Differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in precursori Interneurone corticale

Summary

Questo protocollo descrive un metodo per la generazione di corticale Interneurone progenitori e precursori post-mitotici Interneurone da cellule staminali embrionali di topo usando un metodo modificato embryoid corpo-a-monostrato. Questi progenitori/precursori possono essere usati in vitro o fluorescente ordinati e trapiantate nel neocortex neonatale per lo studio della determinazione di destino o usati in applicazioni terapeutiche.

Abstract

Corticali GABAergici sono una popolazione eterogenea di cellule che giocano un ruolo critico in che regolano l'uscita dei neuroni piramidali eccitatori, nonché la sincronizzazione le uscite dell'ensemble neurone piramidale. I deficit nella funzione Interneurone sono stati implicati in una varietà di disordini neuropsichiatrici, compreso la schizofrenia, autismo ed epilessia. La derivazione di interneuroni corticali da cellule staminali embrionali non solo consente lo studio del loro sviluppo e la funzione, ma fornisce la comprensione nei meccanismi molecolari alla base della patogenesi dei disordini corticali da Interneurone. Interneuroni hanno anche la notevole capacità di sopravvivere, migrare e integrare in host circuiti corticali post-trapianto, che li rende i candidati ideali per l'utilizzo nelle terapie basate sulle cellule. Qui, presentiamo un metodo corpo-a-monostrato embryoid scalabile, altamente efficiente, modificato per la derivazione di NKX 2.1-esprimendo Interneurone progenitori e loro progenie da cellule staminali embrionali di topo (mESCs). Utilizzando una linea di mESC reporter dual Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP, NKX 2.1 progenitori o loro progenie post-mitotici esprimenti Lhx6 può essere isolato tramite fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) e successivamente utilizzato in una serie di applicazioni a valle. Forniamo anche metodi per arricchire per parvalbumina (PV) o somatostatina sottogruppi di Interneurone (SST), che può essere utile per lo studio di aspetti della determinazione di destino o per l'uso in applicazioni terapeutiche che beneficerebbero Interneurone arricchita di sottogruppo trapianti.

Introduction

In entrambi i topi e gli esseri umani, circa la metà di tutto corticale interneuroni inibitori (CIns) hanno origine all'interno di una struttura subcortical transitoria, conosciuta come l'eminenza gangliare mediale (MGE), dove i progenitori di neuroepithelial CIns e altri un neurone e glial sottogruppi esprimono il fattore di trascrizione NKX 2.1^1,2. Sottogruppi di CIn o sottotipi sono definiti da intersecanti morfologiche, neurochimici, elettrofisiologici e connettività caratteristiche^3,4. Il CIns MGE-derivati possono essere raggruppati in sottogruppi per lo più non sovrapposte basati sulla loro espressione di PV o SST, l'espressione di cui correla con particolare elettrofisiologici e connettività di tendenze⁵. Disfunzione di interneuroni, specialmente quelli nel sottogruppo PV, è stata implicata in più neuropsichiatrici disturbi e malattie^6,7. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di produrre cellule staminali derivate mitotici progenitori e precursori migratori arricchiti per destino o PV o CIn SST per studiare biologia Interneurone corticale e per uso in terapie basate sulle cellule.

Abbiamo sviluppato un metodo scalabile, altamente efficiente per la derivazione di NKX 2.1-esprimendo Interneurone progenitori e loro progenie da mESCs. Utilizzando un Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC linea⁸, NKX 2.1 progenitori o loro progenie post-mitotici esprimenti Lhx6 può essere isolato tramite FACS e successivamente utilizzato in una serie di applicazioni a valle. Manipolando un numero di vie di segnalazione, durata della cultura e la modalità della neurogenesi, possiamo ottenere milioni di precursori fluorescente contrassegnati Interneurone adatti per una miriade di applicazioni a valle.

Anche se esistono diversi altri metodi per la generazione di MGE-come progenitori da mESCs^{9,10,11,12,13,14}, il nostro metodo, che si basa su Wnt antagonista XAV-939, è particolarmente efficiente nella generazione Foxg1/NKX 2.1 cheesprimono telencefalici progenitori. Inoltre, la possibilità di selezionare per progenitori Interneurone o loro progenie che esprimono Lhx6 post-mitotici tramite il nostro sistema di dual reporter, migliora notevolmente la capacità di generare distinte dei progenitori e la loro progenie.

Protocol

Nota: La linea di mESC dual reporter descritta in questo protocollo è disponibile su richiesta (sande@mail.med.upenn.edu).

1. Media preparazione

Nota: Caldo tutti i media a 37 ° C prima dell'uso nella coltura delle cellule.

