Articolo metodologico

Flusso di lavoro basato sulla combinazione di tracciante isotopico esperimenti per studiare il metabolismo microbico di più fonti di nutrienti

DOI:

10.3791/56393

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22 gennaio 2018

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1UMR SPO, INRA, SupAgroM, Université de Montpellier, 2IWBT Stellenbosch University, 3PILI, Toulouse White Biotechnology

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive una procedura sperimentale per in modo completo e quantitativamente studiare il metabolismo di più fonti di nutrienti. Questo flusso di lavoro, basato su una combinazione di tracciante isotopico esperimenti e una procedura analitica, permette il destino dei nutrienti consumati e l'origine metabolica delle molecole sintetizzate da microrganismi deve essere determinato.

Abstract

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Studi nel campo della microbiologia si basano sull'attuazione di una vasta gamma di metodologie. In particolare, lo sviluppo di metodi appropriati sostanzialmente contribuisce a fornire una vasta conoscenza del metabolismo dei microrganismi crescono in media chimicamente definite che contengono azoto unico e fonti di carbonio. Al contrario, la gestione attraverso il metabolismo di più fonti di nutrienti, nonostante la loro ampia presenza in ambienti naturali o industriali, rimane praticamente inesplorata. Questa situazione è dovuto principalmente alla mancanza di metodologie, che ostacola le indagini.

Segnaliamo una strategia sperimentale in modo completo e quantitativamente esplorare come metabolismo opera quando una sostanza nutriente è fornito come una miscela di molecole diverse, vale a dire, una risorsa complessa. Qui, descriviamo la sua applicazione per valutare il partizionamento di molteplici fonti di azoto attraverso la rete metabolica di lievito. Il flusso di lavoro combina le informazioni ottenute durante gli esperimenti di tracciante isotopo stabile utilizzando selezionati 13C - o 15N-etichettati substrati. In primo luogo è costituito da fermentazioni parallele e riproducibile sullo stesso supporto, che include una miscela di molecole contenenti N; Tuttavia, una fonte di azoto selezionato è etichettata ogni volta. Una combinazione di procedure analitiche (HPLC, GC-MS) è implementata per valutare i modelli di etichettatura di composti mirati e per quantificare il consumo e il recupero dei substrati in altri metaboliti. Un'analisi integrata del dataset completo fornisce una panoramica del destino di substrati consumati all'interno delle cellule. Questo approccio richiede un preciso protocollo per la raccolta di campioni – agevolato da un sistema di robot-assistita per il monitoraggio online delle fermentazioni – e il raggiungimento di numerose analisi che richiede tempo. Nonostante questi vincoli, essa ha consentito di comprendere, per la prima volta, il partizionamento di molteplici fonti di azoto in tutta la rete metabolica di lievito. Abbiamo determinato le origini metaboliche di molecole volatili e gli aminoacidi proteinogenici e delucidato la ridistribuzione di azoto da fonti più abbondanti verso altri N-composti.

Introduzione

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Intesa come opera di metabolismo microbico è una questione chiave per la progettazione di strategie efficienti per migliorare i processi di fermentazione e modulano la produzione di composti fermentativi. I progressi nella genomica e genomica funzionale in questi ultimi due decenni in gran parte contribuito ad estendere la conoscenza della topologia delle reti metaboliche in molti microrganismi. Accesso a queste informazioni hanno portato allo sviluppo di approcci che mirano per una panoramica completa della funzione cellulare1. Queste metodologie si basano spesso su un'interpretazione basata su modello di parametri misurabili. Questi dati sper....

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Protocollo

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1. fermentazione e campionamento

  1. Preparazione dei media e fermentatori
    Nota: Tutte le fermentazioni vengono svolte in parallelo, utilizzando lo stesso sforzo e nello stesso chimicamente definite mezzo sintetico (SM, composizione indicati nella tabella 1), che include una miscela di ammonio e gli aminoacidi come fonti di azoto15. Per ogni fermentazione, un composto unico azoto viene fornito esclusivamente in un uniformemente con etichetta 13C o 15N modulo (100%), mentre gli altri rimangono senza etichetta. Per ogni fonte di azoto con etichetta utilizzata nel set di esperimenti....

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Risultati

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Figura 3 presenta un diagramma schematico del flusso di lavoro che è stato implementato per studiare la gestione da lievito delle molteplici sorgenti di azoto che si trovano durante la fermentazione del vino.
Per i diversi punti di campionamento, le caratteristiche di parametri – crescita biologica, modelli di consumo di azoto e il profilo di aminoacidi proteinogenici – Visualizza un'elevata riproducibilità tra fermentazioni (Figura 4<.......

