Articolo metodologico

Mappatura del genoma della cromatina accessibile in linfociti T umani primari da ATAC-Seq

17.7K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/56313

⸱

13 novembre 2017

 ,  ,  ,  , 
1The Mina and Everard Goodman Faculty of Life Sciences, Bar-Ilan University

In questo articolo

Sommario

Analisi per Transposase-accessibile della cromatina accoppiato con sequenziamento ad alta produttività (ATAC-seq) è un metodo di genoma per scoprire accessibile della cromatina. Questo è un protocollo di ATAC-seq passo dopo passo, da molecolari all'analisi computazionale del finale, ottimizzato per i linfociti umani (Th1/Th2). Questo protocollo può essere adottato da ricercatori senza precedente esperienza nei metodi di sequenziamento di nuova generazione.

Abstract

Dosaggio per cromatina Transposase-accessibile con sequenziamento ad alta produttività (ATAC-seq) è un metodo utilizzato per l'identificazione di regioni aperte (accessibile) della cromatina. Queste regioni rappresentano elementi di DNA regolatori (ad es., promotori, enhancers, locus control regioni, Isolatori) a cui trascrizione si legano fattori. Il paesaggio di cromatina accessibile la mappatura è un approccio potente per scoprire elementi regolatori attivi in tutto il genoma. Questa informazione serve come un approccio imparziale per scoprire la rete di fattori di trascrizione pertinenti e meccanismi della struttura della cromatina che governano programmi di espressione genica. ATAC-seq è un'alternativa robusta e sensibile alla dnasi analisi di ipersensibilità accoppiato con formaldeide-assistita isolamento di elementi regolatori (FAIRE-seq) per l'analisi del genoma della cromatina e sequenziamento di nuova generazione (DNasi-seq) accessibilità e per il sequenziamento di micrococcal siti sensibili nucleasi (MNase-seq) per determinare il posizionamento nucleosoma. Vi presentiamo un dettagliato protocollo di ATAC-seq ottimizzato per cellule umane primarie immuni cioè CD4 + linfociti (T helper 1 (Th1) e cellule Th2). Questo protocollo completo inizia con la raccolta delle cellule, quindi descrive la procedura molecolare di cromatina tagmentation, preparazione del campione per il sequenziamento di nuova generazione e include anche metodi e considerazioni per l'analisi computazionali utilizzati per interpretare i risultati. Inoltre, per risparmiare tempo e denaro, abbiamo introdotto misure di controllo di qualità per valutare la libreria ATAC-seq prima del sequenziamento. Importante, i principi esposti nel presente protocollo consentono il suo adattamento ad altre cellule primarie umane immuni e non immuni e linee cellulari. Queste linee guida sarà anche utile per i laboratori che non sono abili con metodi di sequenziamento di nuova generazione.

Introduzione

ATAC-seq1,2 è un metodo affidabile che consente l'identificazione di regioni di cromatina aperta regolamentare3 e posizionamento nucleosoma. Questa informazione viene applicata per dedurre la posizione, identità e attività di fattori di trascrizione. Sensibilità del metodo di misurazione quantitativa delle variazioni nella struttura cromatinica permette lo studio dell'attività dei fattori della cromatina, compreso remodelers della cromatina e modificatori, come pure l'attività trascrizionale di RNA polimerasi II1. Così ATAC-seq fornisce un approccio potente e imparziale per decifrare i meccanismi che governano la regolazione trascrizionale in qualsiasi tipo di cellula di interesse. Descriviamo l'adattamento di ATAC-seq per cellule umane primarie di Th1 e Th2.

ATAC-seq, iperattivo Tn5 transposase caricato con adattatori per frammentazione del DNA di sequenziamento di nuova generazione (NGS) coppie con la codifica del DNA con adattatori (cioè, il processo di "tagmentation")1. In seguito l'amplificazione di PCR, le librerie di DNA risultante sono pronte per il sequenziamento di nuova generazione (Figura 1). Il tagmentation preferenziale della cromatina accessibile viene rilevato dall'analisi dell'arricchimento locale di letture di sequenziamento ATAC-seq.

La breve procedura sperimentale e requisito per meno materiale di partenza, rispetto al altri metodi per misurare l'accessibilità della cromatina e posizionamento nucleosomal dnasi-seq4, FAIRE-seq5e MNase-seq6, ha promosso l'uso di ATAC-seq in più sistemi biologici tra cui cellule primarie umane1,7 e campioni clinici8, così come organismi unicellulari9, piante10, mosche della frutta11 e vari mammiferi12.