1. Media dei fibroblasti embrionali del mouse (MEF) (per la preparazione di 500 mL)
   1. Aggiungere 50 mL di siero fetale bovino (FBS) 449 mL di Medium (DMEM dell'Aquila per volta) di Dulbecco e filtro attraverso un'unità filtrante poro di 500 mL 0,22 µm.
   2. Aggiungere agente antimicrobico 1 mL (50 mg/mL) dopo la filtrazione. Conservare i supporti a 4 ° C per fino a 1 mese o aliquotare e conservare a ≤-20 ° C.
2. Media di N2 (per la preparazione di 500 mL)
   1. Aggiungere 5 mL L-alanina-L-Glutammina (100x) e 500 µ l 2-mercaptoetanolo (55 mM) a 489,5 mL DMEM: miscela nutriente F-12 (DMEM/F-12) e filtrare attraverso un'unità filtrante poro di 500 mL 0,22 µm.
   2. Aggiungere 1 mL agente antimicrobico (50 mg/mL) e 5 mL N2 supplemento-B dopo filtrazione. Conservare i supporti a 4 ° C al buio per 1 mese.
3. Terreno di coltura privo di siero (KSR) (per la preparazione di 500 mL)
   1. Aggiungere 75 mL integratore privo di siero medio, 5 mL L-Glutammina (100x), 5 mL MEM aminoacidi Non essenziali (MEM-NEAA) (100 x), e 500 µ l 2-mercaptoetanolo (55 mM) per mL 413,5 non-glutammina contenente DMEM e filtrare attraverso un'unità filtrante poro di 500 mL 0,22 µm.
   2. Aggiungere agente antimicrobico 1 mL (50 mg/mL) dopo la filtrazione. Conservare i supporti a 4 ° C per 1 mese.
4. Mouse sulle cellule staminali embrionali multimediale (per la preparazione di 500 mL)
   1. Aggiungere 75 mL cellule staminali FBS, 5 mL grado MEM-NEAA (100x), 5 mL L-Glutammina (100x), e 500 µ l 2-mercaptoetanolo (55 mM) per mL 413,5 non-glutammina contenente DMEM e filtrare attraverso un'unità filtrante poro di 500 mL 0,22 µm.
   2. Aggiungere agente antimicrobico 1 mL (50 mg/mL) dopo la filtrazione. Conservare i supporti a 4 ° C al buio per fino a 1 mese o aliquotare e conservare a ≤-20 ° C.

2. coltura mESCs

1. Piastra di cellule di alimentatore MEF mitotically inattive nei media MEF sulle piastre di coltura del tessuto trattato a 3-4 x 10⁴ cellule/cm². Consentire almeno 12 h per loro di stabilirsi in un'incubatrice di coltura cellulare a 37 ° C con ≥ 95% umidità relativa e 5% CO₂ prima il mESCs di placcatura. Se non utilizzato immediatamente, sostituire il supporto MEF ogni 3 giorni. Smaltire MEFs se non utilizzato entro 7 giorni di placcatura.
2. Aggiungere mESCs (gamma di densità da 1 a 4 x 10⁴ cellule/cm²) piastre MEF in mESC supporti contenenti il fattore inibitorio di leucemia del Mouse (mLIF) (1.000 U/mL). Incubare le cellule a 37 ° C con ≥ 95% umidità relativa e 5% CO₂.
3. Passaggio mESCs con tripsina-EDTA (0.05% tripsina) (1:5-1:10) una volta che il piatto diventa ~ 70-80% confluenti o se le colonie stanno cominciando a toccare. Questo in genere si verifica ogni 2 giorni, ma può richiedere fino a 4 o 5 giorni a seconda della densità di placcatura iniziale.
4. Mantenere il mESCs su uno strato dell'alimentatore MEF in mezzo mESC per mantenere la pluripotenza.
5. Prima di iniziare la differenziazione, passaggio delle cellule almeno una volta su piastre di gelatina rivestito senza MEFs di diluire fuori il MEFs.
   1. Preparare piastre rivestita di gelatina aggiungendo 0,1% gelatina in tampone fosfato salino (PBS) con Ca^{2 +}/Mg^{2 +} per un piatto di coltura di tessuti trattato e lasciando a 37 ° C per almeno 1 h. piastra 1,5-2 x piastra di 10⁶ cellule/10 cm (2.7-3.6 x 10⁴ cellule/cm²) e permettono alle cellule di espandere per 2 giorni prima dell'inizio di differenziazione.

