Analisi della fagocitosi per le cellule apoptotiche in Drosophila Embrioni

Negli animali metazoi, ad es. Il nematode Caenorhabditis elegans , la mosca di frutta Drosophila melanogaster , e topi e umani, un gran numero di cellule subiscono apoptosi durante lo sviluppo per modellare i loro corpi e in età adulta per mantenere l'omeostasi ^{1 , 2} . Le cellule apoptotiche devono essere rapidamente rimosse perché inducono l'infiammazione nei tessuti circostanti liberando materiali intracellulari immunogenici se non completamente rimossi ³ . Al fine di facilitare la rimozione rapida, le cellule apoptotiche presentano i cosiddetti segnali alimentari riconosciuti dai recettori di engagement dei fagociti e vengono eliminati dalla fagocitosi ^{3 , 4 , 5 , 6} . Pertanto, la fagocitosi svolge un ruolo cruciale nel mantenimento dell'omeostasi ospite e, dunque, illustra la molecola Lar meccanismi alla base della fagocitosi delle cellule apoptotiche è di importanza.

I meccanismi responsabili della fagocitosi delle cellule apoptotici sembrano evoluzionalmente conservati tra le specie nei nematodi, mosche e topi ⁷ . Attualmente sono disponibili diversi dosaggi di fagocitosi per valutare l'ingrasso di cellule apoptotiche in questi animali modello. In C. elegans , 131 cellule somatiche subiscono una morte cellulare programmata durante lo sviluppo, ei cadaveri cellulari sono fagocitati dalle cellule vicine, che sono fagociti non professionali ⁸ . Quindi, contando il numero di restanti cellule di cellule in C. elegans indica il livello di fagocitosi in vivo . Cercando mutanti di nematodi che mostrano un numero crescente di cellule morte, sono stati identificati diversi geni richiesti per la fagocitosi e caratterizzati geneticamente da ^{9 , 10 ,}S = "xref"> 11 ^{, 12} .

I campioni di fagocitosi ex vivo con fagociti di coltura primaria, generalmente macrofagi, vengono spesso utilizzati nei topi. Le cellule apoptotiche vengono preparate utilizzando linee cellulari come le cellule Jurkat e sono mescolate con fagociti primari. Dopo un'incubazione per diverse ore, il numero totale di fagociti e fagociti inghiottiti vengono contati per valutare il livello della fagocitosi. Come una sofisticata modifica di questo metodo, il gruppo di Nagata ha sviluppato un test di fagocitosi ex vivo con le cellule che esprimono un ICAD resistente alla caspasi (inibitore della DNasi attivata da caspasi), in cui le cellule apoptotiche non subiscono la frammentazione del DNA apoptotica, ma il DNA è ancora ceduto quando Le cellule sono fagocitose. Quando queste cellule vengono utilizzate come obiettivi apoptotici in un dosaggio di fagocitosi, solo il DNA delle cellule apoptotiche inghiottite viene frammentato e macchiato mediante etichettatura TUTT-mediata di dUTP (TUNEL). Pertanto, la levaL di ingrasso cellulare apoptotico è misurato contando i segnali TUNEL in una miscela di fagociti e di cellule apoptotiche ¹³ .

In D. melanogaster , fagociti professionali chiamati emociti, macrofagi Drosophila , sono responsabili della fagocitosi delle cellule apoptotiche ^{14 , 15} . Oltre ai dosaggi di fagocitosi in vitro con linee di cellule di coltura, sono disponibili test di fagocitosi in vivo con tutti gli embrioni Drosophila . Gli embrioni di Drosophila sono un potente strumento per esaminare il livello di induzione di cellule apoptotiche perché molte cellule subiscono l'apoptosi e sono fagocitate da emociti durante lo sviluppo embrionale ^{14 , 15 , 16} . Un esempio di un test di fagocitosi in vivo è il metodo sviluppato dal gruppo di Franc. Nel loro metodo, gli emociti sono deTossicodipendente perossidasina, un marker emocitico, le cellule apoptotiche vengono colorate utilizzando il colorante nucleare, 7-amino actinomicina D negli embrioni interi Drosophila e il numero di cellule doppie positive viene contato come segnale di fagocitosi ¹⁷ . Un altro esempio di un test di fagocitosi sugli embrioni si basa sul concetto del metodo di Nagata descritto in precedenza; tuttavia, fagocitosi in vivo è valutata utilizzando gli embrioni di DCAD (Drosophila caspasi-attivato DNasi) mutante vola ^{18, 19.} Questi test di fagocitosi in vivo sono utili per osservare direttamente la fagocitosi in situ . Tuttavia, le difficoltà sono associate ad escludere ogni possibile polarizzazione nella fase di conteggio delle cellule fagocitose perché è difficile osservare tutti i fagociti e le cellule apoptotiche in embrioni interi a causa dello spessore.

