Rilevazione di mutazioni Rare in CtDNA mediante sequenziamento di nuova generazione

Sommario

Questo manoscritto descrive una tecnica per la rilevazione di mutazioni di bassa frequenza in ctDNA, ER-segg. Questo metodo si differenzia per il suo uso unico di correzione degli errori di bi-direzionale, un fondo speciale filtro ed efficiente acquisizione molecolare.

Abstract

L'analisi del DNA del tumore (ctDNA) utilizzo di sequenziamento di nuova generazione (NGS) in circolo è diventata uno strumento prezioso per lo sviluppo di oncologia clinica. Tuttavia, l'applicazione di questo metodo è impegnativo a causa della sua bassa sensibilità nell'analizzare la quantità in tracce di ctDNA nel sangue. Inoltre, il metodo può generare risultati falsi positivi e negativi da questa analisi di sequenziamento e successiva. Per migliorare la fattibilità e l'affidabilità di rilevazione di ctDNA nella clinica, qui vi presentiamo una tecnica che arricchisce le mutazioni rare per il sequenziamento, arricchire rara mutazione sequenziamento (ER-Seq). ER-Seq può distinguere una singola mutazione fuori 1 x 10⁷ nucleotidi di selvaggio-tipo, che lo rende uno strumento promettente per rilevare le alterazioni genetiche di frequenza estremamente bassa e quindi sarà molto utile nello studio heterogenicity di malattia. In virtù della legatura dell'adattatore unico sequenziamento, questo metodo consente un recupero efficiente di molecole ctDNA, mentre presso lo stesso tempo per correggere errori in entrambe le direzioni (senso e antisenso). La nostra selezione di sonde 1021 kb arricchisce la misurazione delle regioni di destinazione che coprono oltre 95% delle mutazioni tumore-relativo driver in 12 tumori. Questo metodo economico e universale consente un accumulo in modo univoco successo dei dati genetici. Dopo il filtraggio efficiente errori in background, ER-seq può rilevare precisamente mutazioni rare. Utilizzando un caso di studio, presentiamo un protocollo dettagliato che dimostra sonda progettazione, la costruzione della libreria e metodologie di acquisizione del DNA bersaglio, mentre includendo anche il flusso di lavoro di analisi dei dati. Il processo per effettuare questo metodo in genere dura 1-2 giorni.

Introduzione

Sequenziamento di nuova generazione (NGS), un potente strumento per indagare i misteri del genoma, in grado di fornire una grande quantità di informazioni, che possono rivelare alterazioni genetiche. L'applicazione dell'analisi NGS in clinica è diventato più comune, soprattutto per la medicina personalizzata. Una delle limitazioni più grandi di NGS, tuttavia, è un alto tasso di errore. Sebbene sia ritenuto opportuno per studiare le mutazioni ereditate, l'analisi di mutazioni rare è notevolmente limitato^1,2, soprattutto quando l'analisi del DNA ottenuto da una "biopsia liquida".

Circ....

Protocollo

esemplari del tumore ed i campioni di sangue sono stati ottenuti secondo un protocollo approvato dal comitato etico di Pechino Università popolo ' s Hospital. Consenso informato è stato ottenuto dai pazienti di utilizzare i loro campioni. I partecipanti sono stati selezionati secondo i seguenti criteri: donna, avanzato Non a piccole cellule cancro ai polmoni, mutazione di EGFR p.L858R indicato dal precedente sequenziamento Sanger, progressione di malattia dopo due sessione di EGFR terapia con Erlotinib, mirata e ER-Seq, che è stato applicato a ctDNA per analizzare la causa della resistenza e trovare nuovi farmaci a bersaglio.

1. estrazi....

Risultati

Le sonde di 1021 kb regioni arricchiti di destinazione utilizzato nell'ER-Seq sono riportate nella tabella 1, che copre oltre il 95% delle mutazioni di gene in 12 tumori comuni. La vasta gamma di queste sonde rende questo processo applicabile alla maggior parte dei malati di cancro. Inoltre, nostro unico sequenziamento adattatori e lo screening basale database rendono possibile rilevare mutazioni rare precisamente.

Discussione

L'esistenza di circolazione del tumore DNA (ctDNA) è stato scoperto più di 30 anni fa, tuttavia l'applicazione di analisi di ctDNA è ancora non di routine nella pratica clinica. Interesse per l'applicazione pratica dei metodi di ctDNA sono aumentata con lo sviluppo di tecnologie per il rilevamento di ctDNA e analisi. Monitoraggio del tumore con ctDNA offre un approccio mini-invasivo per la valutazione della malattia residua microscopica, risposta alla terapia e profili molecolari del tumore sotto lo sfondo di tumore evol.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit per acidi nucleici circolanti QIAamp	Qiagen	55114	Estrazione di DNA da sangue periferico per cfDNA
Mini kit per sangue QIAamp DNA			Estrazione di DNA da sangue periferico per gDNA
Quant-iT dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	Q32854	Misura della concentrazione di cfDNA
Quant-iT dsDNA BR Assay Kit	Invitrogen	Q32853	Misura Concentrazione della libreria
Reagenti Agilent DNA 1000	Agilent	5067-1504	Misura del cfDNA e dei frammenti della libreria
Il NEBNext UltraII Kit di preparazione della libreria di DNA per la	preparazione della libreria	NEB	E7645L
Reagente Agencourt SPRIselect	Beckman	B23317	Screening e purificazione di frammenti di DNA
Tris-HCl (10 mM, pH 8,0)-100ML	Sigma	93283	dissoluzione
xGen Lockdown Sonde	IDT	— —	Sonda personalizzata xGen
Human Cot-1 DNA	Life	15279-011	Cattura mirata del DNA
Dynabeads M-270 Streptavidin	Life	65305	Cattura mirata del DNA
xGen Reagenti	di blocco IDT	1072281	Cattura mirata del DNA
KAPA HiFi HotStart ReadyMix	KAPA	KK2602	Librerie di arricchimento PCR post-cattura
KAPA Kit di quantificazione della libreria KAPA	KAPA	KK4602	Misura la concentrazione della libreria
NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cicli)	illumina	FC-404-2002	Sequence
Centrifuge5810	eppendorf	5810
Nanodrop8000	Thermo Scientific	8000	Misura la concentrazione di gDNA
Qubit 2.0	Invitrogen		Quantifica
Bioanalizzatore	Agilent 2100Agilent
ThermoMixer C	eppendorf		Incubazione
16 provette DynaMagTM-2 Magnete	Life	12321D
Concentratore plus	eppendorf
PCR	AB	simplyamp
QPCR	AB	7500Dx
NextSeq 500	illumina