L'identità della trascrizione, fattori che sono associati ai loci accessibile possono essere scoperta dalla analizzando l'arricchimento dei loro motivi di sequenza di associazione o combinando ATAC-seq con immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) seguita da (sequenziamento del DNA di alto-rendimento ChIP-seq). Questo approccio ha permesso l'identificazione di fattori di trascrizione lineage-specifici importanti per l'ematopoiesi in mouse13. La natura imparziale e globale di ATAC-seq permette di studiare la regolazione genica negli organismi per i quali i reagenti come gli anticorpi per l'analisi di ChIP non sono disponibili. Ad esempio, variazioni di evolutive in cis-regioni regolarici sono state identificate attraverso lo studio di cellule neurali craniche della cresta da esseri umani e scimpanzé14, variazioni inerenti allo sviluppo di elementi regolatori durante primo mouse l'embriogenesi15, cambia nel panorama normativo durante un ciclo di vita di unicellulari owzarzaki c.9e l'evoluzione dei promotori e rinforzatori attraverso 20 mammifero specie12.

ATAC-seq è stato strumentale per misurare l'accessibilità della cromatina in singole cellule, così rivelando variabilità all'interno di popolazioni di cellule, che solitamente sfugge genoma studi7,16. Inoltre, ATAC-seq può essere utilizzato per studiare i cambiamenti che si verificano in condizioni di malattia, in cui i campioni sono rari nelle regioni regolatrici del DNA. Ad esempio, ATAC-seq può essere utilizzato per studiare i cambiamenti nel panorama normativo durante l'insorgenza della leucemia mieloide acuta (AML)17 o Ras-driven oncogenesi11.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

tutte le procedure sono state approvate dal comitato di revisione istituzionale dell'Università di Bar Ilan e il protocollo segue linee guida fornite dal comitato che approva gli esperimenti.

1. purificazione di ingenuo CD4 + cellule umane e polarizzazione di cellule Th2 e T Helper 1 (Th1)

Nota: Qui descriviamo la procedura a partire da cellule mononucleari del sangue periferico umano congelato (PBMCs). Il primo passo consiste nell'isolare le cellule CD4 + utilizzando microsfere e colonne che di solito dare noi più del 95% delle cellule di CD4 +. Tuttavia, questo passaggio può variare secondo il protocollo preferito in ogni laboratorio. Il protocollo per l'attivazione delle cellule T e la polarizzazione è stato modificato da Jenner et al. (2009) 18. isolamento di CD4 + cellule da 10 milioni PBMCs dà luogo a 4 milioni di cellule CD4 +. Sono diviso in due boccette e cresciuti sotto Th1 e di polarizzazione Th2 condizioni ottenendo 3 milioni cellule Th1 e Th2 in appena una settimana.

Nota: raffreddare la centrifuga a 4 ° C prima di iniziare.

  1. Scongelare 1 mL di PBMCs umano (10 7 cellule) in una provetta da 50 mL contenente 10 mL di medium RPMI supplementato con 1% di penicillina-streptomicina, 2 mM L-Glutammina e siero bovino fetale inattivati 10%. Centrifugare a 500 g per 5 min, rimuovere il supernatante e risospendere le cellule con una pipetta sterile 25 mL in 15 mL di medium RPMI completato. Trasferire le cellule (con una pipetta sterile 25 mL) in un pallone di cultura T75.
  2. Lasciare le celle durante la notte in un incubatore (37 ° C, 5% CO 2).
  3. Trasferire le cellule galleggiante con una pipetta sterile da 25 mL per tubo da 50 mL. Determinare il numero di cell e attuabilità di esclusione del blu di trypan.
  4. Isolare CD4 + cellule da 10 milioni vivono antiaderente PBMCs di selezione positiva utilizzando microsfere di CD4 + e colonne secondo il produttore ' consigli s (Vedi Tabella dei materiali/attrezzature) con i seguenti modifiche: 10 7 PBMCs sono etichettati con 30 µ l di microsfere di CD4 in 120 µ l di 0,5% BSA in PBS.
  5. Per attivare le cellule T CD4 + per 72 h rhIL-2 (10 ng/mL), associato a piastra anti-CD3 (5 µ g/mL) e solubile anti-CD28 (2 µ g/mL). Per polarizzazione Th1, aggiungere rhIL-12 (20 ng/mL) e anti-IL-4 (10 µ g/mL). Per polarizzazione Th2, aggiungere rhIL-4 (40 ng/mL) e anti-IFN-γ (10 µ g/mL).
  6. Le cellule della coltura per ulteriori 7 giorni in presenza di rhIL-2 (10 ng/mL) e le stesse citochine polarizzante (rhIL-12 per Th1 e rhIL-4 per Th2).