Al fine di superare questa limitazione, ci sviluppiamoEd un nuovo dosaggio di fagocitosi negli embrioni di Drosophila . Nel nostro metodo, per poter facilmente contare gli emociti fagocitosi, tutti gli embrioni vengono omogeneizzati per preparare cellule embrionali disperse. I fagociti sono rilevati mediante l'immunostaining di un marker di fagocita e le cellule apoptotiche sono rilevate da TUNEL con queste cellule embrionali disperse. L'uso di cellule embrionali disperse ci permette di misurare i livelli di fagocitosi in vivo come se abbiamo effettuato un test di fagocitosi in vitro che precisamente quantifica il livello della fagocitosi. Tutti i genotipi di mosche possono essere impiegati in questo saggio se si sviluppano allo stadio 16 degli embrioni ²⁰ , lo stadio di sviluppo in cui la clearance delle cellule apoptotiche mediante la fagocitosi è la più abbondante. Questo metodo ha il vantaggio di valutare quantitativamente il livello della fagocitosi e, quindi, può contribuire all'identificazione di nuove molecole coinvolte nella fagocitosi delle cellule apoptotiche in vivo .

1. Preparazione

1. Preparazione di piatti di agar freschi di uva
   1. Aggiungere 100 ml di acqua a 4,4 g di agar e riscaldare la miscela in un forno a microonde per sciogliere l'agar.
   2. Aggiungere 80 ml di succo fresco di uva, 5 ml di acido acetico e 5 ml di etanolo alla soluzione agar.
   3. Versare circa 1,5 ml della soluzione con una pipetta su ogni vetretta di vetro e lasciarlo solidificare.
2. Preparazione di piastre da 6 cm di agarosio
   1. Aggiungere 50 ml di acqua a 0,5 g di agarosio e riscaldare la miscela in un forno a microonde per sciogliere l'agarosio.
   2. Versare circa 2,5 ml di soluzione agarosa su un piatto da 6 cm con una pipetta.

2. Stage 16 Embryo Collection

1. Raccogli le mosche adulte e aggiungete 200 femmine e 200 maschi in un tubo conico da 50 mL.
2. Mettere un piatto di agar di succo fresco di uva sul lievito nel tubo da 50 ml e chiudere con una spugna cap.
3. Incubare le mosche a 16 ° C in luce per 2 - 3 giorni. Cambiare la piastra una volta al giorno.
4. Spostare le mosche al buio a 25 ° C per 1 ora.
5. Cambiare la vecchia piastra in un nuovo senza lievito. Consentire alle mosche di gettare le uova per 2 ore.
6. Raccogliere la piastra e incubare a 16 ° C per 26 h.
7. Raccogliere gli embrioni dalla piastra con un pennello in 1 ml di PBS contenente 0,2% (v / v) Triton X-100.
8. Lavare due embrioni con 1 ml di PBS contenente 0,2% (v / v) Triton X-100.
9. Per rimuovere il corion, aggiungere 1,2 ml di soluzione di ipoclorito di sodio (2,2-3,4% Cl) agli embrioni per 3 min.
10. Lavare gli embrioni 4 volte con 1 ml di PBS contenente 0,2% (v / v) Triton X-100.
11. Posizionare gli embrioni sulle piastre di agarosio da piatto da 6 cm. Prendi gli embrioni di stadio 16 sotto un microscopio come descritto da Roberts ²⁰ . Raccogliere circa 50 embrioni in un tubo da 1,5 ml di test Treff con una micropipetta.

