategie simili per valutazione di in vivo uccidendo entrambi CD8⁺ e CD4⁺ T cellule così come cellule NK^5,6. Questo è un potente, ma richiede l'uso di agenti infettivi che innescano il sistema immunitario prima dell'iniezione di destinazione.

Questo protocollo, d'altra parte, non richiede nessuna infezione priore dell'host e invece utilizza una strategia di vaccinazione per primo il sistema immunitario prima dell'iniezione di destinazione. Questa vaccinazione è composto da una formulazione a base di acqua di vaccino del peptide che richiede la fornitura di un immunostimolante cocktail chiamato covax⁷, costituito da un recettore Toll-like 7 (TLR7) agonista (imiquimod crema), un anti-CD40 agonistico l'anticorpo e l'interleuchina 2 (il-2) che conduce alla combinazione sinergica di immunostimulatory agenti per l'ottenimento dei peptidi specifici adescamento e risposta immunitaria robusta. Come tale, questo test fornisce una rapida lettura della funzione CTL come il vaccino è somministrato insieme con le cellule per la valutazione della funzione solo tre giorni prima dell'iniezione delle cellule bersaglio. Inoltre, l'innesco di covax è abbastanza forte che si può vedere la capacità di uccisione della cellula T antigene-specifiche innescata tra 4 e 24 h dopo l'iniezione.

La limitazione principale di questo protocollo è l'identificazione della timeline in vivo per la rilevazione dell'uccisione di destinazione che è opportuno sia l'antigene e l'ipotesi da testare. Attenta valutazione deve essere effettuata, come variazioni nella forza di antigene così come le alterazioni genetiche in cellule di T in fase di test potrebbe causare funzione differenziale di CTL che richiederebbe un rilevamento di tempi diversi di uccisione di destinazione. Inoltre, mentre la concentrazione appropriata del peptide per la vaccinazione è stata ottimizzata per melanoma umano antigene glicopeptide 100 (hgp100_25-33) e ovoalbumina_257-264 (OVA_257-264)^8,9 _, uso di un altro modello di antigene che può essere più appropriato per un dato studio richiederebbe ulteriore convalida. A causa delle differenze attese nella capacità degli antigeni di un obiettivo di stimolare la CTL effettrici funzione in combinazione con il covax come adiuvante, ottimizzazione della frequenza di concentrazione e dose dose IL-2 può essere essenziale per raggiungere l'obiettivo desiderato. Nel complesso, questo protocollo permette una rapida valutazione di uccidere funzione in vivo e può essere adattato a qualsiasi antigene specifico.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della University of Texas MD Anderson Cancer Center.

1. preparazione del Peptide per il vaccino

1. Sciogliere il peptide liofilizzato con tampone fosfato salino (PBS) alla concentrazione appropriata e vortexare per 30 s.
   Nota: Per hgp100_25–33, la concentrazione finale è 1 mg/mL e per OVA_257–264, la concentrazione finale è di 0,5 mg/mL. Ricostituire il peptide prima dell'iniezione. Non conservare dopo la ricostituzione.

2. isolamento di Splenocytes dai topi transgenici

Nota: Isolamento delle cellule dalla milza deve essere eseguita in modo sterile.

1. Eutanasia il topo transgenico di OT-1 utilizzando il metodo approvato di CO₂ asfissia e rimuovere la milza.
   Nota: Mouse transgenico appropriato viene utilizzato in questo passaggio specifico per il peptide di scelta.
   1. Posare il mouse sul suo lato destro. Spruzzare il lato sinistro del mouse con 70% di etanolo (EtOH). Tirare la pelle usando il forcipe e tagliare la pelle utilizzando forbici chirurgiche; la milza sarà visibile all'interno della cavità peritoneale. Squartato delicatamente la cavità peritoneale per accedere la milza. Rimuovere la milza usando il forcipe.
2. Disaggregare la milza inserendola in un filtro di 70 µm in una capsula di Petri con medium 2 mL A (PBS con 1% siero bovino fetale (FBS)) e fracassare la milza con l'estremità di un pistone.
   1. Raccogliere gli splenocytes dalla capsula di Petri e posto in una provetta conica da 50 mL. Lavare la capsula di Petri con 5 mL di terreno A due volte per raccogliere tutte le celle. Aggiungere il terreno A fino a 25 mL e centrifugare le cellule per 5 min a temperatura ambiente a 475 x g.
3. Aspirare le cellule e risospendere in 1ml / al buffer di lisi di globuli rossi (RBC) della milza. Incubare a temperatura ambiente per 5 min, aggiungere 10 mL di medium A e centrifuga a temperatura ambiente a 475 x g. Risospendere il pellet in 10 mL di medium A e rimuovere detriti filtrando la sospensione cellulare attraverso un filtro di 70 µm in un pulito 50 mL conico.
4. Contare le celle utilizzando trypan blu e un emocitometro. Risospendere le cellule in PBS a una concentrazione finale di 10⁶ - 100⁶ cellule/mL. Per gli ovuli_257–264 specifiche uccidendo, risospendere a 10⁶ cellule/mL e per hgp100_25–33 specifico uccidendo, risospendere a 100⁶ cellule/mL.
   1. Giro le celle rimanenti a temperatura ambiente per 5 min a 475 x g. aspirare il supernatante e risospendere in 15 mL di PBS freddo per lavare le cellule. Ripetere il passaggio di lavaggio una volta di più. Spin, le celle a temperatura ambiente per 5 min a 475 x g. aspirare il supernatante e risospendere in PBS freddo secondo il volume finale determinato al punto 2.4.
   2. Trasferire la sospensione unicellulare a un tubo per microcentrifuga da 1,5 mL e tenere il ghiaccio fino a iniezione nel destinatario del topo C57/BL6.