2. Isolamento di nuclei

Nota: ATAC-seq viene eseguita con i nuclei intatti. Lysis buffer contenente 0,05% nonylphenyl polietilenglicole (Vedi Tabella dei materiali/attrezzature) è stato calibrato per isolare nuclei da cellule umane primarie di Th1 e Th2. Si consiglia di calibrare questo passaggio con i reagenti di laboratorio e le cellule. Un eccesso di cellule intatte da detersivo insufficiente diminuisce l'efficienza della reazione di trasposizione. Efficienza di lisi delle cellule è determinata dal numero dei nuclei (cellule positive del blu di trypan) rispetto al numero totale delle cellule.
Nota: Preparare il tampone di lisi (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 millimetri di NaCl, 3 mM MgCl 2). Raffreddare una centrifuga con rotore a battente-benna a 4 ° C. cubettatura le cellule in una centrifuga di swing-secchio invece di una centrifuga ad angolo fisso riduce la perdita di nuclei e delle cellule. Per evitare i nuclei o perdita delle cellule, Pipettare attentamente quando scartare il surnatante.

  1. Aggiungi fresco nonylphenyl polietilenglicole (a una concentrazione finale di 0.05%) e inibitori della proteasi (a una concentrazione finale di 1 x) per il buffer di lisi freddo immediatamente prima dell'uso: 100x. Mantenere il buffer su Ice.
  2. Cellule di T totali per determinarne la quantità e la redditività mediante metodo del blu di trypan. Vitalità che è inferiore al 90% di risultati superiore non specifico digestione.
  3. Trasferimento 0,5 x 10 6 T cellule (Th1 o Th2) per microprovette da 1,5 mL. Rotazione verso il basso a 500 x g per 5 min a 4 ° C.
  4. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di freddo tampone fosfato salino (PBS) soluzione. Rotazione verso il basso a 500 x g per 5 min a 4 ° C.
  5. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone di lisi freddo (contenente nonylphenyl polietilene glicole e inibitori della proteasi). Tenere il tubo sul ghiaccio. Pipetta delicatamente per evitare di interrompere i nuclei.
  6. Rapidamente prendere 10 µ l e contare le celle con un contatore di cellule automatizzato mentre nella microprovetta con le cellule lisate è il ghiaccio. Questo passaggio non deve superare i cinque minuti per evitare di danneggiare i nuclei. Almeno l'80% delle cellule dovrebbe essere lisati.
  7. Continua immediatamente con la reazione di trasposizione. Mantenere i nuclei preparati sul ghiaccio.

3. Reazione di trasposizione

Nota: In questo passaggio, nuclei isolati sono incubati con procariotiche Tn5 transposase (TDE1) caricato con adattatori per il sequenziamento NGS. Tn5 iperattivo, contemporaneamente, frammenti di DNA e lega adattatori in regioni accessibili del genoma (processo tagmentation). Il rapporto tra nuclei e Tn5 transposase è critico per la scissione preferenziale alla cromatina accessibile. Questo protocollo è calibrato per 100.000 nuclei in un volume di reazione 100 μL. Tuttavia, la reazione può essere ridimensionata.

  1. Set temperatura in uno shaker termale a 37 ° C.
  2. Trasferire 100.000 nuclei ad una microprovetta 1,5 mL.
  3. Centrifuga a 500 x g per 10 min a 4 ° C e delicatamente rimuovere il supernatante.
  4. Aggiungere i componenti di reazione di trasposizione dei nuclei come specificato nella tabella 1.
  5. Risospendere pipettando delicato.
  6. Incubare la reazione di trasposizione in uno shaker termale a 37 ° C per 30 min con lieve agitazione (500 giri/min).
    Nota: Pulizia del DNA viene eseguita da fase solida reversibile immobilizzazione perline 19 (Vedi Tabella dei materiali/attrezzature) o colonne di purificazione di PCR. Al termine della pulizia, eluire i frammenti di DNA in 20 µ l di 10 mM Tris-HCl, pH 8. Evitare di EDTA in tampone di eluizione.

4. Arricchimento di PCR delle librerie ATAC-seq

Nota: questo passaggio si rivolge per amplificare i frammenti di ATAC-seq libreria cioè DNA con adattatori inseriti. Per consentire la miscelazione di diverse librerie di ATAC-seq nella stessa corsia di sequenziamento di nuova generazione (" multiplexing ") uso meno Primer 1 (Ad1_noMx) 1 per tutti i campioni, e una diversa indicizzati (codice a barre) 2 Primer (Ad 2.1-2.24) 1 per ogni campione. Le sequenze dell'iniettore sono fornite nell' completati Tabella di materiali/attrezzature.

