Questo protocollo descrive un metodo per iniettare DNA plasmidico in rene del mouse tramite la pelvi renale per produrre l'espressione del transgene in particolare nel rene.
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Articolo metodologico
Iniezione idrodinamica pelvi renale per Non virali espressione delle proteine nel rene
In questo articolo
Sommario
Abstract
Iniezione idrodinamica crea un ambiente locale, ad alta pressione di transfect vari tessuti con il DNA del plasmide ed altre sostanze. Iniezione della vena della coda idrodinamica, ad esempio, è un metodo ben stabilito che il fegato può essere transfected. Questo manoscritto descrive un'applicazione di principi idrodinamici per iniezione del rene del mouse direttamente con il DNA del plasmide per l'espressione genica del rene-specifica. Topi sono anestetizzati e rene è esposto da un'incisione del fianco seguita da una rapida iniezione di una soluzione contenente DNA plasmidico direttamente nella pelvi renale. L'ago è mantenuto sul posto per dieci secondi e il sito di incisione viene suturato. Il giorno seguente, immagini animali dal vivo, Western blot, o immunohistochemistry può essere usato per analisi di espressione genica o altri dosaggi adatti per il transgene di scelta vengono utilizzati per il rilevamento della proteina di interesse. Metodi pubblicati per prolungare l'espressione genica comprendono trattamento di integrazione e ciclofosfamide transgene transposon-mediata per inibire la risposta immunitaria per il transgene.
Introduzione
La tecnica di iniezione della vena della coda idrodinamica è diventato un modo comunemente usato per raggiungere elevati livelli di espressione genica nei mouse del fegato1,2. I reni sono anche trasfettati con questa tecnica ad un livello più basso, circa 100 volte meno3. L'iniezione idrodinamica pelvi renale descritto qui fornisce un modo semplice per controllare la specificità di espressione organo attraverso mezzi fisici utilizzando gli stessi principi idrodinamici che sono stati stabiliti in precedenza nel fegato4,5 , muscol....
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Protocollo
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dalle commissioni di utilizzo (IACUCs) del Baylor College of Medicine e Vanderbilt University Medical Center e istituzionali Animal Care.
1. preparare la soluzione di DNA per l'iniezione
- Selezionare il plasmid(s) per esprimere la transgene(s) attentamente per massimizzare le caratteristiche desiderabili per migliorare l'efficienza di trasfezione e l'espressione del transgene.
Nota: Iniezione idrodinamica pelvi renale di plasmidi per esprimere il marcatore fluorescente TdTomato, l'eritropoietina (Epo) di ormone e luciferasi firefly sono stati descritti in precedenza
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Risultati
La tecnica di iniezione e chirurgia sono semplici da eseguire una volta masterizzato, che non richiede grandi attrezzature o materiali costosi. Se nuovo in chirurgia renale incisione a fianco, una giornata di formazione su diversi topi prevista per l'eutanasia dovrebbe essere consentita in cui i topi non sono recuperata dopo chirurgia perché il primo tentativo di questo tipo di chirurgia può richiedere molto più tempo rispetto al normale. In alternativa, gli investigatori hanno familiari .......
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Discussione
In questo protocollo è descritto un metodo affidabile per la realizzazione di espressione genica riproducibile in particolare nel rene. Nelle mani di un chirurgo esperto moderatamente abbiamo trovato la percentuale dei topi transfettati con questa tecnica per essere nella gamma di 50-100%, a seconda dell'età del mouse e la sensibilità di lettura del transgene. Il livello di espressione di gene della luciferasi era sopra priorità bassa per parecchi mesi in topi che ricevono piggyBac trasposoni e completamente man.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla di divulgare e non dichiarare alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Il Career Development Award dal Department of Veterans Affairs [BX002797] supportati L.E.W. e il National Institutes of Health [R01-DK095867] e American Heart Association [15GRNT25700209] supportati J.C. Il National Institutes of Health [DK093660], Department of Veterans Affairs [BX002190] e centro del Vanderbilt per la malattia renale supportati M.H.W. Questo materiale è il risultato di lavoro sostenuto con risorse e utilizzo di servizi VA Tennessee Valley Healthcare System.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| AnaSed Xylazine | Patterson Veterinary | 07-808-1947 | Anestetico - Sostanza non controllata |
| BD Siringa da insulina 0,5 mL 29G 1/2 pollice | Cardinal Health | 309306 | Siringhe necessarie |
| Buprenex | Farmacista/Veterinario | Analgesia - Sostanza controllata | |
| Dynarex Telo per asciugamani monouso | Thermo Fisher Scientific | 19-310-671 | Posizionare sul termoforo |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Utilizzare solo DNA plasmidico privo di endotossine |
| Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Positive Control | Charles River | PC200 | Controllo positivo per il test delle endotossine |
| Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Single Test Vial | Charles River | R13500 | Test delle endotossine |
| Forbici per micro dissezione extra fini | Roboz Surgical Strumento | RS-5882 | Strumento chirurgico |
| Fisherbrand Busta di sterilizzazione a tenuta istantanea - 9" | Thermo Fisher Scientific | 01-812-51 | Per la sterilizzazione in autoclave degli strumenti chirurgici |
| Pompa di calore | Gaymar Paragon Medical | TP-700 | Pompa di calore a circolazione d'acqua |
| Germinatore 500 | Strumento chirurgico Roboz | DS-401 | Per riutilizzare gli strumenti chirurgici durante l'intervento |
| Graefe Pinze | Roboz Strumento chirurgico | RS-5136 | Strumento chirurgico |
| Graefe Tissue Pinze | Roboz Strumento chirurgico | RS-5153 | Strumento chirurgico |
| Halsey Needle Holder, 5" di lunghezza | Strumento chirurgico Roboz | RS-7841 | Strumento chirurgico |
| Cuscinetti termici - 15" x 21" - necessari almeno 3 | Paragon Medical | TP22G | Per l'uso con la pompa |
| di calore GaymarIsoFlo (Isoflurano, USP) | Abbott Animal Health | 5260-04-05 | Per l'imaging e l'eutanasia |
| Isotec Sistema di somministrazione di isoflurano Vaporizzatore | Smiths Medical | VCT3K2 | Per imaging ed eutanasia |
| Ketamina | Farmacista/Veterinario | Anestetico - Sostanza controllata | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Tessuti da laboratorio |
| Software Living Image | Caliper Life Sciences | Per l'imaging di animali vivi | |
| Luciferin | Perkin Elmer | 122796 Per l'imaging | di animali vivi |
| Spettrofotometro Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000-US-CAN | per la misurazione del DNA |
| Tamponi prevantics Thermo | Fisher Scientific | 23-100-110 | Per la preparazione alla chirurgia della pelle |
| Suture Prolene 5-0 Taper 30" | Thermo Fisher Scientific | NC0256891 | Suture non assorbibili per la pelle |
| Puralube Brand Opthalmic | Ungment Patterson Veterinary | 07-888-2572 | Per mantenere gli occhi umidi durante l'intervento chirurgico |
| Trans IT - QR Hydrodynamic Delivery Solution | Mirus Bio | MIR-5240 | Buffer di rilascio idrodinamico per diluire il DNA |
| Vicryl 5-0 Sutures J303H | Thermo Fisher Scientific | NC9816710 | Suture riassorbibili per lo strato muscolare |
| Wahl Mini Arco Clipper | Med-Vet International | 8787-1550 | Rasoio per la preparazione della pelle |
| Xenogen IVIS 200 | Caliper Life Sciences | Per l'imaging di animali vivi |
Riferimenti
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).
- Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in ....
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Ristampe e permessi
