In questo studio, presentiamo una procedura semplice ed efficace per valutare la rottura della barriera sangue - cervello sotto circostanze neurodegenerative. Per raggiungere il nostro obiettivo, abbiamo infuso isotiocianato di fluorescina di alto peso molecolare etichettato (FITC)-albumina in giugulare del mouse della vena e valutate le perdite nel parenchima cerebrale mediante microscopia a fluorescenza.
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Articolo metodologico
Valutazione della permeabilità della barriera emato - encefalica dall'infusione endovenosa di albumina FITC-labeled in un modello murino di malattia di Neurodegenerative
In questo articolo
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Sommario
Abstract
Rottura dell'integrità della barriera emato - encefalica (BBB) è una caratteristica comune per le diverse malattie neurologiche e neurodegenerative. Anche se l'interazione tra perturbato BBB omeostasi e la patogenesi dei disordini del cervello ha bisogno di ulteriori indagini, lo sviluppo e la convalida di una procedura affidabile per rilevare con precisione la barriera ematoencefalica può essere cruciale e rappresentano uno strumento utile per la predizione potenzialmente malattia progressione e lo sviluppo di mirate strategie terapeutiche.
Qui, presentiamo una procedura semplice ed efficace per valutare la perdita BBB in condizioni neurodegenerative come quello che accade in un modello murino preclinico di malattia di Huntington, in cui i difetti della permeabilità della BBB sono chiaramente rilevabili precocemente in la malattia. In particolare, l'alto peso molecolare isotiocianato di fluorescina etichettato (FITC)-albumina, che è in grado di attraversare la BBB solo quando quest'ultima è compromessa, viene acutamente infusa di una vena giugulare del mouse e la sua distribuzione nei distretti vascolari o parenchimatici è quindi determinata da microscopia di fluorescenza.
Accumulo di verde fluorescente-albumina nel parenchima del cervello funziona come un indice di permeabilità BBB aberrante e, quando quantificati utilizzando software di elaborazione immagine J, viene segnalato come l'intensità di fluorescenza verde.
Introduzione
Omeostasi all'interno del sistema nervoso centrale (SNC) è un prerequisito per la corretta comunicazione e la funzione delle cellule neuronali. Il parenchima CNS è ermeticamente sigillato dalla periferia con l'endoteliale emato - encefalica (BBB), che rappresenta l'interfaccia tra il cervello e il flusso sanguigno periferico e svolge un ruolo fondamentale nel cross-talk tra questi due distretti1 ,2. La BBB è un complesso e dinamico struttura tridimensionale composta principalmente di micro-nave endothelial cellule specializzate (ECs) collegate tra loro attraverso i complessi giunzionali intercellulari - giunzioni strette (TJs) - e circondati da periciti, neurone terminazioni e astrociti piede processi1,2.
In condizioni fisiologiche, la bassissima permeabilità della BBB intatta assicura la severa regolamentazione del trasporto di sostanze nutritive e di altre molecole dentro e fuori il cervello e fornisce il sistema nervoso centrale con un'unica protezione dai cambiamenti che si verificano nella composizione del sangue che potrebbe influenzare l'attività neurale e contro potenziale periferico insulti1,2,3.
Rottura della BBB l'integrità e la sua permeabilità migliorata lungamente è stata conosciuta per costituire una caratteristica fondamentale per molti neurologiche e neurodegenerative disturbi4 compreso la malattia di Huntington (HD)5,6, tuttavia , se una tale disfunzione è un fenomeno causativo o un evento propagativo nel corso della malattia è ancora poco chiaro. I tempi di crisi di BBB anche resta sfuggenti, tuttavia, dal nostro gruppo ed altri la prova emergente indica che perturbato BBB integrità non rappresenta un evento ritardato nella progressione di malattia, ma piuttosto un punto iniziale6,7 , 8, che può avere conseguenze a lungo termine.
Con questo in mente, è importante rivelare precocemente ripartizione BBB nella neurodegenerazione al fine di sviluppare strategie utili per predire la progressione della malattia e del danno cerebrale e sviluppare interventi alternativi e più mirati in grado di correttamente mitigare le conseguenze cliniche di tali una perturbazione. Formazione immagine affidabile di danno BBB è, pertanto, di grande importanza nella ricerca sperimentale e gestione clinica delle malattie del cervello.
In questo articolo, descriviamo una procedura semplice e di successo per la valutazione della permeabilità BBB in un modello di topo HD utilizzando l'alto peso molecolare della fluorescina isotiocianato etichettati-albumina (FITC-albumina). Stravaso di FITC-albumina, che normalmente non può attraversare la barriera, nel parenchima del cervello è stato misurato come indice di dispersione BBB. Questa tecnica è facilmente adattabile ai ratti e ad altre condizioni patologiche caratterizzate da cerebrovasculature danno9,10.