  1. L'amplificazione di PCR iniziale
    Nota: la concentrazione di lavoro di Primer 1 (Ad1_noMx) e 2 Primer è 25 µM. Tutti i primer sono diluiti da originale stock di 100 µM a 25 µM. In tutte le reazioni di PCR, utilizzare Primer 1 (Ad1_noMx) e solo uno dei 2 Primer indicizzata.
    1. Aggiungere i componenti della reazione PCR come specificato nella tabella 2 in una provetta sterile da PCR.
    2. Posto PCR tubo in un termociclatore ed eseguire l'amplificazione di PCR utilizzando i ciclismo condizioni dettagliate nella tabella 3.
  2. Valutazione del numero di cicli di amplificazione aggiuntiva
    Nota: il numero di ulteriori cicli di PCR dovrebbe produrre sufficienti quantità di libreria frammenti fo un successo sequenziamento di nuova generazione esegue, mentre ridotti al minimo per evitare GC e taglia bias 20. La determinazione del numero di cicli PCR (N) richiesti per l'amplificazione del frammento biblioteca ottimale avviene mediante PCR quantitativa (qPCR).
    1. Diluire 1 Primer (Ad1_noMx) e 2 (usato per l'amplificazione iniziale Biblioteca) da 25 µM a 6.25 µM.
    2. Aggiungere i componenti a tubi ottici di PCR o un piatto, come indicato nella tabella 4.
    3. Posto in un ciclo come specificato nella tabella 5 e strumento di qPCR.
    4. Per stimare il numero di cicli di amplificazione aggiuntiva (N), tracciare il numero di cicli sull'asse x e relativa fluorescenza (RFU) sull'asse y.
    5. Il numero di amplificazione ulteriore cicli (N) è 1/3 del numero di cicli in cui la reazione di qPCR raggiunto il plateau. Figura 2 fornisce esempi per tre librerie di ATAC-seq che raggiungessero plateau a ~ 2.350 unità relativa fluorescenza, RFU (linea verde spessa). Il numero di cicli PCR in cui un terzo dell'importo massimo (783 RFU, segnato sull'asse y) è amplificato corrisponde a 8 cicli per due delle librerie (curve di amplificazione rosso e blu) e 9 cicli PCR per la libreria terza (rosa).
  3. L'amplificazione di PCR finale
    1. amplificare il restante 45 µ l della reazione PCR. Inserire un tubo PCR contenente la reazione di amplificazione dal punto 4.1.2 in un termociclatore. Eseguire il programma PCR descritto nella tabella 6. Utilizzare il numero di determinati in precedenza (punto 4.2.5) di cicli di amplificazione (N).

5. Taglia selezione delle biblioteche di ATAC-Seq

Nota: nella nostra esperienza, selezione della dimensione di amplificato ATAC-seq librerie migliora risultati di sequenziamento di nuova generazione perché Elimina frammenti di libreria ad alto peso molecolare dalla finale ATAC-seq biblioteca.
Nota: Lasciare i branelli magnetici a temperatura ambiente 30 min prima dell'uso.
Preparare fresco etanolo al 70% in acqua priva di nucleasi.

  1. Risospendere i branelli magnetici mescolando.
  2. Aggiungere acqua priva di nucleasi per le librerie di ATAC-seq (ottenute al punto 4.3.1.) e portare fino a 100 µ l.
  3. Aggiungere 50 µ l (0.5 x) di sedimento biglie magnetiche di legame al DNA a 100 µ l di amplificato librerie. Mescolare pipettando su e giù almeno 10 volte. Incubare i campioni per 5 min a temperatura ambiente. Se necessario, ruota velocemente giù le microprovette.
  4. Inserire il tubo su un appropriato supporto magnetico per 2 min separare i branelli magnetici dal surnatante. Dopo 2 minuti, trasferire il surnatante ad una nuova microprovetta.
  5. Misurare il volume del surnatante pipettando e aggiungere 0,7 x di biglie magnetiche. Mix pipettando su e giù almeno 10 volte.
  6. Incubare 5 min a temperatura ambiente. Posto su un supporto magnetico per 2 min.
  7. Dopo il 2 min di incubazione, scartare il surnatante. Aggiungere 200 µ l preparata etanolo al 70% per lavare le perle mentre i tubi sono su supporto magnetico.
  8. Tenere il conetti sul magnete per 30 s e poi scartare l'etanolo. Ripetere il passaggio 5.7.for due lavaggi di etanolo finale.
  9. Rimuovere completamente le rimanenti etanolo e lasciare che asciugare all'aria le perline per 5 min mentre il tubo è sul magnete. Se necessario, girare brevemente nella microprovetta. Rimuovere le tracce di etanolo con una punta di pipetta p10.
  10. Rimuovere la provetta dal magnete e 22 µ l di 10 mM Tris-HCl, pH 8. Non eluire le librerie di ATAC-seq in tampone contenente EDTA.
  11. Incubare la provetta per 2 min a temperatura ambiente e poi mettete sul supporto magnetico.
  12. Quando la soluzione è limpida, trasferire una nuova microprovette sterili 20 µ l di librerie eluite.
  13. Store la dimensione selezionata ATAC-seq librerie a -20 ° C.

