Analisi per Transposase-accessibile della cromatina accoppiato con sequenziamento ad alta produttività (ATAC-seq) è un metodo di genoma per scoprire accessibile della cromatina. Questo è un protocollo di ATAC-seq passo dopo passo, da molecolari all'analisi computazionale del finale, ottimizzato per i linfociti umani (Th1/Th2). Questo protocollo può essere adottato da ricercatori senza precedente esperienza nei metodi di sequenziamento di nuova generazione.
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Articolo metodologico
Mappatura del genoma della cromatina accessibile in linfociti T umani primari da ATAC-Seq
In questo articolo
Sommario
Abstract
Dosaggio per cromatina Transposase-accessibile con sequenziamento ad alta produttività (ATAC-seq) è un metodo utilizzato per l'identificazione di regioni aperte (accessibile) della cromatina. Queste regioni rappresentano elementi di DNA regolatori (ad es., promotori, enhancers, locus control regioni, Isolatori) a cui trascrizione si legano fattori. Il paesaggio di cromatina accessibile la mappatura è un approccio potente per scoprire elementi regolatori attivi in tutto il genoma. Questa informazione serve come un approccio imparziale per scoprire la rete di fattori di trascrizione pertinenti e meccanismi della struttura della cromatina che governano programmi di espressione genica. ATAC-seq è un'alternativa robusta e sensibile alla dnasi analisi di ipersensibilità accoppiato con formaldeide-assistita isolamento di elementi regolatori (FAIRE-seq) per l'analisi del genoma della cromatina e sequenziamento di nuova generazione (DNasi-seq) accessibilità e per il sequenziamento di micrococcal siti sensibili nucleasi (MNase-seq) per determinare il posizionamento nucleosoma. Vi presentiamo un dettagliato protocollo di ATAC-seq ottimizzato per cellule umane primarie immuni cioè CD4 + linfociti (T helper 1 (Th1) e cellule Th2). Questo protocollo completo inizia con la raccolta delle cellule, quindi descrive la procedura molecolare di cromatina tagmentation, preparazione del campione per il sequenziamento di nuova generazione e include anche metodi e considerazioni per l'analisi computazionali utilizzati per interpretare i risultati. Inoltre, per risparmiare tempo e denaro, abbiamo introdotto misure di controllo di qualità per valutare la libreria ATAC-seq prima del sequenziamento. Importante, i principi esposti nel presente protocollo consentono il suo adattamento ad altre cellule primarie umane immuni e non immuni e linee cellulari. Queste linee guida sarà anche utile per i laboratori che non sono abili con metodi di sequenziamento di nuova generazione.
Introduzione
ATAC-seq1,2 è un metodo affidabile che consente l'identificazione di regioni di cromatina aperta regolamentare3 e posizionamento nucleosoma. Questa informazione viene applicata per dedurre la posizione, identità e attività di fattori di trascrizione. Sensibilità del metodo di misurazione quantitativa delle variazioni nella struttura cromatinica permette lo studio dell'attività dei fattori della cromatina, compreso remodelers della cromatina e modificatori, come pure l'attività trascrizionale di RNA polimerasi II1. Così ATAC-seq fornisce un approccio potente e imp....
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Protocollo
tutte le procedure sono state approvate dal comitato di revisione istituzionale dell'Università di Bar Ilan e il protocollo segue linee guida fornite dal comitato che approva gli esperimenti.
1. purificazione di ingenuo CD4 + cellule umane e polarizzazione di cellule Th2 e T Helper 1 (Th1)
Nota: Qui descriviamo la procedura a partire da cellule mononucleari del sangue periferico umano congelato (PBMCs). Il primo passo consiste nell'isolare le cellule CD4 + utilizzando microsfere e colonne che di solito dare noi più del 95% delle cellule di CD4 +. Tuttavia, questo passaggio può variare secondo il protocollo prefe....
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Risultati
Il risultato finale di questo protocollo è una libreria di ATAC-seq di in genere 3-20 ng / µ l. Quando eseguito su un sistema per l'analisi dell'integrità del DNA (Vedi Tabella dei materiali/attrezzature), essi mostrano la scala-come l'apparenza2 (Figura 3A). La dimensione media dei frammenti del DNA è in genere ~ 450-530 bp.
Controllo di qualità adeguata del.......