3. PrepaRazione delle cellule embrionali

1. Lavare due embrioni con 150 μl di PBS.
2. Omogeneizzare gli embrioni 30 volte in un tubo di micropiastra da 1,5 mL e mescolatore di pellet in presenza di 200 μl di collagenasi (0,25% (w / v)) in PBS.
3. Disperse le cellule embrionali pipettando 10 volte e spostare la sospensione cellulare in un tubo da 1,5 mL. Incubare le cellule a 37 ° C per 1 min in un bagno d'acqua. Ripetere due volte questo passaggio.
4. Aggiungere 800 μl di PBS alla sospensione cellulare e centrifugare a 1400 x g a 4 ° C per 5 min.
5. Rimuovere il surnatante e aggiungere 200 μL di tripsina (0,25% (w / v)) in PBS alle cellule. Disperse le cellule embrionali pipettando 50 volte.
6. Filtrare la sospensione cellulare con un filtro cellulare da 70 μm.
7. Per interrompere l'attività della tripsina, aggiungere alla sospensione cellulare delle cellule filtrate 40 μL di siero fetale bovato inattivato. Aggiungere 800 μl di PBS e centrifugare a 1.400 x g a 4 ° C per 5 min.
8. Rimuova la supernataNt, sospendere le cellule precipitate in 200 μl di PBS e centrifugare a 1400 x g a 4 ° C per 5 min.
9. Rimuovere il surnatante e sospendere le cellule precipitate in 30 μl di PBS.
10. Montare la sospensione cellulare preparata su diapositive in vetro con trietossisilano aminopropilico e aspettare per 10 - 15 minuti fino a quando le cellule si agganciano alle vetrate.
11. Rimuovere la soluzione rimanente sui vetrini di vetro con una pipetta. Montare 60 - 70 μL di PBS contenente 4% (w / v) PFA (paraformaldeide) sulle cellule per 10-15 minuti per la fissazione.
12. Rimuovere la soluzione di fissazione e posizionare le diapositive di vetro in PBS per più di 1 minuto.