6. Analisi della qualità delle librerie ATAC-Seq

  1. convalida della qualità dell'ATAC-seq librerie di Real-Time PCR
    Nota: è importante valutare il rapporto segnale-rumore delle librerie ATAC-seq prima della prossima generazione sequenziamento. Questo viene fatto determinando la relativa quantità di frammenti di DNA da loci accessibile e inaccessibili mediante PCR quantitativa (qPCR). I loci inaccessibili (controllo negativo, chr1:48, 137, 860-48,137,934 e chr1:193, 093, 748-193,093,827) sono amplificati da coppie di primer 1 e 2. I loci accessibili (controllo positivo, chr19:30, 336, 166-30,336,253 e chr19:11546154-11546237) sono amplificati da coppie di primer 3 e 4. Loci positivi e negativi sono stati definiti dai profili di accessibilità (DHS-seq) cromatina delle cellule CD4 + umane (ENCODE adesioni ENCSR000EQE ed ENCSR000EQG). Negativo iniettore 1 si trova in una grande regione intergenica heterochromatic (230 kb da TRADB2 e 88 kb da FOXD2). Regione di controllo negativo 2 è all'interno del primo introne del gene CDC73. A valle del gene di Cyclin E (CCNE1) mentre la coppia di primer positivo 4 positivo coppia di primer 3 è all'interno di una regione aperta della cromatina è centrato all'interno il promotore della proteina chinasi C substrato 80K-H (PRKCSH). D'importanza, questi loci di controllo mostrano un modello simile di accessibilità in altri tipi di cellule umane del progetto ENCODE 3, suggerendo che possono essere applicate per monitorare ATAC-seq librerie da un ampio spettro di tipi della cellula umana. Primer efficienza e specificità di tutte le coppie di primer è stata verificata da qPCR su una diluizione seriale di DNA genomic (da cellule umane Th) e un'analisi della curva di fusione dei prodotti amplificati ottenuti.
    1. Isolare DNA genomico utilizzando un disponibili in commercio kit (Vedi Tabella dei materiali/attrezzature).
    2. Diluire l'ATAC-seq amplificato libreria 01:10 (1 µ l libreria + 9 µ l di acqua priva di nucleasi) e DNA genomico a ~ 5 ng / µ l.
    3. Preparare la miscela di reazione (tabella 7) per ogni coppia di primer di controllo positivi e negativi, tenendo conto che le reazioni vengono eseguite in triplice copia.
    4. Incubare in termociclatore qPCR secondo il protocollo consigliato dal fornitore di mix master qPCR.
    5. Analizzare i risultati in qPCR strumento ' software s (Vedi Tabella dei materiali/attrezzature). Scegliere il DNA genomico come un campione di controllo. I valori ottenuti rappresentano un arricchimento delle regioni accessibili (amplificati di primer di controllo positivo). Un esempio è illustrato nella tabella 8.
      Nota: Stima della libreria di media dimensione e concentrazione: la distribuzione delle dimensioni dei frammenti del DNA dalle librerie di ATAC-seq è determinata dai sistemi automatizzati elettroforesi ad alta sensibilità secondo il produttore ' s istruzioni. Si consiglia di misurare la concentrazione del campione su un fluorometro utilizzando kit di dsDNA ad alta sensibilità e almeno 2 µ l di ciascun campione di DNA.
      Nota: Sequenziamento di nuova generazione - prima del funzionamento in multiplex le librerie, calcolare la molarità di ciascuna libreria di ATAC-seq utilizzando la formula: (ng / µ l x 10 6) / (660 x libreria media frammento lunghezza). Obiettivo per > 30 milioni letture di ciascuna libreria di ATAC-seq per valutare la cromatina aperta regioni di campioni umani. Se si desidera determinare se la libreria è abbastanza buona per il sequenziamento NGS, inizialmente obiettivo per letture 10 milioni (5% della corsia di sequenziamento a strumento di sequenziamento del DNA in modalità di esecuzione rapida). Tenete a mente che per dedurre nucleosoma posizionamento, accoppiato-fine sequenziamento è necessaria 1.

