Questo protocollo descrive un metodo per la generazione di corticale Interneurone progenitori e precursori post-mitotici Interneurone da cellule staminali embrionali di topo usando un metodo modificato embryoid corpo-a-monostrato. Questi progenitori/precursori possono essere usati in vitro o fluorescente ordinati e trapiantate nel neocortex neonatale per lo studio della determinazione di destino o usati in applicazioni terapeutiche.
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Articolo metodologico
Differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in precursori Interneurone corticale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Corticali GABAergici sono una popolazione eterogenea di cellule che giocano un ruolo critico in che regolano l'uscita dei neuroni piramidali eccitatori, nonché la sincronizzazione le uscite dell'ensemble neurone piramidale. I deficit nella funzione Interneurone sono stati implicati in una varietà di disordini neuropsichiatrici, compreso la schizofrenia, autismo ed epilessia. La derivazione di interneuroni corticali da cellule staminali embrionali non solo consente lo studio del loro sviluppo e la funzione, ma fornisce la comprensione nei meccanismi molecolari alla base della patogenesi dei disordini corticali da Interneurone. Interneuroni hanno anche la notevole capacità di sopravvivere, migrare e integrare in host circuiti corticali post-trapianto, che li rende i candidati ideali per l'utilizzo nelle terapie basate sulle cellule. Qui, presentiamo un metodo corpo-a-monostrato embryoid scalabile, altamente efficiente, modificato per la derivazione di NKX 2.1-esprimendo Interneurone progenitori e loro progenie da cellule staminali embrionali di topo (mESCs). Utilizzando una linea di mESC reporter dual Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP, NKX 2.1 progenitori o loro progenie post-mitotici esprimenti Lhx6 può essere isolato tramite fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) e successivamente utilizzato in una serie di applicazioni a valle. Forniamo anche metodi per arricchire per parvalbumina (PV) o somatostatina sottogruppi di Interneurone (SST), che può essere utile per lo studio di aspetti della determinazione di destino o per l'uso in applicazioni terapeutiche che beneficerebbero Interneurone arricchita di sottogruppo trapianti.
Introduzione
In entrambi i topi e gli esseri umani, circa la metà di tutto corticale interneuroni inibitori (CIns) hanno origine all'interno di una struttura subcortical transitoria, conosciuta come l'eminenza gangliare mediale (MGE), dove i progenitori di neuroepithelial CIns e altri un neurone e glial sottogruppi esprimono il fattore di trascrizione NKX 2.11,2. Sottogruppi di CIn o sottotipi sono definiti da intersecanti morfologiche, neurochimici, elettrofisiologici e connettività caratteristiche3,4. Il CIns MGE-derivati possono essere raggruppati in sottogruppi....
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Protocollo
Nota: La linea di mESC dual reporter descritta in questo protocollo è disponibile su richiesta (sande@mail.med.upenn.edu).
1. Media preparazione
Nota: Caldo tutti i media a 37 ° C prima dell'uso nella coltura delle cellule.
-
Media dei fibroblasti embrionali del mouse (MEF) (per la preparazione di 500 mL)
- Aggiungere 50 mL di siero fetale bovino (FBS) 449 mL di Medium (DMEM dell'Aquila per volta) di Dulbecco e filtro attraverso un'unità filtrante poro di 500 mL 0,22 µm.
- Aggiungere agente antimicrobico 1 mL (50 mg/mL) dopo la filtrazione. Conservare i supporti a 4 ° C ....
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Risultati
Il protocollo descritto in questo documento è una versione modificata di nostri protocolli pubblicati15,16,17 ed è stato ottimizzato per l'uso con la nostra linea di dual-reporter mESC Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP. Aggiungendo l'inibitore di Wnt XAV-939 da DD0-5, combinato con ri-placcatura a DD8, raggiungiamo robusto NKX 2.1 induzione, in cui verso l'alto di 50% di tutti i nuclei DAPI + nella cultu.......