3. differenziazione mESCs verso progenitori telencefalico MGE-come

1. Giorno di differenziazione (DD) 0 = "galleggiare le cellule"
   1. Dopo il mESCs sono cresciute piastre di gelatina rivestito per 2 giorni, i media di aspirare e lavare le cellule una volta con PBS senza Ca^{2 +}/Mg^{2 +}. Aggiungere sufficiente tripsina-EDTA (0.05% tripsina) per coprire la superficie della piastra (in genere 4 mL tripsina-EDTA per un piatto di coltura del tessuto di 10 cm) e inserire le celle in incubatore a 37 ° C con ≥ 95% umidità relativa e 5% CO₂ per 4 min.
   2. Dopo 4 min, placare la tripsina-EDTA utilizzando 2 volte il volume con mESC media. Trasferire le cellule in una provetta per centrifuga dimensioni appropriate e centrifugare le cellule a 200 x g per 5 min. Dopo 5 min, rimuovere il tubo ed aspirare i media senza disturbare il pellet. Risospendere il pellet in 1 mL di KSR:N2 media (1:1) contenente l'inibitore BMP LDN-193189 (250 nM) e l'inibitore di Wnt XAV-939 (10 µM).
   3. Misurare la concentrazione di cellule utilizzando un emocitometro o contatore di cellule automatizzato. Iniziano a crescere le cellule come corpi embryoid (EBs) con l'aggiunta di 75.000 cellule/mL in KSR:N2 media (1:1) che contengono LDN-193189 (250 nM) e XAV-939 (10 µM) in piastre di coltura del tessuto non aderente. Incubare le cellule a 37 ° C con ≥ 95% umidità relativa e 5% CO₂.
2. Il DD1, preparare per cella "sbarco" di rivestimento piatti di coltura di tessuti trattato con poli-L-lisina (10 µ g/mL in PBS con Ca^{2 +}/Mg^{2 +}) durante la notte (O/N) a 37 ° C con umidità relativa ≥ 95% o per almeno 1 h.
3. Il DD2, aspirare il poli-L-lisina e rivestire le piastre con laminina (10 µ g/mL in PBS con Ca^{2 +}/Mg^{2 +}) O/N a 37 ° C con umidità relativa ≥ 95%.
   Nota: Mentre O/N è ottimale, il poco quanto 2 h può essere sufficiente. Se le piastre non sono utilizzati dal giorno successivo, aspirare laminin, sostituire con PBS senza Ca^{2 +}/Mg^{2 +}e conservare a 4 ° C fino a 2 settimane.
4. DD3 ("cellule della terra")
   1. Prima di iniziare la dissociazione di EB, aspirare la laminina e lasciate le piastre completamente asciutto in un cappuccio di coltura del tessuto. Non utilizzare le piastre che appaiono visibilmente bagnato o lucido. Trasferire l'EBs con media in una provetta da 15 mL e centrifugare per 3-4 min 15 x g o fino a quando l'EBs hanno pellettati.
5. Aspirare i media e aggiungere 3 mL di soluzione di distacco delle cellule contenenti dnasi (2 U/mL) e incubare a 37 ° C con umidità relativa ≥ 95% e 5% CO₂ per 15 min. flick delicatamente il tubo ogni 3 min per facilitare la dissociazione di EB.
6. Una volta che l'EBs non sono visibili o sono trascorsi 15 minuti, aggiungere 6 mL KSR:N2 (1:1) contenente dnasi (1 U/mL) e centrifugare per 5 minuti a 200 x g.
7. Le cellule in KSR:N2 (1:1) contenente LDN-193189 del piatto (250 nM), XAV-939 (10 µM) e l'inibitore di roccia Y-27632 (10 µM) a 4,5-5 x 10⁴ cellule/cm².