7. Analisi dei risultati di sequenziamento Next-Generation ottenuti

  1. dedurre la qualità del sequenziamento legge controllando i file FastQC, separatamente per ogni libreria.
  2. Allineare le letture al genoma umano riferimento (Assemblea hg19) utilizzando Bowtie 21 software in ambiente Unix/Linux. Il comando è ' bowtie -m 1 - q -S genoma directory reads.fastq output_aligned.sam '. Directory di genoma sta per la cartella dove sono memorizzati gli indici di genoma di Bowtie. Il parametro -m 1 è per non permettere che l'allineamento di letture per più di un locus nel genoma, - q è per il file di input che deve essere nel formato fastq -S è per l'output in formato SAM.
  3. Rimuovere duplicate letture utilizzando SAMtools 22 rmdup opzione in ambiente Unix/Linux. I comandi sono ' samtools Mostra output_aligned.sam -b -S | samtools ordinare -o-output_aligned > output_aligned.bam ',
    samtools rmdup -s output_aligned.bam output_aligned _rmdup.bam '. Il primo comando, Visualizza, cambia il formato di SAM in formato BAM che viene quindi ordinata. L'opzione di rmdup è quindi applicato il file ordinato di BAM. Opzionalmente si possono regolare le letture per il sito di inserzione del trasposone, come descritto nell'originale carta di ATAC-seq 1. Questa operazione viene eseguita utilizzando BEDtools i comandi 23 in ambiente Unix/Linux. I comandi sono ' bamToBed -i output_aligned _rmdup.bam > output_aligned _rmdup.bed ', ' shiftBed -i genoma di output_aligned _rmdup.bed -p 4 - m-5 - g > output_aligned _rmdup_adjusted.bed '. Il primo comando, bamTobed, cambia il formato BAM in formato letto, che può quindi essere utilizzato per il comando di shiftBed. Il file di genoma è un file delimitato da tabulazioni che contiene la lunghezza di ciascun cromosoma nel genoma. Di solito viene aggiunto il file nella directory BEDtools.
  4. Eseguire chiamate di picco mediante analisi basata su modello di ChIP-seq (MACS2) 24 software nell'ambiente di Unix/Linux sul file letto spostato con i seguenti parametri: - nomodel - extsize 75-- spostamento -30. Questi parametri vengono utilizzati per regolare le letture, in modo che il sito di inserzione del trasposone è al centro di ogni lettura di sequenziamento.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Il risultato finale di questo protocollo è una libreria di ATAC-seq di in genere 3-20 ng / µ l. Quando eseguito su un sistema per l'analisi dell'integrità del DNA (Vedi Tabella dei materiali/attrezzature), essi mostrano la scala-come l'apparenza2 (Figura 3A). La dimensione media dei frammenti del DNA è in genere ~ 450-530 bp.