4. La colorazione degli emociti

1. Immunostaining con un anticorpo anti-Croquemort
   1. Tamponi vetrari in metallo per 10 minuti in 10 minuti, in PBS contenente 0,2% (v / v) Triton X-100 per 10 minuti e poi in PBS per 10 minuti.
   2. Montare 20 μl di 5% (v / v) del siero di suini integrale contenuto in PBSNg 0,2% (v / v) Triton X-100 sulle cellule per il blocco. Incubare le diapositive a temperatura ambiente per 20 min.
   3. Rimuovere la soluzione da vetrate e montare 20 μl di antiserum anti-Croquemort ^{19 , 21} (0,1% (v / v) in PBS contenente 0,2% (v / v) Triton X-100 sulle cellule. Incubare le diapositive a 4 ° C per una notte.
   4. Immergere le diapositive in vetro in PBS contenenti 0,2% (v / v) Triton X-100 per 10 min 5 volte.
   5. Far scorrere le vetrate di vetro in PBS per 10 min.
   6. Montare 20 μL di IgG anti-rat (0,5% (v / v)) con PST contenente 0,2% (v / v) Triton X-100 e 5% (v / v) Temperatura per 1 h.
   7. Immergere le diapositive in vetro in PBS contenenti 0,2% (v / v) Triton X-100 per 10 min 5 volte.
   8. Immergere vetrini in tampone contenente 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl e 50 mM MgCl ₂ per 10 min.
   9. Montare la soluzione di substrato di fosfatasi contenente 0,23 mg / ml di 5-bromo-4cloro-3-indolil fosfato (BCIP), 0,35 mg / mL nitro blu tetrazolio (NBT), 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl ₂ sulle cellule.
   10. Osservare le cellule sotto un microscopio per una corretta colorazione. Quando i segnali violetti viola appaiono nei granuli degli emociti, rimuovere la soluzione di substrato e far scorrere le diapositive di vetro in tampone costituito da 10 mM Tris-HCl, pH 8,5 e 1 mM EDTA. Si consiglia di colorare per circa 5-10 minuti.
2. Immunostaining con un anticorpo anti-GFP (un'altra opzione per la colorazione degli emociti)
   1. Tamponi vetrini in metallo per 10 min, PBS contenente 0,2% (v / v) Triton X-100 per 10 minuti e PBS per 10 minuti.
   2. Montare 20 μl di siero di suini integrale del 5% (v / v) in PBS contenente 0,2% (v / v) Triton X-100 sulle cellule per il bloccaggio. Incubare le diapositive a temperatura ambiente per 20 min.
   3. Rimuovere la soluzione sulle vetrini di vetro e montare 20 μL dell'anticorpo anti-GFP del mouse (1% (v / v)) / PBS cCon 0,2% (v / v) di Triton X-100 sulle cellule. Incubare le diapositive a temperatura ambiente durante la notte.
   4. Immergere le diapositive in vetro in PBS contenenti 0,2% (v / v) Triton X-100 per 10 min 5 volte.
   5. Far scorrere le vetrate di vetro in PBS per 10 min.
   6. Montare 20 μL di IgG anti-mouse IgM (0,5% (v / v) eterografato con fosfatasi alcalina in PBS contenente 0,2% (v / v) Triton X-100 e 5% (v / v) Temperatura per 1 h.
   7. Immergere le diapositive in vetro in PBS contenenti 0,2% (v / v) Triton X-100 per 10 min 5 volte.
   8. Immergere vetrini in tampone costituito da 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl e 50 mM MgCl ₂ per 10 min.
   9. Montare la soluzione di substrato di fosfatasi contenente 0,23 mg / mL BCIP, 0,35 mg / ml NBT, 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl ₂ sulle cellule.
   10. Osservare le cellule sotto un microscopio per una corretta colorazione. Quando i segnali viola appaiono in emociti interi, rimuovere la soluzione del substrato e far scorrere le diapositive in tampone compostoDi 10 mM Tris-HCl, pH8.5 e 1 mM EDTA. Si consiglia di colorare per circa 10-15 minuti.

5. Staccare le cellule apoptotiche di TUNEL

1. Far scorrere le vetrate di vetro in PBS per 5 min.
2. Ripeti con il nuovo PBS.
3. Montare il buffer di equilibrazione (vedere tabella dei materiali) sulle cellule per 10 min.
4. Rimuovere la soluzione dalle vetrate e montare 20 μl di soluzione TdT contenente 5 μL di terminasi deossinucleotidil transferasi e 15 μl di Reaction Buffer sulle cellule a 37 ° C per 1 ora.
5. Rimuovere la soluzione da vetrate e immergere le diapositive in tampone composto da 0,5 mL di STOP / Wash buffer e 17 mL di acqua.
6. Immergere le diapositive in PBS per 5 min 3 volte.
7. Montare 20 μL di Anti-Digoxigenin-Peroxidase sulle cellule a temperatura ambiente per 30 min.
8. Far scorrere le vetrate di vetro in PBS per 5 min 4 volte.
9. Immergere le vetrate in soluzione di substrato perossidasi costituito da 30 mL di 50 mM Tris-HCl, contenente pH7,5Ga completa di spatola di 3,3'-diaminobenzidin-tetraidrichloruro (DAB) e di 0,002% (v / v) H ₂ O ₂ per 30 s.
10. Ripetere il passaggio 5.9 fino a quando le cellule apoptotiche sono colorate marrone. Far scivolare le vetrate in acqua per fermare la reazione della perossidasi.
11. Incollare le cellule con acqua per l'osservazione.

6. Misurare il livello di fagocitosi delle cellule apoptotiche

1. Osservare i campioni sotto un microscopio leggero per valutare il livello della fagocitosi. Contare le cellule positive di Croquemort o le cellule GFP positive come emociti, cellule TUNEL positive come cellule apoptotiche e doppie cellule positive come gli emociti fagocitosi.
2. L'indice fagocitico è definito come il numero di doppie cellule positive al numero totale di cellule Croquemort positive o cellule GFP positive. Si raccomanda di osservare più di 300 emociti.

