Questo protocollo descrive in dettaglio la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte privo di impronta (iPSCs) da cellule pancreatiche umane in condizioni prive di alimentatore, seguito da editing con CRISPR/Cas9 ribonucleoproteine e caratterizzazione del modificati cloni unicellulari.
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Articolo metodologico
Efficiente generazione e la modifica di IPSCs privo di alimentatore da cellule pancreatiche umane utilizzando il sistema di CRISPR-Cas9
In questo articolo
Sommario
Abstract
Cellule staminali pluripotenti embrionali e indotto può auto-rinnovarsi e differenziarsi in più tipi di cellule del corpo. Le cellule pluripotenti sono così ambite per la ricerca in medicina rigenerativa e sono attualmente nei test clinici per le malattie dell'occhio, diabete, malattie cardiache e altri disturbi. La capacità di differenziarsi in tipi cellulari specializzati accoppiati con i recenti progressi nel genoma tecnologie compreso il sistema CRISPR/Cas hanno fornito ulteriori opportunità per la sartoria il genoma di iPSC per svariate applicazioni compreso la malattia di modellazione, terapia genica e la differenziazione dei percorsi di differenziazione, per citarne alcuni. Tra le tecnologie di modifica disponibili, il CRISPR/Cas9 da Streptococcus pyogenes è emerso come uno strumento di scelta per l'editing site-specific del genoma eucariotico. Il CRISPRs sono facilmente accessibile, economico e altamente efficiente in ingegneria modifiche mirate. Il sistema richiede una nucleasi Cas9 e una sequenza di guida (20-mer) specifica per la destinazione genomica adiacente con un 3-nucleotide "NGG" protospacer-adiacente-motivo (PAM) per il targeting Cas9 al locus genomico desiderato, a fianco di un tracciante universale di associazione Cas9 (RNA insieme chiamato RNA guida singola o sgRNA). Qui vi presentiamo un passo-passo il protocollo per generazione efficiente di iPSC alimentatore indipendente e privo di impronta e descrivere metodologie per l'editing genomico di iPSC utilizzando i complessi della ribonucleoproteina (RNP) Cas9. Il genoma protocollo di modifica è efficace e può essere facilmente multiplexed di sgRNAs pre-complessanti per più di una destinazione con la proteina Cas9 e contemporaneamente fornire nelle cellule. Infine, descriviamo un approccio semplificato per l'identificazione e caratterizzazione di iPSCs con modifiche desiderate. Presi insieme, le strategie descritte dovrebbero semplificare la generazione e la modifica di iPSC per molteplici applicazioni.
Introduzione
La riprogrammazione di cellule somatiche umane allo stato pluripotent da sovraespressione di fattori di riprogrammazione ha rivoluzionato la ricerca sulle cellule staminali con applicazioni nella modellazione di malattia, la medicina rigenerativa e lo sviluppo di farmaci. Sono disponibili per la consegna dei fattori di riprogrammazione e generando iPSCs diversi metodi di riprogrammazione non-virale, ma il processo è lavoro intensivo e non molto efficiente1. I metodi virali, anche se efficiente, sono associati a problemi di integrazione del virus e carcinogenicità2,3,
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Protocollo
1. protocollo di riprogrammazione
- generazione di iPSC umano da cellule pancreatiche umane primarie
- cappotto un 6-pozzetti piastra con collagene freddo 1,5 mg/mL e consentirle di gel a 37 ° C per 1 h.
- Piastra passaggio precoce primarie cellule pancreatiche umane nel mezzo di Prigrow III (~ 1-1.5 × 10 5 cellule) su un collagene rivestito piastra a 6 pozzetti il giorno -2 a raggiungere circa 2,5 × 10 5 celle o almeno il 60% confluenza per bene il giorno della trasduzione (giorno 0). Per il primo studio, piastra almeno 2-3 pozzi per ottenere un pozzetto con confluency di desiderato il giorno 0. Utilizzar....