Controllo di qualità adeguata del...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Il protocollo di ATAC-seq descritto qui è stato impiegato con successo per l'analisi della cromatina accessibile in cellule primarie (umano Th1, Th2 cellule e cellule di B) così come le linee di cellule in coltura (cellule di cancro al seno umane MCF10A e U261 le cellule di glioblastoma). L'applicazione di ATAC-seq per altri tipi di cellule può richiedere alcune ottimizzazione dei protocolli, soprattutto nel passaggio lisi. Se la concentrazione del detergente non ionico è troppo alto, potrebbe trattarsi di una percentual...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è sostenuto dalla Fondazione di scienza di Israele (grant 748/14), Marie Curie integrazione concedere (CIG) - 7 ° PQ-persone-20013-CIG-618763 e programma del Planning e Budgeting Comitato e The Israel Science Foundation CORE concedere n. 41/11.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provette da 50 mLLumitronLUM-CFT011500-PPuò provenire da altri fornitori.
MicrotubiAxygen IncMCT-175-CPuò provenire da altri fornitori.
Pipette sierologiche da 25 ml CorningCostar4489Può provenire da altri fornitori.
Pallone per coltura tissutaleLumitronLUM-TCF-012-250-PPuò provenire da altri fornitori.
Contatore di cellule automatizzato CountesInvitrogenC10227
NucleoSpin TissueMACHEREY-NAGEL740952.5
Cellule mononucleate del sangue periferico ( PBMC)ATCC  PCS&timido; 800&timido; 011Può provenire da altri fornitori.
RPMI 1640 MediumBiological Industries01-103-1APuò provenire da altri fornitori.
Soluzione di L-Glutammina (200 mM)Biological Industries03-020-1BPuò provenire da altri fornitori.
Penicillina-StreptomicinaIndustrie Biologiche03-031-1BPuò provenire da altri fornitori.
Siero fetale bovino (FBS),  Industriebiologicheinattivato al calore 04-127-1Può provenire da altri fornitori.
Microsfere MACS CD4, umanoMiltenyi Biotec130-045-101
Colonne MACS MSMiltenyi Biotec130-042-201
Anti-Human CD4 FITCBiogems06121-50
Controllo dell'isotipo IgG1 di topo FITCBiogems44212-50
Anti-Human CD3 (OKT3)Tonbo biosciences40-0037
Anti-Human CD28 SAFIRE Biogems purificato10311-25
IL2 umano ricombinantePeprotech200-02
IL4 umano ricombinantePeprotech200-04
IL12 umano ricombinante p70Peprotech200-12
In vivo pronto anti-umano IL-4 (MP4-25D2)Tonbo40-7048
LEAF  IFN purificato anti-umano-γBioLegend506513
NaCl, grado analiticoCarlo Erba479687Può provenire da altri fornitori.
Cloruro di magnesio, esaidrato, grado di biologia molecolareCalbiochem442611Può provenire da altri fornitori.
EDTAMP Biomedicals800682Può provenire da altri fornitori.
Tris, ultra puro, puro al 99,9%MP Biomedicals819620Può provenire da altri fornitori.
Alternativa NP-40 (Nonylphenyl Polyethylene Glycol)Calbiochem492016Può provenire da altri fornitori.
Inibitori della proteasiSigmaP2714questo inibitore della proteasi coctail è una polvere. Per preparare 100 x soluzione diluire in 1 mL di acqua di biologia molecolare.
Perline magnetiche di immobilizzazione inversa in fase solida: Perline AMPure XP Kit diBeckman63881
HyLabsEX-GP200Può provenire da altri fornitori.
Kit di preparazione della libreria di DNA Nextera (trasposasi TDE1 e tampone TD)IlluminaFC-121-1030
NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master MixNew England BioLabsM0541
NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master MixNew England BioLabsM0543
SYBR Green I InvitrogenS7585
  CFX Connect PCR in tempo reale  Rilevamento  SistemaBio-rad185-5200Può provenire da altri fornitori.
Software CFX ManagerBio-rad1845000
master mix per qPCR: iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-rad172-5124Può provenire da altri fornitori.
Fluorimetro Qubit 2.0InvitrogenQ32866
Kit di analisi Qubit dsDNA HSInvitrogenQ32854
Magnete per provette eppendorfInvitrogen12321DPuò provenire da altri fornitori.
Centrifuga di raffreddamento a secchiello oscillante con i secchi per provette falcon da 15 mL e provette eppendorfThermo Scientific75004527Potrebbe provenire da altri fornitori. È importante che abbia secchi per le provette Eppendorf.
Thermo-shakerMRCPuò provenire da altri fornitori.
ScreenTape D1000 ad alta sensibilitàAgilent Technologies5067-5584
Reagenti D1000 ad alta sensibilitàAgilent Technologies5067-5585
Sistema TapeStation 4200Agilent TechnologiesG2991AAPiattaforma basata su nastro per elettroforesi
Kit DNA ad alta sensibilitàAgilent Technologies5067-4626Reagente per analisi TapeStation
Nome e sequenza del primerazienda
: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA
TCTACACTCGTCGGCAGCGTC
AGATGTG-3'IDT		Ad1-noMx: 5'-P5 sequenza-trasposasi sequenza-3'Ad2.1_TAAGGCGA
: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.1_expected sequenza indice leggere: 5'-P7 sequenza-[sequenza indice]-trasposasi sequenza-3'Ad2.2_CGTACTAG
: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.2_expected sequenza indice leggere: 5'-P7 sequenza-[sequenza indice]-trasposasi sequenza-3'
Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.3_expected sequenza indice read: 5'-P7 sequenza-[sequenza indice]-trasposasi sequenza-3'Ad2.4_TCCTGAGC
: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.4_expected sequenza indice read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposasi sequence-3'Ad2.5_GGACTCCT
: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG
CTCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.5_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposasi sequence-3'Ad2.6_TAGGCATG
: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.6_expected sequenza indice leggere: 5'-P7 sequenza-[sequenza indice]-trasposasi sequenza-3'Ad2.7_CTCTCTAC
: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[GTAGAGAG]GTCTCGTGGG
CTCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.7_expected sequenza indice leggere: 5'-P7 sequenza-[sequenza indice]-trasposasi sequenza-3'
Ad2.8_CAGAGAGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[CCTCTCTG]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.8_expected sequenza indice read: 5'-P7 sequenza-[sequenza indice]-trasposasi sequenza-3'Ad2.9_GCTACGCT
: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[AGCGTAGC]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.9_expected sequenza indice read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposasi sequence-3'Ad2.10_CGAGGCTG
: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG
AGAT[CAGCCTCG]GTCTCGTGG
GCTCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.10_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposasi sequence-3'Ad2.11_AAGAGGCA
: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG
AGAT[TGCCTCTT]GTCTCGTGGG
CTCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.11_expected sequenza indice read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposasi sequence-3'Ad2.12_GTAGAGGA
: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG
AGAT[TCCTCTAC]GTCTCGTGGG
CTCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.12_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.13_GTCGTGAT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[ATCACGAC]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.13_expected sequenza indice read: 5'-P7 sequenza-[sequenza indice]-trasposasi sequenza-3'Ad2.14_ACCACTGT
: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[ACAGTGGT]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.14_expected sequenza indice read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposasi sequence-3'Ad2.15_TGGATCTG
: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[CAGATCCA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.15_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposasi sequence-3'Ad2.16_CCGTTTGT
: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[ACAAACGG]GTCTCGTGGGC< br/> TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.16_expected sequenza indice leggere: 5'-P7 sequenza-[sequenza indice]-trasposasi sequenza-3'
  Ad2.17_TGCTGGGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[ACCCAGCA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.17_expected sequenza indice leggere: 5'-P7 sequenza-[sequenza indice]-trasposasi sequenza-3'
  Ad2.18_GAGGGGTT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[AACCCCTC]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.18_expected sequenza di indice read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transsposase sequence-3'Ad2.19_AGGTTGGG
: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[CCCAACCT]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.19_expected sequenza indice legge: 5'-P7 sequenza-[sequenza indice]-trasposasi sequenza-3'
  Ad2.20_GTGTGGTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[CACCACAC]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.20_expected sequenza indice read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposasi sequence-3'
  Ad2.21_TGGGTTTC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[GAAACCCA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.21_expected sequenza indice read: 5'-P7 sequenza-[sequenza indice]-trasposasi sequenza-3'Ad2.22_TGGTCACA
: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.22_expected sequenza indice read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposasi sequence-3'Ad2.23_TTGACCCT
: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.23_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'Ad2.24_CCACTCCT
: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGG
CTCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.24_expected sequenza indice read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'F1
: 5'-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3'IDT
R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3'IDT
F2: 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3'IDT
R2: 5'-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3'IDT
F3: 5'-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3'IDT
R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3'IDT
F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3'IDT
R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3'IDT
di grado europeo purificazione PCR ad alta sensibilità Ad1_noMX

