Articolo metodologico

Amplificazione dell'obiettivo delle cellule pre-arricchimento e intero genoma per singola cella a valle caratterizzazione

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DOI:

10.3791/56394

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15 maggio 2018

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1Institute of Cell Biology, Histology and Embryology, Medical University of Graz, 2Institute of Pathology, Medical University of Graz, 3Fraunhofer Institute for Toxicology and Experimental Medicine ITEM, 4Department of Tumor Biology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 5Sahlgrenska Cancer Center, University of Gothenburg

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo è quello di recuperare e preparare cellule bersaglio rara da una miscela con cellule non-bersaglio della priorità bassa per la caratterizzazione genetica molecolare a livello di singola cellula. Qualità del DNA è uguale a cellule singole non trattata e permette per cella singola applicazione (entrambi screening basato e analisi mirate).

Abstract

Cellule bersaglio raro possono essere isolate da un fondo elevato di cellule non-bersaglio utilizzando anticorpi specifici per proteine di superficie delle cellule bersaglio. Un metodo sviluppato di recente utilizza un filo medico funzionalizzato con anticorpi di molecola (EpCAM) di adesione delle cellule anti-epiteliale per isolamento in vivo di circolazione del tumore le cellule (CTCs)1. Una coorte di paziente-abbinato nel carcinoma della prostata non metastatico ha mostrato che la tecnica di isolamento in vivo ha provocato una percentuale maggiore di pazienti positivi per CTCs, come pure i conteggi del CTC superiori rispetto la parità aurea corrente nell'enumerazione CTC. Come le cellule non possono essere recuperate da dispositivi medici attuali, un nuovo filo funzionalizzato (denominato dispositivo) è stato prodotto da trattamento enzimatico che consente la cattura e successiva separazione delle cellule. Le cellule possono collegare al dispositivo, visualizzati su un microscopio e staccato mediante trattamento enzimatico. Le cellule recuperate sono citocentrifugate sui vetrini rivestite con membrana e raccolgono individualmente mediante microdissezione laser o micromanipolazione. Cella singola campioni vengono sottoposti all'amplificazione di cella singola intero genoma permettendo analisi multipla a valle, inclusi gli approcci di screening e mirate. La procedura di isolamento e di recupero produce alta qualità del DNA da cellule singole e non altera l'amplificazione successiva intero genoma (WGA). DNA amplificato di una singola cellula può essere inoltrato allo screening e/o analisi come l'ibridazione comparativa del genoma di matrice (array-CGH) o sequenziamento mirate. Il dispositivo consente l'isolamento ex vivo da campioni di cellule rare artificiale (cioè 500 cellule bersaglio a spillo in 5 mL di sangue periferico). Considerando che i tassi di distacco delle cellule sono accettabili (50-90%), il tasso di recupero delle cellule indipendente sui vetrini riguardano una vasta gamma dipenda sulla linea cellulare utilizzata (< 10 - > 50%) e necessita di qualche ulteriore attenzione. Questo dispositivo non viene cancellato per l'uso in pazienti.

Introduzione

Recentemente, CellCollector DC01, un filo medico funzionalizzato con anticorpi anti-EpCAM per isolare CTCs da sangue periferico di pazienti di cancro, è stato aggiunto alla gamma metodico di CTC enumerazione1,2,3 . In uno studio attualmente in corso nel carcinoma della prostata non metastatico, questo filo funzionalizzato segnala quasi due volte altrettanti pazienti CTC-positivi e CTC superiore conta nei pazienti di CTC-positivi rispetto ai CellSearch, il gold standard nella enumerazione CTC3 . A causa di questa performance incoraggia, isolamento di cellule da un filo medica funzionalizzato per cella singola analisi sarebbe auspicabile, ma trattamento enzimatico con soluzioni di distacco delle cellule (ad es. tripsina) né microdissezione laser permette il recupero di cellule intatte (dati non mostrati).

Per consentire il distacco delle cellule catturati, una nuova generazione di fili funzionalizzati era dotata di un polimero specifico. Questo polimero, che collega gli anticorpi di cattura al filo, è suscettibile di un trattamento di buffer di rilascio che permette il distacco delle cellule intatte (CellCollector DC03 noto come dispositivo). Il nuovo dispositivo funzionalizzato, consente l'isolamento delle cellule bersaglio da varie concentrazioni delle cellule di linea delle cellule tumorali a spillo in albumina di siero bovino (BSA) / tampone fosfato salino (PBS) e nel sangue periferico, rispettivamente.