3. iniezione di Splenocytes dai topi transgenici

1. Mouse di C57/BL6 destinatario posto in un dispositivo di ritenuta, dal lato dorsale. Area base coda di spruzzo iniezione con alcool isopropilico al 70%. Somministrare per via endovenosa 100 µ l di sospensione unicellulare (sezione 2) nella vena caudale utilizzando un ago da 27 G con il lato smussato rivolto verso l'alto.

4. Covax amministrazione

Nota: Se le cellule vengono iniettate nel pomeriggio, covax deve essere somministrata la mattina seguente all'interno 18 h dell'iniezione di cellule.

1. Posizionare il mouse in una scatola chiara anestesia con isoflurano 1-3%. Dopo topi sono completamente anestetizzati, trasferire i topi per i coni di naso attaccati al collettore nella camera di anestesia. Tenere topi trattenuti con il lato dorsale fino.
   Nota: Amputate è confermata da un pizzico di breve punta per verificare che non è suscitata una risposta di ritiro. Legge federale limita isoflurano uso nell'ordine di un veterinario autorizzato.
2. Area base coda di spruzzo iniezione con alcool isopropilico al 70%. Iniettare per via sottocutanea 100 µ l di soluzione di peptide (dalla sezione 1) utilizzando un ago da 27 G con la siringa penetrando 4-5 mm della regione base della coda, il lato di smussatura dell'ago rivolto verso l'alto.
   Nota: I topi sono vaccinati in un fianco con iniezione sottocutanea alla base della coda¹⁰.
3. Iniettare 100 laterale di anticorpo (0,5 mg/mL di brodo) anti-CD40 µ l al sito di iniezione di vaccino.
4. Applicare attentamente la crema del imiquimod 50 mg/mouse sui siti di vaccinazione. Strofinare la crema del imiquimod sulla superficie fino a quando la crema non è più visibile e viene completamente assorbita.
5. Iniettare 100 µ l di proteina rhIL-2 100.000 IU/mL per via intraperitoneale (i.p.) alla regione addominale inferiore. Osservare, topi per 5 min dopo il loro recupero completamente dall'anestesia.
   Nota: Esperimento è in pausa a questo punto per 3 giorni.

5. isolamento degli Splenocytes Target per l'etichettatura con CFSE

Nota: Isolamento delle cellule dalla milza deve essere eseguita in modo sterile.

1. Eutanasia i topi C57BL/6 secondo metodo approvato di asfissia₂ CO. Rimuovere spleen(s) come descritto al punto 2.1.1. Disaggregare la milza e lavare gli splenocytes come nei passaggi 2.2.1 - 2.2.3. Lisare cellule di anima rosse come nei passaggi 2.3 - 2.3.2.
2. Rimuovere le cellule per il conteggio utilizzando un emocitometro e calcolare per una concentrazione finale di cellule a 10⁶ cellule/mL in soluzione CFSE-etichettatura (descritta nel passaggio 7). Spin rimanenti celle a temperatura per 5 min a 475 x aspirare il surnatante g..

6. peptide pulsare dei Target Splenocytes

Nota: Peptide pulsare deve essere eseguita in modo sterile.