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Discussione

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Quantificare il partizionamento di composti attraverso reti metaboliche mediante esperimenti di tracciante isotopico è un promettente approccio per capire il funzionamento del metabolismo microbico. Questa metodologia, mentre applicato con successo con uno o due substrati con etichettati, attualmente non può essere implementata per studiare il metabolismo di varie fonti utilizzando multipli con etichettati elementali isotopi (cioè, più di due substrati). Infatti, le tecniche analitiche disponibili consentono la .......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Grazie a Jean-Roch Mouret, Sylvie Dequin e Jean-Marie Sabalyrolles per aver contribuito alla concezione del sistema robot-assistita fermentazione e Martine Pradal, Nicolas Bouvier e Pascale Brial per il loro supporto tecnico. Finanziamento per questo progetto è stato fornito dal Ministère de l'Education Nationale, de la Recherche et de la Technologie.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
D-glucosioPanReac141341.0416
D-fruttosioPanReac142728.0416
Acido DL-malicoSigma AldrichM0875
Acido citrico monoidratoSigma AldrichC7129
Fosfato di potassio monobasicoSigma AldrichP5379
Solfato di potassioSigma AldrichP0772
Solfato di magnesio eptaidratoSigma Aldrich230391
Cloruro di calcio diidratoSigma AldrichC7902
Cloruro di sodioSigma AldrichS9625
Cloruro di ammonioSigma AldrichA4514
Idrossido di sodioSigma Aldrich71690
Solfato di manganese monoidratoSigma AldrichM7634
Solfato di zinco eptaidratoSigma AldrichZ4750
Solfato di rame (II) pentaidratoSigma AldrichC7631
Iodio di potassioSigma AldrichP4286
Cloruro di cobalto (II) esaidratoSigma AldrichC3169
Acido boricoSigma AldrichB7660
Eptamolibdato di ammonioSigma AldrichA7302
Mio-inositoloSigma AldrichI5125
D-Acido pantotenico sale emicalcicoSigmaAldrich 21210
Tiamina, cloridratoSigma AldrichT4625
Acido nicotinicoSigma AldrichN4126
PiridossinaSigma AldrichP5669
BiotinaSigma AldrichB4501
Ergosté rolSigma AldrichE6510
Tween 80Sigma AldrichP1754
Etanolo assolutoVWR Chemicals101074F
Cloruro di ferro (III) esaidratoSigma Aldrich236489
Acido L-asparticoSigma AldrichA9256
Acido L-glutammicoSigma AldrichG1251
L-AlaninaSigma AldrichA7627
L-ArgininaSigma AldrichA5006
L-CisteinaSigma AldrichC7352
L-GlutamminaSigma AldrichG3126
GlicinaSigma AldrichG7126
L-IstidinaSigma AldrichH8000
L-IsoleucinaSigma AldrichI2752
L-LeucinaSigma AldrichL8000
L-LisinaSigma AldrichL5501
L-MetioninaSigma AldrichM9625
L-FenilalaninaSigma AldrichP2126
L-ProlinaSigmaAldrich P0380
L-SerinaSigma AldrichS4500
L-treoninaSigma AldrichT8625
L-triptofanoSigma AldrichT0254
L-tirosinaSigma AldrichT3754
L-valinaSigma AldrichV0500
13C5-L-valinaEurisotopCLM-2249-H-0.25
13C6-L-LeucinaEurisotopCLM-2262-H-0.25
15N-Cloruro di ammonioEurisotopNLM-467-1
ALPHA-15N-L-GlutamminaEurisotopNLM-1016-1
U-15N4-L-ArgininaEurisotopNLM-396-PK
Acetato di etileSigma Aldrich
Propanato di etileSigma Aldrich112305
2-metilpropanato di etileSigma Aldrich246085
Butanoato di etileSigma AldrichE15701
2-metilbutanoato di etileSigma Aldrich306886
3-metilbutanoato di etileSigma Aldrich8.08541.0250
Esanoato di etileSigma Aldrich148962
Ottanoato di etileSigma AldrichW244910
Decanoato di etileSigma AldrichW243205
Dodecanoato di etileSigma AldrichW244112
Lattato di etileSigma AldrichW244015
Dietil succinatoSigma Aldrich
acetato di 2-metilpropileSigma AldrichW217514
acetato di 2-metilbutileSigma AldrichW364401
acetato di 3-metilbutileSigma Aldrich287725
acetato di 2-feniletilSigma Aldrich290580
2-metilpropanoloSigma Aldrich294829
2- metilbutanoloSigma Aldrich133051
3-metilbutanoloSigma Aldrich309435
EsanoloSigma Aldrich128570
2-feniletanoloSigma Aldrich77861
Acido propanoicoSigma Aldrich94425
Acido butanoicoSigma Aldrich19215
Acido 2-metilpropanoicoSigma Aldrich58360
Acido 2-metilbutanoicoSigma Aldrich193070
Acido 3-metilbutanoicoSigma AldrichW310212