Al fine di esaminare la fagocitosi delle cellule apoptotiche, gli embrioni Drosophila dello stadio di sviluppo sono stati raccolti e preparati come cellule disperse. Gli emociti, i macrofagi Drosophila , sono stati macchiati mediante immunocitochimica per il marcatore emocitario "Croquemort" 17 , 22 utilizzando un anticorpo specifico 19 , 21 e le cellule apoptotiche sono state macchiate da TUNEL in cellule embrionali disperse ( Figura 1A ). Croquemort, un recettore Drosophila correlato al CD36, è espressamente espresso in tutti gli emociti embrionali 22 e è stato dimostrato geneticamente di essere coinvolto nella clearance delle cellule apoptotiche negli embrioni Drosophila 17 . Le cellule Croquemort-positive hanno segnali viola nei piccoli granuli delle loro cellule. Le cellule positive di TUNEL mostrano abRown in corpi interi. Le cellule TUNEL-positive sono più piccole di altre cellule, e alcune sono all'interno delle cellule Croquemort positive, considerate cellule morte fagocitose. Tra le cellule croquemort positive e le cellule positive di TUNEL da 1 a 5% sono normalmente osservate in tutte le cellule embrionali tra 2 e 10%.

In Drosophila , ci sono due percorsi di segnalazione per l'ingrasso di cellule apoptotiche. Due recettori di fagocitosi per i corrispondenti percorsi, Draper e integrin α PS3 β ν, riconoscono in modo indipendente le cellule morte 19 , 21 , 23 , 24 , 25 . Draper è una proteina transmembrana che possiede sequenze atipiche di fattore di crescita epidermico (EGF) nella regione extracellulare ei due motivi fosforilabili NPxY e YxxL nel iParte ntracellulare 26 . L'integrin α PS3 β ν è anche un recettore transmembrane costituito da un eterodimero delle subunità α e β 25 . La Figura 1B mostra il rapporto di emociti fagocitosi con emociti totali in embrioni mutanti singoli o pruriti o con singola emarginazione Itgbn . Contando tutte le cellule Croquemort positive (emociti totali) e Croquemort e TUNEL (cellule positive positive), abbiamo calcolato l'indice fagocitico come il numero di emociti fagocitosi al numero totale di emociti. L'indice fagocitico era più basso nel mutante di drpr o Itgbn che nel tipo selvaggio, mentre il numero di emociti e cellule apoptotiche era simile ( Figura 1C- D ), indicando che questi due geni sono necessari per l'induzione di cellule apoptotiche, come precedentementeeported.

Quando non è disponibile un anticorpo anti-Croquemort o si esaminano linee mutanti con espressione alterata di Croquemort, dobbiamo selezionare un'altra opzione per rilevare gli emociti. Gli embrioni con un driver GAL4 controllato da un promotore specifico dell'emocito ( srpHemo-GAL4 ) e il gene GFP controllato da una sequenza di attivazione a monte (UAS) compreso il sito di legame GAL4 ( UAS-EGFP ), hanno emociti 27 , Che ci permette di individuare gli emociti utilizzando anti-GFP. La figura 2A mostra un'immagine ottenuta dopo la rilevazione di emociti e cellule apoptotiche con immunostaining utilizzando un anticorpo anti-GFP e TUNEL in cellule embrionali con srpHemo-GAL4UAS-EGFP . Mentre un anticorpo anti-Croquemort macchia piccoli granuli nelle cellule, un anticorpo anti-GFP macchia gli emociti interi. Simile alla figura 1A , 2 - 6% delle cellule positive GFP e del 1 - 5% TUNEL-positivo Le cellule sono osservate in tutte le cellule embrionali. Alcune cellule positive TUNEL vengono rilevate all'interno di cellule GFP positive, considerate cellule morte fagocitose. La rottura mediata da RNAi è facilmente applicata per valutare i geni per il loro coinvolgimento nella fagocitosi attraversando le mosche con l'UAS-dsRNA dei geni candidati con srpHemo-GAL4UAS-EGFP . La rottura di DRPR o Itgbn mediata da RNAi ha ridotto l'indice fagocitico ( Figura 2B ), mentre il numero di emociti e cellule apoptotiche nelle cellule embrionali è comparabile ( Figura 2C -2D ), indicando ancora che questi recettori di fagocitosi sono coinvolti nella fagocitosi di Cellule apoptotiche. Indici fagocitici simili sono ottenuti sia dai metodi di rilevazione dell'emocito, che suggeriscono che entrambi sono compatibili.