1. Risospendere le cellule a 10⁶ cellule/mL in completa per i media (media di RPMI 1640 con 10% FBS, 1% L-Glutammina (L-Gln), 1% di penicillina/streptomicina (Pen/Strep)). Dividere le celle in 2 tubi (15ml coniche). Etichettare ogni provetta come pulsato o pulsati.
2. Aggiungere peptide nella provetta etichettata pulsata. Per gli ovuli_257–264 pulsare, aggiungere 1 µ g/mL e per hgp100_25–33 pulsare, aggiungere 2 µ g/mL.
   Nota: Le cellule pulsate subiscono la stessa incubazione delle cellule pulsata solo senza l'aggiunta del peptide.
   1. Incubare le cellule + peptide a 37 ° C per 1 h.
3. Aggiungere 10 mL di completa per i media (media di RPMI 1640 con 10% FBS, 1% L-Glutammina (L-Gln), 1% di penicillina/streptomicina (Pen/Strep)) in ogni provetta per lavare entrambi pulsata e pulsati cellule bersaglio. Spin rimanenti celle a temperatura per 5 min a 475 x aspirare il surnatante g..

7. preparazione di CFSE per etichettare gli Splenocytes Target

1. Preparare la soluzione di etichettatura CFSE durante la cella di lavaggio nel passaggio 6.3; le cellule pulsate saranno etichettate come CFSE^Ciao e i pulsati CFSE^lo. Preparare 1 mL di soluzione di CFSE-etichettatura per 10⁶ cellule.
   Nota: CFSE è sensibile alla luce e deve essere protetto dalla luce a tutte le ore.
   1. Preparare CFSE^Ciao -etichettatura media aggiungendo 1 uL/mL CFSE (soluzione 5 mM) per una concentrazione finale di 5 µM/mL in media RPMI 1640 con 2% FBS.
   2. Preparare CFSE^lo -etichettatura media aggiungendo 1 uL/mL CFSE (soluzione 0,5 mM) per una concentrazione finale di diluitore da 0,5 µM/mL RPMI 1640 con 2% FBS.

8. etichettatura degli Splenocytes Target con CFSE

Nota: CFSE etichettatura deve essere eseguita in modo sterile.

1. Risospendere le cellule bersaglio pulsata e pulsati (dal punto 6.3) presso CFSE-etichettatura media di 10⁶ cellule/mL. Risospendere le cellule pulsate con preparati CFSE^Ciao-etichettatura media e le cellule pulsate con preparati CFSE^lo-etichettatura media.
2. Cellule di mix e CFSE-etichettatura media da inversione leggera o vorticoso. Non mescolare nel Vortex. Incubare le cellule e CFSE-Etichettatura supporti a 37 ° C per 15 min. Remix le cellule ogni 5 min.
3. Aggiungere 10 mL di multimediale completo di ogni cellule tumorali sospensione e spin a temperatura ambiente per 5 min a 475 x g.
4. Aspirare il supernatante e risospendere le cellule in 10 mL di PBS freddo. Girare le cellule a 4 ° C per 5 min a 475 x g.
5. Ripetere il punto 8.4.
6. Contare le celle e mix peptide-pulsato, CFSE^Ciao-etichettati con pulsati, CFSE^lo-etichettati cellule con un rapporto di 1:1 per iniezione in topi destinatari. Mantenere un'aliquota di 1 x 10⁶ miscelati di cellule da utilizzare per una valutazione di cytometry di flusso basale (sezione 11).
   Nota: Il volume finale per iniezione è 100 µ l per topo. Il conteggio finale delle cellule è 10e6 cellule. Perdita di volume nella siringa e l'ago deve essere presa in considerazione e deve essere stimato a 500 µ l.

9. l'iniezione di cellule bersaglio

Nota: Tenere CFSE-labeled celle protette dalla luce prima e durante l'iniezione per quanto possibile.

1. Inserire destinatari topi C57BL/6 in un dispositivo di ritenuta con il dorso verso l'alto. Area base coda di spruzzo iniezione con alcool isopropilico al 70%. Somministrare per via endovenosa 100 µ l di sospensione unicellulare nella vena caudale con il lato smussato rivolto verso l'alto.

10. re-isolamento delle cellule bersaglio

Nota: I tempi di questo passaggio sono fondamentale e dipende la citotossicità CTL e la forza dell'antigene per la stimolazione. Per la valutazione di uccidere un bersaglio di OVA_257–264 pulsato, le cellule hanno bisogno di essere raccolto 4-6 h dopo l'iniezione. Poiché le cellule CFSE-labeled sono luce milze sensibili, processo al buio.