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Protocollo
tutte le procedure sugli animali sono state approvate da IRCCS Neuromed Animal Care Review Board e " Istituto Superiore di Sanità " (permettere numero: 1163/2015-PR) e sono stati in conformità degli orientamenti dell'UE direttiva 2010 / 63/EU per gli esperimenti sugli animali.
1. preparazione della soluzione di FITC-albumina deve essere iniettato in vena giugulare
Nota: tutti gli esperimenti sono stati controllo trasportato in manifesti topi HD R6/2 (11 - vecchio settimana) e in età e genere-abbinato wild-type (WT) littermates.
- Sciogliere FITC-albumina polvere (Vedi Tabella materiali) in tampone fosfato salino (PBS) 10 mg/ml.
Nota: Per risultati ottimali, questo dovrebbe essere preparato fresco per ogni reazione etichettatura.
2. Preparazione delle attrezzature per essere utilizzato durante la chirurgia
- stendere gli strumenti chirurgici precedentemente sterilizzati nell'autoclave (Vedi Tabella materiali).
- Pulire la panchina chirurgica con alcool (soluzione di etanolo 70%). Preparare l'area chirurgica (45 x 45 cm) con un telo chirurgico sterile monouso asciugamano e impostare lo stereomicroscopio operativo.
3. Procedura chirurgica per FITC-albumina infusione nella vena giugulare
- registrare il peso del corpo del mouse per anestesia.
- Anesthetize mouse con un'iniezione intraperitoneale (i. p) di una dose adeguata di ketamina (100 mg/kg) - soluzione xilazina (10 mg/kg).
- Monitor sedazione animale di pizzico di delicata punta ritirare riflesso come dimostrato in Walantus et al. 11 , 12.
- posizionare il mouse anestetizzato in posizione supina di scoperte e fissare i quattro zampe e la coda sul banco di lavoro chirurgico con nastro adesivo.
- Dopo che il mouse è assicurato, attentamente radere il margine chirurgico appropriato sul collo con un rasoio elettrico (Vedi Tabella materiali) e disinfettarlo con povidone-iodio soluzione e 70% di etanolo.
- a secco la superficie esposta rasata con tamponi di cotone.
- Delicatamente tirare la pelle rasata e fare un'incisione longitudinale lungo 1,5 cm, di bisturi, nell'emiclaveare linea inizia a metà strada sul torace e si estende per appena sotto il collo.
- Con molta cautela tirare parte del tessuto connettivo con forcipe sotto osservazione al microscopio (ingrandimento 5x) per esporre la vena giugulare esterna.
- Garantire un sufficiente spazio sulla destra e sulla sinistra della vena giugulare per facilitare l'inserimento dell'ago per l'infusione della soluzione FITC-albumina 30½ G.
- Iniettare per via endovenosa l'animale (a destra della vena giugulare) lentamente (più di 3 minuti) con 100 µ l di 10 mL/kg FITC-albumina utilizzando l'ago 30½ G.
- Dopo 15 minuti, eutanasia il mouse per decapitazione, rapidamente rimuovere il cervello dal cranio come descritto in precedenza 13 e immergerlo per 15 min in almeno 10 volte il volume del cervello stesso di pre-refrigerato isopentano.
- Spostare l'isopentano congelato il cervello in una provetta pre-refrigerata e memorizzarlo in un congelatore a-80 ° C fino al sezionamento istologico.
4. Istologica di sezionamento del cervello infuso con FITC-albumina
- Embed congelato il cervello in temperatura di taglio ottimale (OCT) composto (vedere la Tabella materiali) prima criostato sezionamento.
- In Serie tagliato il cervello in 20 sezioni spesse µm, con un criostato (Vedi Tabella materiali) e montarli su vetrini microscopio.
- Eseguire la FITC-albumina/laminin co-colorazione utilizzando uno specifico anticorpo anti-laminina (Vedi tabella materiali) come precedentemente descritto 6.
- Brevemente, incubare sezioni con l'anticorpo primario anti-laminina (pAb 1: 1000) tutta la notte e procedere con appropriato anticorpo secondario coniugato di Cy3.
- Vetrino coprioggetto diapositive con mezzo di montaggio contenente 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (picco di assorbimento = 360 nm; picco di emissione = 460 nm (Vedi Tabella materiali).
- Lasciare la diapositiva per asciugare durante la notte a 4 ° C al buio.
- Osservare la fluorescenza macchiatura sotto un microscopio a fluorescenza (Vedi Tabella materiali) a 20 ingrandimenti dotato di entrambi FITC (picco di assorbimento = 495 nm; picco di emissione = 525 nm) e filtri Cy3 (picco di assorbimento = 550 nm; emissione picco = 570 nm).
- Per visualizzare i campioni immediatamente dopo la colorazione, fissare il vetrino coprioggetto agli angoli utilizzando smalto ed esaminarli al microscopio come sopra (4.3.3).