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Risultati
In questa pubblicazione, abbiamo seguito un protocollo semplice ma efficace per la generazione di iPSC da cellule pancreatiche umane mediante integrazione o privo di impronta Sendai virus vettori. Figura 1A Mostra una rappresentazione schematica del presente protocollo di riprogrammazione. Le cellule pancreatiche umane sono state acquistate commercialmente, coltivate in medium Prigrow III e trasdotte con il virus Sendai come spiegato sopra. Trasdotte fusiform.......
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Discussione
Riprogrammazione di cellule somatiche umane per iPSCs ha fornito una spinta importante ai campi di ricerca di base di biologia, medicina personalizzata, modellazione di malattia, lo sviluppo di farmaci e medicina rigenerativa16. Molti metodi attuali e ampiamente usati di iPSC umana generazione richiedono l'uso di virus con il rischio di integrazione nel genoma ospite o episomal vettori con bassa efficienza di riprogrammazione. Qui, presentiamo un metodo efficiente per la generazione iPSCs privo di.......
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Dichiarazioni
BT è dei membri fondatori di ristrutturare Biosciences Inc.
Ringraziamenti
Lavoro in laboratorio è stato sostenuto da postdoctoral fellowship grant a Dr. Anjali Nandal e grant esplorativo da Maryland Stem Cell Research Fund a BT (TEDCO).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Vettori virali di Sendai - CytoTune-iPS 2.0 Kit | Invitrogen | A16517 | Scongelamento su ghiaccio; S No: 1 |
| Tripsina EDTA | Gibco Life Tech | 25300-054 | 0,05%, 100 ml; S No: 2 |
| Inibitore della roccia (Y-27632) | Milipore | SCM075 | Uso 10 μ M; S No: 3 |
| DMEM/F-12 medium | Invitrogen | 11330-032 | S No: 4 |
| Siero sostitutivo (KSR) | Gibco | 10828028 | S No: 5 |
| DMEM | Invitrogen | 11960069 | 1X; S No: 6 |
| Siero fetale bovino | Thermo Scientific | SH30071,03 | Aliquota; S No: 7 |
| L-glutammina (Glutamax, 100X), liquido | Thermo Scientific | 35050061 | 1/100; S No: 8 |
| aminoacidi non essenziali | Gibco | 11140-050 | 1/100; S No: 9 |
| 2-Mercaptoetanolo | Gibco | 21985023 | 55 mM, 1/1.000; S No: 10 |
| Ematocitometri Hausser | Hausser Scientific | 02-671-54 | S No: 11 |
| Soluzione di gelatina allo 0,1% | STEMCELL Technologies | 7903 | Incubare a 37º C per 1 ora; S No: 12 |
| anticorpo SSEA-4 | Santacruz | sc-21704 | 1/100; S No: 13 |
| TRA-1-81 anticorpo | Segnalazione cellulare | 4745S | 1/200; S n.: 14 |
| OCT4 anticorpo | Santa Cruz | sc-5279 | 1/1.000; S No: 15 |
| Collagene I, Coda di Ratto | Life Technologies | A10483-01 | Tenere al freddo; S No: 16 |
| Alexa Fluor fluorescent 488/ 568 (anticorpi secondari) | Invitrogen | A21202/A10042 | 1/2.000; S No: 17 |
| DPBS | Hyclone | SH30028LS | 1X; S No: 18 |
| Piastra per coltura tissutale da 100 mm | Falcon | 353003 | S No: 20 |
| Piastra per coltura tissutale a 96 pozzetti | Falcon | 353078 | S No: 21 |
| Piastra per coltura tissutale a 6 pozzetti | Falcon | 353046 | S No: 22 |
| Ambito di dissezione | Nikon | SMZ745 | S No: 23 |
| Cappa di presa | NuAire | NU-301 | S No: 24 |
| 15 ml Provetta da centrifuga | Greiner Bio-One | 188271 | S n.: 25 |
| 50 ml Tubo da centrifuga | Greiner Bio-One | 227261 | S No: 26 |