1. Eutanasia i destinatari topi C57BL/6 secondo il metodo approvato di CO₂ asfissia.
2. Rimuovere spleen(s) come descritto al punto 2.1.1. Disaggregare la milza e lavare gli splenocytes come nei passaggi 2.2.1 - 2.2.3. Lisare cellule di anima rosse come nei passaggi 2.3 - 2.3.2.
3. Risospendere le cellule in cellule attivate la fluorescenza 1ml ordinamento buffer (FACs) (1% BSA + PBS) per la valutazione tramite flusso cytometry.

11. gating logica per determinare l'attività di CTL tramite flusso Cytometry

1. Effettuare la valutazione dell'attività CTL utilizzando un protocollo di citometria a flusso standard. Acquisire le celle utilizzando il canale FITC su un citometro a flusso con un laser di 488 nm per eccitazione¹¹.
   1. Cancello sui linfociti dal vivo utilizzando i parametri di forward scatter (FSC) vs side scatter (SSC). Subgate all'interno il cancello dal vivo del linfocita per la popolazione totale di CFSE-positivi.
      Nota: Le cellule iniettate con etichetta CFSE comporranno un piccolo sottoinsieme dei linfociti totali presenti nella milza. Le celle CSFE-positivo dovrebbero apparire come due popolazioni distinte sulla scala logaritmica.
   2. Utilizzare un formato di istogramma per determinare la percentuale dei pulsati (sinistra, CFSE^lo) con pulsato (destra picco, CFSE^Ciao) popolazioni. Perdita di CFSE^Ciao cellule indica l'attività di CTL antigene-specifiche.

Prima dell'iniezione delle cellule bersaglio CFSE-etichetta, la miscela di 1:1 cella viene eseguita su un citometro a flusso per determinare le frequenze di base il CFSECiao sia CFSElo destinazione delle cellule. Figura 1 A Mostra la strategia di gating per rilevare i cambiamenti nelle popolazioni CFSE, un cancello iniziale viene effettuato utilizzando parametri FSC e SSC. Le cellule di CFSE-positive totale sono quindi subgated prima della valutazione dei cambiamenti nella frequenza, come questa popolazione è relativamente piccola rispetto agli splenocytes endogeno senza etichetta. La frequenza relativa di CFSECiao elo popolazioni CFSE è calcolata impostando la popolazione totale di CFSE-positivi al 100%. Questa analisi può essere fatto utilizzando un formato di trama di un istogramma o un punto. Figura 1Bè riportato un esempio della frequenza relativa delle popolazioni CFSE prima dell'iniezione. Questo rapporto sarà raramente esattamente 1:1 ma dovrebbe essere abbastanza vicino. La necessità di innesco della covax è illustrato nella Figura 1C dove nessun omicidio dell'antigene pulsato, cellule CFSECiao bersaglio è osservato alle 24 h post iniezione. Figura 1 D di seguito viene illustrato l'uccisione efficace dell'antigene pulsata, CFSECiao-etichettati cellule bersaglio come il picco che è stato osservato prima dell'iniezione è quasi inosservato e il rapporto è drammaticamente spostato da 50% a 1% di rilevazione. La figura mostra anche la cinetica dell'antigene pulsata, CFSECiao-etichettato di uccisione delle cellule bersaglio valutando la perdita di questa popolazione sia h 6 e 24 h post iniezione.

Figura 1: Confronto delle cellule con etichettate al basale e dopo l'iniezione delle cellule bersaglio CFSE-labeled. (A) la strategia di gating per la valutazione della funzione CTL è indicata. Brevemente, i linfociti dal vivo sono gated utilizzando parametri di forward scatter (FSC) vs side scatter (SSC). Totale celle CSFE-positivi sono subgated all'interno del cancello di cellule vive. Il rapporto di CFSECiao e CFSElo è basato sui loro rispettivo frequenza all'interno della popolazione totale di CFSE-positivi. (B) CFSE seguente etichettatura, cellule bersaglio sono misti 1:1 e valutate per il rapporto di CFSECiao e CFSElo cellule tramite flusso cytometry. I numeri indicano la frequenza delle rispettive cime su entrambi un istogramma (a sinistra) e formati di CFSE vs SSC dot plot (a destra). (C) questo dimostra la mancanza di cellule bersaglio uccidendo senza precedente vaccinazione con covax regime. Splenocytes sono stati raccolti 24 h dopo l'iniezione. (D) questo dimostra l'uccisione di antigene-pulsato CFSECiao cellule bersaglio a 6 h (grafici in alto viene) e 24 h (grafici in basso) dopo l'iniezione. I numeri indicano la frequenza delle cime CFSE-etichetta su un istogramma (a sinistra) e il formato CFSE vs SSC punto trama (a destra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.