L'obiettivo del presente protocollo è quello di consentire il rilevamento in vivo di uccisione di una cella di destinazione in un modello murino di antigene-specifiche.
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Articolo metodologico
In Vivo Test per la determinazione della funzione citolitica di cellule T antigene-specifiche utilizzando un modello di vaccinazione
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Metodologie attuali per l'uccisione di antigene-specifiche sono limitate per uso in vitro o utilizzati in modelli di malattie infettive. Tuttavia, c'è non un protocollo specificamente destinato a misurare antigene-specifiche uccisione senza un'infezione. Questo protocollo è stato progettato e descrive i metodi per superare queste limitazioni, consentendo per la rilevazione dell'antigene-specifiche uccidendo una cella obiettivo di CD8+ T cells in vivo. Ciò avviene mediante l'Unione di un modello di vaccinazione con un tradizionale CFSE-etichetta target uccidendo il dosaggio. Questa combinazione consente al ricercatore di valutare il potenziale CTL di antigene-specifiche direttamente e velocemente come il dosaggio non è dipendente della crescita del tumore o infezione. Inoltre, la lettura si basa sulla citometria a flusso e quindi dovrebbe essere facilmente accessibile alla maggior parte dei ricercatori. La limitazione principale dello studio consiste nell'identificare la timeline in vivo che è appropriato per l'ipotesi in fase di test. Variazioni nella forza di antigene e mutazioni nelle cellule T che possono derivare in funzione citolitica differenziale devono essere attentamente valutati per determinare il momento ottimale per la raccolta delle cellule e valutazione. La concentrazione appropriata del peptide per la vaccinazione è stata ottimizzata per hgp10025-33 e OVA257-264, ma occorrerebbero ulteriori convalida per altri peptidi che potrebbero essere più appropriati per un determinato studio. Nel complesso, questo protocollo permette una rapida valutazione di uccidere funzione in vivo e può essere adattato a qualsiasi antigene specifico.
Introduzione
Protocolli multipli esistono per valutare il potenziale citolitica (CTL) di un CD8+ o CD4+ T-cellula. Questa valutazione può essere facilmente fatto in vitro sotto condizioni controllate1,2,3. Inoltre, modelli di malattia infettiva, come LCMV, classicamente hanno esaminato la funzione CTL attraverso l'uso di differenzialmente CFSE (5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) etichettati cellule bersaglio dove il CFSECiao-sono cellule con etichettate ha pulsato con un peptide e CFSElo-pulsati cellule rimangono....
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Protocollo
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della University of Texas MD Anderson Cancer Center.
1. preparazione del Peptide per il vaccino
- Sciogliere il peptide liofilizzato con tampone fosfato salino (PBS) alla concentrazione appropriata e vortexare per 30 s.
Nota: Per hgp10025–33, la concentrazione finale è 1 mg/mL e per OVA257–264, la concentrazione finale è di 0,5 mg/mL. Ricostituire il peptide prima dell'iniezione. Non conservare dopo la ricostituzione.
2. isolamento....
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Risultati
Prima dell'iniezione delle cellule bersaglio CFSE-etichetta, la miscela di 1:1 cella viene eseguita su un citometro a flusso per determinare le frequenze di base il CFSECiao sia CFSElo destinazione delle cellule. Figura 1 A Mostra la strategia di gating per rilevare i cambiamenti nelle popolazioni CFSE, un cancello iniziale viene effettuato utilizzando parametri FSC e SSC. Le cellule di CFSE-positive totale sono quindi s.......
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Discussione
Mentre questo protocollo è molto semplice, ci sono pochi passaggi critici che devono essere eseguite con cautela. L'innesco di covax dopo l'iniezione della cellula-T antigene-specifiche in fase di test è necessario vedere qualsiasi uccisione degli obiettivi pulsati. Mentre è possibile che la vaccinazione di base acqua covax crea uno stato infiammatorio acuto, per la fase infiammatoria cronica, sostituendo la formulazione a base di acqua di breve durata con un approccio basato su olio di antigene lento rilascio può produr.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è supportato da ricerche di NIH (A1R03AI120027 (RN) e 1R21AI20012 (RN)), Grant di ricerca istituzionali (RN), Start-up concedere (RN) e seme di MD Anderson CIC concedere (RN).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Topi femmina C57BL/6 di età compresa tra 6 e 12 settimane | Charles River | 027 | C57 Nero 6 topi |
| OT-1 topi femmina di 6-12 settimane | Jackson Labs | 003831 | |
| hgp10025– 33 | CPCScientific | 834139 | KVPRNQDWL |
| OVA 257– 264 | CPCScientific | MISC-012 | SIINFEKL |
| Imiquimod crema 5% | Fougera | 51672-4145-6 | Aldara Cream |
| mAb specifico per CD40 | BioXcell | BE0016-2 | clone FGK4.5 |
| rhIL-2 proteina | Hoffman LaRoche Inc | 136 | Proteina IL-2 umana ricombinante |
| 70% alcol isopropilico Prepara | Kendall | S-17474 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | Soluzione salina tamponata con fosfato |
| FBS | Life Technologies | 26140-079 | del siero fetale bovino |
| Life Technologies | A10492-01 | tampone per lisi dei globuli rossi | |
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| L-Glutammina | Life Technologies | 25030081 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | penicillina/streptomicina |
| CFSE | Life Technologies | C34554 | 5-(e 6)-carbossifluoresceina diacetato succinimidil estere |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma | A4503 | |
| 1,5 mL MCT graduato naturale | Fisher | 05-408-129 | provetta per microcentrifuga |
| 70% etanolo | Fisher | BP8201500 | EtOH |
| soluzione blu di tripano, 0,4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Emocitometro | Fisher | 267110 | |
| ago calibro 27 | BD | 305109 | |
| siringa da 1 mL | BD | 309659 |
Riferimenti
- Liu, L., et al. Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates. Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).
- Wherry, E. J., et al. Lineage relationship and pro....
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Ristampe e permessi