| Piruvato di sodio | Invitrogen | 11360 | S No: 28 |
| β-mercaptoetanolo | Sigma | M7522 | S No: 29 |
| Prigrow III medium | ABM | TM003 | S No: 31 |
| Countess™ Contatore di cellule | Invitrogen | C10227 | S No: 32 |
| Sistema a raggi X Faxitron Faxitron | CellRad | S No: 33 | |
| Accutase | Innovative cell Technologies | AT-104 | S No: 34 |
| Collagenase | Life Technologies | 17104019 | 1mg/ml stock; S No: 35 |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | S No: 36 |
| matrigel qualificato hESC | BD Biosciences | 354277 | Per diluire, utilizzare DMEM/F-12 a freddo; S No: 37 |
| bFGF | R & D | 233-FB | Cartone: 10 ug/ml; S No: 38 |
| Paraformaldeide | EMS | 15710 | 4% stock in PBS; S No: 39 |
| TRA-1-60 | Santa Cruz | sc-21705 | 1/100; S No: 40 |
| NANOG | ReproCELL | RCAB0004P-F | 1/100; S No: 41 |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML | S No: 42 |
| Kit fosfatasi alcalina | Stemgent | 00-0055 | S No: 43 |
| Cas9 proteina | PNA Bio | CP01-50 | Scongelamento e aliquota; S No: 44 |
| Siero di capra o asino | Sigma | D9663/G9023 | S No: 45 |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | S No: 46 |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | S No: 47 |
| Tris | Sigma | 9285-100ML | S No: 48 |
| NaCL | Sigma | S7653-250G | S No: 49 |
| EDTA | Sigma | BP2482-500 | S No: 50 |
| T4 DNA ligasi | NEB | M0202T | S No: 51 |
| Mega Shortscript T7 kit | Thermo Scientific | AM1354 | S No: 52 |
| Mega Clear kit | Thermo Scientific | AM1908 | S No: 53 |
| SMC4 | BD Biosciences | 354357 | S No: 54 |
| Fibronectin | STEMCELL Technologies | 7159 | S No: 55 |
| Kit di clonazione CloneJET | Thermo Scientific | K1232 | S No: 56 |
| Analizzatore di frammentiTM | Advanced Analitico | S No: 57 | |
| mTeSR1 kit medio | STEMCELL Technologies | 5850 | Caldo a temperatura ambiente; S No: 58 |
| Mezzo di congelamento mFreSR™ | STEMCELL Technologies | 5855 | S No: 59 |
| Mezzo di congelamento CryoStor® | STEMCELL Technologies | 7930 | S No: 60 |
| MEFs | Globalstem | GSC-6301G | S No: 61 |
| L-glutammina | Invitrogen | 25030081 | S No: 62 |
| Cellule pancreatiche umane | ABM | T0159 | S No: 63 |
| STEMdiff™ Tecnologie | cellule staminali | 5835 | S No: 64 |
| RPMI | Thermofisher | 11875-093 | S No: 65 |
| 2% B27-insulin | Thermofisher | A1895601 | S No: 66 |
| CHIR99021 | Stemcell Technologies | 72052 | S No: 67 |
| IWP4 | Stemcell Technologies | 72552 | S No: 68 |
| 2% B27 | Thermofisher | 17504044 | S No: 69 |
| MCDB 131 | Life Technologies | 10372019 | S No: 70 |
| Bicarbonato di sodio | Sigma-Aldrich | S8761-100ML | S No: 71 |
| Glucosio | Sigma-Aldrich | G8270-100G | S No: 72 |
| BSA | Proliant | 68700 | S No: 73 |
| GDF8 | Pepro-Tech | 120-00 | S No: 74 |
| TUJ1 anticorpo | EMD Milipore | AB9354 | S No: 75 |
| NKX2-5 anticorpo | Santa Cruz | Sc-14033 | S No: 76 |
| SOX17 anticorpo | R & D systems | AF1924 | S No: 77 |
| Ioduro di propidio | Thermo Scientific | P3566 | S No: 78 |
| Amaxa 4D-nucleofector™ | Lonza | AAF-1002 | S No: 79 |
| FACSAria II (selezionatore cellulare) | BD biosciences | SORP UV | S No: 80 |
Riferimenti
- Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol. Biol. 997, 23-33 (2013).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka,....
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Ristampe e permessi