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Discussione
Il protocollo di ATAC-seq descritto qui è stato impiegato con successo per l'analisi della cromatina accessibile in cellule primarie (umano Th1, Th2 cellule e cellule di B) così come le linee di cellule in coltura (cellule di cancro al seno umane MCF10A e U261 le cellule di glioblastoma). L'applicazione di ATAC-seq per altri tipi di cellule può richiedere alcune ottimizzazione dei protocolli, soprattutto nel passaggio lisi. Se la concentrazione del detergente non ionico è troppo alto, potrebbe trattarsi di una percentual.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è sostenuto dalla Fondazione di scienza di Israele (grant 748/14), Marie Curie integrazione concedere (CIG) - 7 ° PQ-persone-20013-CIG-618763 e programma del Planning e Budgeting Comitato e The Israel Science Foundation CORE concedere n. 41/11.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette da 50 mL | Lumitron | LUM-CFT011500-P | Può provenire da altri fornitori. |
| Microtubi | Axygen Inc | MCT-175-C | Può provenire da altri fornitori. |
| Pipette sierologiche da 25 ml Corning | Costar | 4489 | Può provenire da altri fornitori. |
| Pallone per coltura tissutale | Lumitron | LUM-TCF-012-250-P | Può provenire da altri fornitori. |
| Contatore di cellule automatizzato Countes | Invitrogen | C10227 | |
| NucleoSpin Tissue | MACHEREY-NAGEL | 740952.5 | |
| Cellule mononucleate del sangue periferico ( PBMC) | ATCC& | nbsp; PCS&timido; 800&timido; 011 | Può provenire da altri fornitori. |
| RPMI 1640 Medium | Biological Industries | 01-103-1A | Può provenire da altri fornitori. |
| Soluzione di L-Glutammina (200 mM) | Biological Industries | 03-020-1B | Può provenire da altri fornitori. |
| Penicillina-Streptomicina | Industrie Biologiche | 03-031-1B | Può provenire da altri fornitori. |
| Siero fetale bovino (FBS), Industrie | biologiche | inattivato al calore 04-127-1 | Può provenire da altri fornitori. |
| Microsfere MACS CD4, umano | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| Colonne MACS MS | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Human CD4 FITC | Biogems | 06121-50 | |
| Controllo dell'isotipo IgG1 di topo FITC | Biogems | 44212-50 | |
| Anti-Human CD3 (OKT3) | Tonbo biosciences | 40-0037 | |
| Anti-Human CD28 SAFIRE Biogems purificato | 10311-25 | ||
| IL2 umano ricombinante | Peprotech | 200-02 | |
| IL4 umano ricombinante | Peprotech | 200-04 | |
| IL12 umano ricombinante p70 | Peprotech | 200-12 | |
| In vivo pronto anti-umano IL-4 (MP4-25D2) | Tonbo | 40-7048 | |
| LEAF IFN purificato anti-umano-γ | BioLegend | 506513 | |
| NaCl, grado analitico | Carlo Erba | 479687 | Può provenire da altri fornitori. |
| Cloruro di magnesio, esaidrato, grado di biologia molecolare | Calbiochem | 442611 | Può provenire da altri fornitori. |
| EDTA | MP Biomedicals | 800682 | Può provenire da altri fornitori. |
| Tris, ultra puro, puro al 99,9% | MP Biomedicals | 819620 | Può provenire da altri fornitori. |
| Alternativa NP-40 (Nonylphenyl Polyethylene Glycol) | Calbiochem | 492016 | Può provenire da altri fornitori. |
| Inibitori della proteasi | Sigma | P2714 | questo inibitore della proteasi coctail è una polvere. Per preparare 100 x soluzione diluire in 1 mL di acqua di biologia molecolare. |
| Perline magnetiche di immobilizzazione inversa in fase solida: Perline AMPure XP Kit di | Beckman | 63881 | |
| HyLabs | EX-GP200 | Può provenire da altri fornitori. | |
| Kit di preparazione della libreria di DNA Nextera (trasposasi TDE1 e tampone TD) | Illumina | FC-121-1030 | |
| NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | |
| NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| CFX Connect PCR in tempo reale Rilevamento Sistema | Bio-rad | 185-5200 | Può provenire da altri fornitori. |
| Software CFX Manager | Bio-rad | 1845000 | |
| master mix per qPCR: iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5124 | Può provenire da altri fornitori. |
| Fluorimetro Qubit 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
| Kit di analisi Qubit dsDNA HS | Invitrogen | Q32854 | |
| Magnete per provette eppendorf | Invitrogen | 12321D | Può provenire da altri fornitori. |
| Centrifuga di raffreddamento a secchiello oscillante con i secchi per provette falcon da 15 mL e provette eppendorf | Thermo Scientific | 75004527 | Potrebbe provenire da altri fornitori. È importante che abbia secchi per le provette Eppendorf. |
| Thermo-shaker | MRC | Può provenire da altri fornitori. | |
| ScreenTape D1000 ad alta sensibilità | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| Reagenti D1000 ad alta sensibilità | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| Sistema TapeStation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | Piattaforma basata su nastro per elettroforesi |
| Kit DNA ad alta sensibilità | Agilent Technologies | 5067-4626 | Reagente per analisi TapeStation |
| Nome e sequenza del primer | azienda | ||
| : 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCGTCGGCAGCGTC AGATGTG-3'IDT | Ad1-noMx: 5'-P5 sequenza-trasposasi sequenza-3'Ad2.1_TAAGGCGA | ||
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| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.2_expected sequenza indice leggere: 5'-P7 sequenza-[sequenza indice]-trasposasi sequenza-3' | ||
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| : 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAAACGG]GTCTCGTGGGC< br/> TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.16_expected sequenza indice leggere: 5'-P7 sequenza-[sequenza indice]-trasposasi sequenza-3' | ||
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| Ad2.20_GTGTGGTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CACCACAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.20_expected sequenza indice read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposasi sequence-3' | ||
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| : 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.22_expected sequenza indice read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposasi sequence-3'Ad2.23_TTGACCCT | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.23_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'Ad2.24_CCACTCCT | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.24_expected sequenza indice read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'F1 | ||
| : 5'-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3'IDT | |||
| R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3'IDT | |||
| F2: 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3'IDT | |||
| R2: 5'-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3'IDT | |||
| F3: 5'-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3'IDT | |||
| R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3'IDT | |||
| F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3'IDT | |||
| R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3'IDT |
Riferimenti
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J.
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Ristampe e permessi