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Figura 1 : colorazione delle cellule embrionali da un anticorpo anti-Croquemort e TUNEL. ( A ) Immagini del campo luminoso delle cellule embrionali disperse dal ceppo 1118 mediante immunosorbimento con un anticorpo anti-Croquemort e TUNEL. Sono visualizzate viste ingrandite di cellule macchiate positivamente o negativamente rappresentate (top 4 pannelli) e un campo a bassa potenza (pannello inferiore). Barre di scala, 5 μm (in alto); 50 μm (in basso). ( B ) Il rapporto di emociti Croquemort positivi con il segnale TUNEL a tutti gli emociti Croquemort positivi nel mutante DRPR o Itgbn è stato analizzato con cellule embrionali disperse. ( C ) Il rapporto di emociti Croquemort positivi a tutte le cellule nel mutante DRPR o Itgbn è stato analizzato con cellule embrionali disperse. ( D ) Il rapporto tra cellule apoptotiche TUNEL-positive a tutte le cellule nel drpr oIl mutante Itgbn è stato analizzato con cellule embrionali disperse. I genotipi; W 1118 (controllo di tipo selvatico), drpr Δ5 (mutante drpr ) e Itgbn 2 (integrin β ν mutante). I dati erano rappresentativi di tre esperimenti indipendenti e sono stati analizzati dal test t dello studente. Circa 300 emociti Croquemort positivi sono stati osservati in ogni esperimento, ei valori rappresentano la media ± SD di tre campi microscopici. *; p <0,05, ns; Differenza non significativa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Colorazione delle cellule embrionali da AntI-GFP e TUNEL. ( A ) Immagini del campo luminoso delle cellule embrionali disperse del virus srpHemo-GAL4UAS-EGFP / + mediante immunostaining con un anticorpo anti-GFP e TUNEL. Sono visualizzate viste ingrandite di cellule macchiate positivamente o negativamente rappresentate (top 4 pannelli) e un campo a bassa potenza (pannello inferiore). Barre di scala = 5 μm (in alto); 50 μm (in basso). ( B ) Il rapporto di emociti GFP-positivi con il segnale TUNEL a tutti gli emociti GFP-positivi nelle moscelle di Rnoi -mediate di drpr o Itgbn è stato analizzato con cellule embrionali disperse. ( C ) Il rapporto di emociti GFP-positivi a tutte le cellule in RNAi-mediato moscompie mosche di drpr o Itgbn è stato analizzato con cellule embrionali disperse. ( D ) Il rapporto tra le cellule apoptotiche TUNEL-positive a tutte le cellule in mosca di ritiro RNAi-mediate di drpr o Itgbn è stato analizzato con cellule embrionali disperse. I genotipi; RNAi -: Yw / w; SrpHemo-GAL4 UAS-EGFP / + , RNAi drpr: yw / w; SrpHemo-GAL4 UAS-EGFP / +; UAS-drpr-IR / +, RNAi Itgbn : yw / w; SrpHemo-GAL4 UAS-EGFP / +; UAS-Itgbn-IR / + . I dati erano rappresentativi di tre esperimenti indipendenti e sono stati analizzati dal test t dello studente. Circa 300 GFP-positivi emociti sono stati osservati in ogni esperimento, ei valori rappresentano la media ± SD di tre campi microscopici. *; P <0,05, ns; Differenza non significativa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.