Acido esanoicoSigma Aldrich153745
Acido ottanoicoSigma AldrichW279900
Acido decanoicoSigma AldrichW236403
Acido dodecanoicoSigma AldrichL556
Fermentatore 1LLegallaisAT1357Fermentatore fatto a mano per fermentazione
Sistema di filtrazione sottovuoto monousoDominique Deutscher029311
Fermentatori (250 ml)LegallaisAT1352Fermentatore fatto a mano per fermentazione
Tubi steriliSarstedt62.554.502
Serrature di fermentazioneLegallaisAT1356Serrature di fermentazione fatte a mano per la fermentazione
BactoYeast ExtractBecton, Dickinson and Company212750
BactoPeptoneBecton, Dickinson and Company211677
Agitatore perincubatore Infors HT
Particle CounterBeckman Coulter6605697Multisizer 3 Coulter Counter
CentrifugeJouanGR412
Plate Butler Sistema roboticoServizi di laboratorio BVPF0X-MAStrumento automatico
Software per maggiordomo a piastreServizi di laboratorio BVSoftware di monitoraggio robot
RobViewSoftware di calcolo sviluppato internamente
My SQLDatabase di fonti internazionali
Cimarec i Telesystem Agitatori multipuntoThermo Fisher Scientific50088009String Drive 60
BenchBlotter piattaforma rockerDutscher60903
Kit enzimatico ammoniacaR-Biopharm AG5390
Spettrofotometro cuvetteVWR634-0678
Spettrofotometro UviLine 9400Secomam
Aminoacidi standard fisiologici - acidi e neutriSigma AldrichA6407
Aminoacidi standard fisiologici - nozioni di baseSigma AldrichA6282
Citrato tamponi litio - Reagente ultra ninidrinaBiochromBC80-6000-06
Acido solfosalicilicoSigma AldrichS2130
NorleucinaSigma AldrichN1398
Biochrom 30 AAABiochrom
EZChromElite BiochromSoftware di controllo dello strumento e analisi dei dati
Resina Ultropac 8 LitioBiochromBC80-6002-47Filtro a colonna fisiologica ad alta risoluzione al litio
Millex GVMerck MilliporeSLGVX13NLMillex GV 13mm (dimensione dei pori 0,22 &; micro; m)
Filtro a membrana PALL VWR514-4157Supor-450 47mm 0.45µ m
Pompa a vuoto Millivac MiniMilliporeXF5423050
Piatto di pesatura liscio in alluminio 70mmVWR611-1380
Bilancia di precisioneMettlerSpecifiche AE163
Dimetilsolfossido essiccatoMerck1029310161(max. 0,025% H2O) SeccoSolv
Forno a combustioneLegallais
Kit per il dosaggio delle proteine Pierce BCAInterchimUP40840A
Acido formicoFluka94318
Perossido di idrogenoSigma AldrichH1009
Acido cloridrico fumante 37% EmsureMerck1003171000Grado ACS, ISO, Reag. Ph Eur
Tampone acetato di litioBiochrom80-2038-10
Soluzione commerciale di amminoacidi idrolizzatiSigma AldrichAAS18
L-Metionina sulfoneSigma AldrichM0876
Acido L-cisteico monoidratoSigma Aldrich30170
Provette per coltura in vetro PyrexSigma AldrichZ653586
PiridinaAcros Organics13178050099% Extrapuro
Etil cloroformiatoSigma Aldrich23131
DiclorometanoSigma Aldrich32222
FialeSigma Aldrich854165
Microinserti per fiale da 1,5 mlSigma AldrichSU860066
GC/MSAgilent Technologies5890 GC/5973 MS
ChemstationAgilent TechnologiesSoftware per il controllo e l'analisi dei dati
MethanolSigma Aldrich34860Chromasolv, per HPLC
AcetonitrileSigma Aldrich34998ChromasolvPlus, per HPLC
N,N-Dimetilformammide dimetil acetaleSigma Aldrich394963
Colonna BSTFASigma Aldrich33024
DB-17MSAgilent Technologies122-473130m*0,25mm*0,15µ m
Solfato di sodio, anidroSigma Aldrich238597
Azoto tecnicoProdotti per l'aria14629
Colonna Zebron ZB-WAXPhenomenex7HG-G007-1130m*0.25mm*0.25µ m
Helium BIPAir products26699
Pipette in vetro PasteurVWR612-1702
270989W237701

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Osterlund, T., Nookaew, I., Nielsen, J. Fifteen years of large scale metabolic modeling of yeast: developments and impacts. Biotechnol Adv. 30, 979-988 (2012).
  2. Gombert, A. K., Moreirados Santos, M., Christensen, B., Nielsen, J.

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Isotopic Tracer ExperimentsMicrobial MetabolismNitrogen Source PartitioningYeast Metabolic NetworkStable Isotope LabelingParallel FermentationsHPLC GC MS AnalysisRobot Assisted MonitoringAmino Acid AnalysisVolatile Molecule Quantification

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