4. SST-arricchendo protocollo: "DD12 GFP alta Sonic Hedgehog (SHH)" (seguito dal punto 3.7)

1. Il DD5, cambiare supporto con KSR:N2 (1:1) contenente FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) e SSH (50 ng/mL).
2. Preparare le piastre di coltura del tessuto per la ri-placcatura di il giorno 8 (punto 4.4) utilizzando le istruzioni descritte nei passaggi 3.2-3.3.
3. Il DD7, cambiare supporto con KSR:N2 (1:1) contenente FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) e SHH (50 ng/mL).
4. Il DD8, ri-piastra le cellule.
   Nota: Mentre questo passaggio non è indispensabile, ri-placcatura le cellule possa ridurre tipi cellulari primi dissociati, indesiderati. Anche re-placcatura rompe le palle delle cellule che complicano l'analisi di immunohistochemical a valle e aumenta l'efficienza di FACS intervalli di tempo successivi.
   1. A piastra delle cellule, staccare le cellule dalla piastra con tripsina-EDTA (0.05% tripsina) per 5 min a 37 ° C con ≥ 95% umidità relativa e 5% CO₂. Placare la tripsina-EDTA utilizzando 2 volte il volume con KSR:N2, e centrifugare a 200 x g per 5 min, filtrare le cellule attraverso un tubo filtro 40 µm per rimuovere eventuali grumi. Ri-piastra le celle alle 250.000 cellule/cm² N2/KSR (1:1) contenenti FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) e Y-27632 (10 µM) con SHH (50 ng/mL).
      Nota: Se invece, la decisione è presa non per ri-piastra le cellule su DD8, cambiare il supporto con KSR:N2 contenenti SHH (50 ng/mL) ogni 2 giorni da DD7 a DD12 e continuare ad aggiungere IGF-1 (20 ng/mL) e FGF-2 (10 ng/mL) fino al DD9.
5. Il DD10, cambiare il supporto con KSR:N2 contenenti SHH (50 ng/mL).
6. Il DD12, per ottenere cellule che sono arricchite per sottotipi di SST, utilizzare FACS per isolare Lhx6::GFP-solo che esprimono le cellule.
   1. Per staccare le cellule, utilizzare un reagente di cella-dissociazione contenente tripsina non anziché tripsina-EDTA. Lavare le cellule una volta con PBS senza Ca^{2 +}/Mg^{2 +}. Aggiungere il pre-riscaldato non-tripsina contenente cellule-dissociazione reagente contenente dnasi (2 U/mL) per le cellule. Metterli in incubatore a 37 ° C con ≥ 95% umidità relativa e 5% CO₂ per 10-30 minuti o fino a quando le cellule hanno staccato. Picchiettare delicatamente le piastre ogni 5 min per facilitare la dissociazione.
      Nota: Per culture DD11-12, può essere necessario solo 10-15 min. Per le culture di DD15-16, 30 min o più può essere richiesto per dissociazione completa.
   2. Una volta che le cellule hanno completamente tolto la piastra, procedere all'isolamento di FACS utilizzando protocolli standard o utilizzare le celle in altre analisi a valle.

5. PV-arricchendo protocollo: "mCherry DD11/DD17 + aPKCi" (seguito dal punto 3.7)

1. Il DD5, cambiare i supporti con KSR:N2 (1:1) contenenti il FGF-2 (10 ng/mL) e di IGF-1 (20 ng/mL).
2. Preparare le piastre di coltura del tessuto per ri-placcatura su DD8 (punto 4.4) utilizzando le istruzioni descritte in precedenti 3.2-3.3.
3. Il DD7, cambiare i supporti con KSR:N2 (1:1) contenenti il FGF-2 (10 ng/mL) e di IGF-1 (20 ng/mL).
4. Il DD8, ri-piastra le celle come descritto al punto 4.4 con le seguenti eccezioni: quando ri-placcatura le cellule, sostituire SHH con agonista levigato (SAG; 30 nM) e aggiungere atipica inibitore PKC (aPKCi; 2 µM). Presi insieme, i ri-doratura media è ora N2/KSR (1:1) contenente FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), Y-27632 (10 µM), SAG (30 nM) e aPKCi (2 µM).
5. Il DD10, cambiare il supporto con KSR:N2 contenenti aPKCi (2 µM).
6. DD11
   Nota: A questo punto, le cellule Nkx2.1::mCherry+ sono arricchite per diventare CIns PV.
   1. Staccare le cellule dal piatto per FACS usando lo stesso protocollo descritto al punto 4.6. Se la decisione è presa per raccogliere le cellule Nkx2.1::mCherry+ in un giorno più tardi di differenziazione, ignorare questo passaggio.
7. Il DD12, cambiare il supporto con KSR:N2 contenenti aPKCi (2 µM). Il DD14, cambiare il supporto con KSR:N2 contenenti aPKCi (2 µM). Il DD16, cambiare il supporto con KSR:N2 contenenti aPKCi (2 µM). Il DD17, raccogliere le cellule di Nkx2.1::mCherry+ usando lo stesso protocollo descritto al punto 4.6.

6. PV-arricchendo protocollo: "DD17 mCherry basso SHH" (seguito dal punto 3.7)

1. Il DD5, cambiare i supporti con KSR:N2 (1:1) contenenti il FGF-2 (10 ng/mL) e di IGF-1 (20 ng/mL). Il DD7, cambiare i supporti con KSR:N2 (1:1) contenenti il FGF-2 (10 ng/mL) e di IGF-1 (20 ng/mL).
2. Il DD9, cambiare il supporto con KSR:N2 (1:1). Da questo punto in poi, ulteriori fattori di crescita non sono necessari.
   1. Continuare a modificare i media ogni 2 giorni fino a raccolta le cellule su DD17.