5. Impostazione del microscopio di fluorescenza e acquisizione di immagini a colori
- impostare il microscopio a fluorescenza come segue.
- Accendere la lampada fluorescenza circa 10 minuti prima dell'uso. Accendere il microscopio, il computer collegato e la fotocamera digitale. Eseguire il software di analisi di immagine (Vedi Tabella materiali).
- Utilizzare l'obiettivo appropriato per la raccolta ottimale del segnale e risoluzione spaziale e selezionare filtri appropriati.
- Acquisizione di immagini a colori
- selezionare il comando [live] sul software di analisi di immagine (Vedi Tabella materiali) e impostare i parametri di illuminazione ottimale per ogni filtro.
- Selezionare il comando [freeze] per prendere l'immagine di colore singolo canale e aggiungere la barra della scala (' Edit > masterizzare scala ')
- Salvare ogni immagine nella '. TIFF ' formato.
- Unire i canali in una singola immagine selezionando ' File > Merge canale ' e salvarlo nella
- tiff ' formato.
- Acquisire un minimo di quattro venti-quattro bit colore immagini (2200 µm x 3400 µm) per fetta di cervello (6 sezioni per vetrino).
6. Valutazione di FITC-albumina stravaso
- analizzare l'intensità di fluorescenza per ogni singolo canale tramite le liberamente disponibile ImageJ 14 , 15.
- Normalizzare l'intensità del segnale fluorescente totale di FITC-albumina dall'intensità fluorescente CY3-laminina totale per ogni immagine e segnalare l'albumina travasato fuori i vasi come intensità di fluorescenza verde.
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Risultati
Infusione corretta di FITC-albumina nel vena giugulare produce lo stravaso del tracciante fluorescenza verde dal flusso sanguigno nel cervello parenchymawhen che BBB è compromessa6. In condizioni fisiologiche, la distribuzione di albumina fluorescente infuso è consentita all'interno dei vasi sanguigni del cervello e non è rilevabile alcun segnale nel parenchima circostante di zona e/o cervello perivascolare (Figura 1A, micrografie sul ...
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Discussione
La tecnica che descriviamo qui è utile principalmente per la rilevazione di perdite BBB in condizioni di malattia del cervello. Disfunzione BBB sta guadagnando l'attenzione come una caratteristica comune di diversi disordini neurologici4. In precedenza abbiamo utilizzato questo approccio per descrivere il derangement precoce dell'integrità BBB in un modello murino di una malattia neurodegenerativa rara come HD6.
Questo metodo si avvale della rela...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse di divulgare
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da "Fondazione Neuromed" e finanziato dal Ministero italiano della salute "Ricerca Corrente" di V.M.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Albumina-fluorescina isotiocianato conjiugate | SIGMA | A9771-100MG | |
| pAb anti-Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | |
| CY3 anti-coniglio fatto in capra | MILLIPORE | AP132 | |
| SUPERFROST PLUS | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Vetrini di copertura 24 X 50 mm | Thermo Scientific (DIAPATH) | 61050 | |
| Kilik Optimal Cutting Temperature (OCT) composto | Bio Optica | 05-9801 | |
| VECTASHIELD Supporti di montaggio | VECTOR | H-1500 | Mezzi di montaggio con |
| DAPI iNSu/Light Siringa monouso per insulina | RAYS Salute e Sicurezza | INS1ML26G13 | |
| 30G 1/2 " | BD Microlance | 304000 | Ago per insulina monouso Siringa |
| Manico bisturi | F.S.T.91003-12 | ||
| #22 Monouso Bisturi | Bis F.S.T. | 10022-00 | |
| Forbici per iride fine 10,5 cm | F.S.T. | 14094-11 | |
| Pinza Dumont #5745 45° 0.10 x 0.06 mm | F.S.T. | 11251-35 | |
| Graefe Pinze 10 cm | F.S.T. | 11051-10 | |
| Pinza Dumont #5 0,1 X 0,06 mm | F.S.T. | 11251-20 | |
| Cerotto medico | Medicalis | 34788 | |
| Telo asciugamano monouso sterile | Dispotech | TVO50VE | |
| Microscopio stereoscopico | NIKON | SMZ 745 T | |
| Illuminatore ottico Luce LED (C-FLED2) | Illuminatore ottico NIKON | 1003167 | per microscopio stereoscopico |
| Eclipse Ni-U | Microscopio Nikon | 932162 | Microscopio a epifluorescenza Microscopio |
| digitale | Nikon | DS-Ri2 | Fotocamera per microscopio |
| Intenslight | Nikon | C-HGFI | Lampada per microscopio |
| NIS-Elements 64 bit | Nikon | AR 4.40.00 | Software di analisi |
| Rasoio elettrico | Gemei | GM-3007 |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease
Posted by JoVE Editors on 11/10/2017. Citeable Link.
An erratum was issued for: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease. One of the author's names was corrected from:
Maglione Vittorio
to:
Vittorio Maglione