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Discussione
Mentre questo metodo è altamente efficace a patterning mESCs J1-derivato (SCRC-1010), abbiamo sperimentato successo variabile con altre linee di mescita e isolati clonali. Per esempio, Foxg1::venus mESCs (EB3-derivato; Dergano et al. 13) rispondono male a questo protocollo e Foxg1 induzione da DD12 è tipicamente dell'ordine di 1-2%. Per motivi che non comprendiamo pienamente, clone di Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP un altro reporter dual (chiamato JQ59) che è stato isolato simultaneamente come.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Siamo grati a Qing Xu per sviluppare il Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP dual reporter mESC linea così come Jennifer Tyson, Asif Maroof e Tim Petros per i loro primi lavori su aiutando a sviluppare questo protocollo. Ringraziamo anche il nucleo di cytometry di flusso CHOP per assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato da un NIH R01 MH066912 (SA) e F30 MH105045-02 (DT).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sistema di filtraggio sottovuoto per flaconi | Corning | CLS430769 | |
| Provetta con filtro cellulare Tappo a scatto | ThermoFisher | Corning 352235 | |
| Fibroblasti embrionali di topo (CF-1 MEF IRR 7M) | MTI-Globalstem | GSC-6101G | 1 fiala di 7M MEF è sufficiente per quattro piastre TC da 10 cm. Riferimenti: 29,35 |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Primocin | Invivogen | Ant-pm-2 | Conosciuto anche come agente antimicrobico. Non filtrare con i mezzi di base, aggiungerli dopo il filtraggio. Riferimenti: 9,11,36,37 |
| N2 supplement-B | Stemcell Technologies | 7156 | Non filtrare con i media di base -- aggiungi dopo la filtrazione |
| Glutamax (100x) | ThermoFisher | 35050061 | Conosciuto anche come L-alanina-L-glutammina. Riferimenti: 9,11,38,39 |
| Sostituzione del siero knockOut (KSR) | ThermoFisher | 10828028 | Conosciuto anche come integratore di terreno senza siero. Riferimenti: 9,11 |
| L-glutammina (100x) | ThermoFisher | 25030081 | |
| MEM-NEAA (100x) | ThermoFisher | 11140050 | |
| 2-Mercaptoetanolo | ThermoFisher | 21985023 | |
| KnockOut DMEM | ThermoFisher | 10829018 | Conosciuto anche come DMEM non contenente glutammina. Riferimenti: 9,11 |
| Hyclone FBS | VWR | 82013-578 | Conosciuto anche come FBS di grado di cellule staminali. Riferimenti: 9,11 |
| Piatto trattato con coltura tissutale (10cm) | BD Falcon | 353003 | |
| Piatto di Petri sterile non aderente (10cm) | VWR | 25384-342 | |
| Fattore inibitorio della leucemia (mLIF) | Chemicon | ESG1107 | Non congelare, conservare a 4'C. Riferimenti: 9,11 |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 11330032 | |
| 0,1% Soluzione di gelatina | ATCC | ATCC PCS-999-027 | |
| Laminina | Sigma | L2020 | |
| Poli-L-lisina | Sigma | P6282 | |
| Tripsina-EDTA (0,05%) | ThermoFisher | 25300054 | |
| Accutase | ThermoFisher | A1110501 | Conosciuto anche come reagente di dissociazione cellulare non contenente tripsina. Riferimenti: 9,11 |
| RQ1 DNase Promega | M610A | ||
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074 | Risospendere in DMSO e conservare a -80'C in aliquote monouso |
| XAV939 | Stemgent | 04-0046 | Risospendere in DMSO e conservare a -80'C in aliquote monouso |
| rhFGF-2 | R& D Systems | 233-FB | Resuspend in PBS con 0,1% BSA e conservare a -80'C in aliquote monouso |
| rhIGF-2 | R& D Systems | 291-G1 | Risospendere in PBS con 0,1% di BSA e conservare a -80'C in aliquote monouso |
| Inibitore ROCK (Y-27632) | Tocris | 1254 | Risospendere in DMSO e conservare a -80'C in aliquote monouso |
| Agonista levigato (SAG) | Millipore | 566660-1MG | Risospendere in H20 e conservare a -80'C in aliquote monouso |
| rm Sonic Hedgehog/SHH | R& D Systems | 464-SH-025 | Risospensione in PBS con 0,1% BSA e conservazione a -80'C in aliquote monouso |
| PKCζ Inibitore dello pseudosubstrato, | millipore EMD | 539624 | risospendere in H20 e conservare a -80'C in aliquote monouso |
Riferimenti
- Jones, E. G. The origins of cortical interneurons: mouse versus monkey and human. Cereb Cortex. 19, 1953-1956 (2009).
- Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 7 (6), 687-696....
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Ristampe e permessi
Tag
Differenziamento degli interneuroni corticaliprogenitori Nkx2.1Fluorescence Activated Cell Sortingmetodo dello strato singolo di corpi embrioidiarricchimento di interneuroni a parvalbuminasottogruppi di interneuroni a somatostatinalinea di mESC con doppio reporterprotocollo di trapianto cellularedeterminazione del destino neurale