Results

Il protocollo descritto in questo documento è una versione modificata di nostri protocolli pubblicati^15,16,17 ed è stato ottimizzato per l'uso con la nostra linea di dual-reporter mESC Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP. Aggiungendo l'inibitore di Wnt XAV-939 da DD0-5, combinato con ri-placcatura a DD8, raggiungiamo robusto NKX 2.1 induzione, in cui verso l'alto di 50% di tutti i nuclei DAPI + nella cultu...

Discussion

Mentre questo metodo è altamente efficace a patterning mESCs J1-derivato (SCRC-1010), abbiamo sperimentato successo variabile con altre linee di mescita e isolati clonali. Per esempio, Foxg1::venus mESCs (EB3-derivato; Dergano et al. ¹³) rispondono male a questo protocollo e Foxg1 induzione da DD12 è tipicamente dell'ordine di 1-2%. Per motivi che non comprendiamo pienamente, clone di Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP un altro reporter dual (chiamato JQ59) che è stato isolato simultaneamente come...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema di filtraggio sottovuoto per flaconi	Corning	CLS430769
Provetta con filtro cellulare Tappo a scatto	ThermoFisher	Corning 352235
Fibroblasti embrionali di topo (CF-1 MEF IRR 7M)	MTI-Globalstem	GSC-6101G	1 fiala di 7M MEF è sufficiente per quattro piastre TC da 10 cm. Riferimenti: 29,35
FBS	Atlanta Biologicals	S11150H
Primocin	Invivogen	Ant-pm-2	Conosciuto anche come agente antimicrobico. Non filtrare con i mezzi di base, aggiungerli dopo il filtraggio. Riferimenti: 9,11,36,37
N2 supplement-B	Stemcell Technologies	7156	Non filtrare con i media di base -- aggiungi dopo la filtrazione
Glutamax (100x)	ThermoFisher	35050061	Conosciuto anche come L-alanina-L-glutammina. Riferimenti: 9,11,38,39
Sostituzione del siero knockOut (KSR)	ThermoFisher	10828028	Conosciuto anche come integratore di terreno senza siero. Riferimenti: 9,11
L-glutammina (100x)	ThermoFisher	25030081
MEM-NEAA (100x)	ThermoFisher	11140050
2-Mercaptoetanolo	ThermoFisher	21985023
KnockOut DMEM	ThermoFisher	10829018	Conosciuto anche come DMEM non contenente glutammina. Riferimenti: 9,11
Hyclone FBS	VWR	82013-578	Conosciuto anche come FBS di grado di cellule staminali. Riferimenti: 9,11
Piatto trattato con coltura tissutale (10cm)	BD Falcon	353003
Piatto di Petri sterile non aderente (10cm)	VWR	25384-342
Fattore inibitorio della leucemia (mLIF)	Chemicon	ESG1107	Non congelare, conservare a 4'C. Riferimenti: 9,11
DMEM/F12	ThermoFisher	11330032
0,1% Soluzione di gelatina	ATCC	ATCC PCS-999-027
Laminina	Sigma	L2020
Poli-L-lisina	Sigma	P6282
Tripsina-EDTA (0,05%)	ThermoFisher	25300054
Accutase	ThermoFisher	A1110501	Conosciuto anche come reagente di dissociazione cellulare non contenente tripsina. Riferimenti: 9,11
RQ1 DNase Promega		M610A
LDN-193189	Stemgent	04-0074	Risospendere in DMSO e conservare a -80'C in aliquote monouso
XAV939	Stemgent	04-0046	Risospendere in DMSO e conservare a -80'C in aliquote monouso
rhFGF-2	R& D Systems	233-FB	Resuspend in PBS con 0,1% BSA e conservare a -80'C in aliquote monouso
rhIGF-2	R& D Systems	291-G1	Risospendere in PBS con 0,1% di BSA e conservare a -80'C in aliquote monouso
Inibitore ROCK (Y-27632)	Tocris	1254	Risospendere in DMSO e conservare a -80'C in aliquote monouso
Agonista levigato (SAG)	Millipore	566660-1MG	Risospendere in H20 e conservare a -80'C in aliquote monouso
rm Sonic Hedgehog/SHH	R& D Systems	464-SH-025	Risospensione in PBS con 0,1% BSA e conservazione a -80'C in aliquote monouso
PKCζ Inibitore dello pseudosubstrato,	millipore EMD	539624	risospendere in H20 e conservare a -80'C in aliquote monouso