Riferimenti

  1. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  2. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Curr Protoc Mol Biol. , 21.29.1-21.29.9 (2015).
  3. Thurman, R. E., Rynes, E., et al. The accessible chromatin landscape of the human genome. Nature. 489 (7414), 75-82 (2012).
  4. Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harb Protoc. (2), (2010).
  5. Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
  6. Cui, K., Zhao, K. Genome-Wide Approaches to Determining Nucleosome Occupancy in Metazoans Using MNase-Seq. Methods Mol Biol. 833, 413-419 (2012).
  7. Qu, K., et al. Individuality and Variation of Personal Regulomes in Primary Human T Cells. Cell Syst. 1 (1), 51-61 (2015).
  8. Scharer, C. D., et al. ATAC-seq on biobanked specimens defines a unique chromatin accessibility structure in naïve SLE B cells. Sci Rep. 6, 27030(2016).
  9. Sebé-Pedrós, A., et al. The Dynamic Regulatory Genome of Capsaspora and the Origin of Animal Multicellularity. Cell. 165 (5), 1224-1237 (2016).
  10. Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes. Nucleic Acids Res. 45 (6), e41(2016).
  11. Davie, K., et al. Discovery of Transcription Factors and Regulatory Regions Driving In Vivo Tumor Development by ATAC-seq and FAIRE-seq Open Chromatin Profiling. PLOS Genet. 11 (2), (2015).
  12. Villar, D., et al. Enhancer Evolution across 20 Mammalian Species. Cell. 160 (3), 554-566 (2015).
  13. Lara-Astiaso, D., et al. Chromatin state dynamics during blood formation. Science. 345 (6199), 943-949 (2014).
  14. Prescott, S. L., et al. Enhancer Divergence and cis-Regulatory Evolution in the Human and Chimp Neural Crest. Cell. 163 (1), 68-83 (2015).
  15. Wu, J., et al. The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos. Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).
  16. Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
  17. Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nat Genet. 48 (10), 1193-1203 (2016).
  18. Jenner, R. G., et al. The transcription factors T-bet and GATA-3 control alternative pathways of T-cell differentiation through a shared set of target genes. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (42), 17876-17881 (2009).
  19. DeAngelis, M. M., Wang, D. G., Hawkins, T. L. Solid-phase reversible immobilization for the isolation of PCR products. Nucleic Acids Res. 23 (22), 4742-4743 (1995).
  20. Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome Biol. 12 (2), R18(2011).
  21. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25(2009).
  22. Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  23. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  24. Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137(2008).
  25. Meyer, C. A., Shirley Liu, X. Identifying and mitigating bias in next-generation sequencing methods for chromatin biology. Nat Rev Genet. 15 (11), 709-721 (2014).
  26. He, H. H., et al. Refined DNase-seq protocol and data analysis reveals intrinsic bias in transcription factor footprint identification. Nat Methods. 11 (1), 73-78 (2013).
  27. Madrigal, P. On Accounting for Sequence-Specific Bias in Genome-Wide Chromatin Accessibility Experiments: Recent Advances and Contradictions. Front Bioeng Biotechnol. 3, 1-4 (2015).
  28. Qin, Q., et al. ChiLin: a comprehensive ChIP-seq and DNase-seq quality control and analysis pipeline. BMC Bioinformatics. 17 (1), (2016).
  29. Bao, X., et al. A novel ATAC-seq approach reveals lineage-specific reinforcement of the open chromatin landscape via cooperation between BAF and p63. Genome Biol. 16 (1), 284(2015).
  30. Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Accessibilit della cromatinalinfociti T primariisolamento dei nucleireazione di trasposizioneamplificazione della libreriamisure di controllo qualitanalisi di peak callingfase di purificazione del DNApurificazione con microsfere magnetiche

Articoli correlati