Per facilitare il riconoscimento visivo delle cellule sul dispositivo e dopo il recupero, le cellule tumorali bersaglio sono munite di carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) e una macchia di DNA prima del trattamento di recupero (cioè. ricarica e disconnessione). Effetti del trattamento sulla qualità di DNA di singole cellule precedentemente sono stati valutati dopo WGA tramite un controllo di qualità PCR4,5, array-CGH6,7 e mirati sequenziamento7 non risultati nessuna differenza rispetto a cellule non trattate micromanipulated da cella sospensioni7. Il vantaggio di questo metodo è la combinazione di pre-arricchimento rara cella di destinazione e il recupero delle cellule per l'analisi a valle di singola cellula (Figura 1). Il dispositivo di raccolta marchio CE in vivo corrente è generalmente utilizzato per l'enumerazione di CTCs, piuttosto che per la caratterizzazione molecolare di cella singola2,8. Tuttavia, analisi più completa per indagare eterogeneità tra CTCs lungo per analisi a livello di singola cellula (cioè mirati sequenzializzate a livello di singola cellula). Altri metodi basati su cellule si basano sull'isolamento immunomagnetica di CTCs EpCAM-positivi e cella singola gestione basata sulla dielettroforesi per successive analisi genetica molecolare9,10. Caratterizzazione molecolare di CTCs è un requisito importante per la loro attuazione utili in una regolazione clinica ed è altrettanto importante nella ricerca di base della cascata metastatica. In parallelo CTCs, circolanti tumore DNA (ctDNA) è diventato di grande importanza in quanto permette l'analisi del DNA del carico del tumore con isolamento tecnico minimo procedure11,12. Gli approcci di cella basata potrebbero servire come un contributo complementare in quanto consente di RNA13,14 e proteina15 analisi di espressione e anche per CTC derivata cell culture o xenotrapianti16, 17. anche se ostacoli come recupero basso delle cellule e lo spazio per l'uso in pazienti devono ancora essere superate, il metodo di cattura e rilascio compie un importante passo successivo verso la caratterizzazione delle cellule bersaglio rara.

Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate dal comitato etico dell'Università medica di Graz (25-240 ex 12/13). Sangue periferico per chiodare esperimenti è stata campionata da individui sani.

Nota: Questo protocollo descrive l'isolamento delle cellule HT-29 (umano linea cellulare del cancro del colon) da PBS o da miscele artificiali di cellule HT-29 e nel sangue periferico. Lo stesso esperimento è stato effettuato con due linee di cellule supplementari (LNCaP e VCaP, dati sperimentali nei risultati di rappresentante) e teoricamente può essere eseguito con tutte le cellule che esprimono EpCAM.

1. preparazione delle cellule bersaglio

  1. Etichettatura delle cellule e coltura delle cellule
    Nota: Nel presente protocollo, le cellule sono coltivate in matracci di cultura di 75 cm ². Regolare la quantità di reagenti di conseguenza se si utilizzano altri dispositivi di cultura delle cellule (per esempio piastre di coltura di 25 cm ², piastre da 6 pozzetti, ecc.). Tutti i liquidi utilizzati sono pre-riscaldati a 37 ° C in un bagno d'acqua. Se non indicato altrimenti, tutti i passaggi di protocollo vengono eseguiti a temperatura ambiente (TA).
    1. Cellule HT-29 e di cultura in 5a per volta supplementato di McCoy con 2 mM L-Glutammina, 20 mM Hepes, 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina/streptomicina a 37 ° C in un'atmosfera di 5% CO2 .
    2. Quando le cellule sono 90% confluenti, togliere la soluzione e sciacquare le cellule con 10 mL di PBS 1X.
    3. Per raccogliere le cellule, aggiungere 2 mL di soluzione di distacco delle cellule (tabella materiali e reagenti) alle cellule e incubare le cellule per circa 5 min a 37 ° C.
      Nota: La soluzione di distacco contiene proteolitici ed enzimi collagenolytic in 1X PBS, acido etilendiamminotetracetico 0,5 mM (ed) e rosso fenolo 3 mg/L. Ridurre il tempo di pre-riscaldamento della soluzione di distacco delle cellule al minimo come questo sarà inattivo dopo 1 h a 37 ° C. Coprire lo strato di cellule intere per ottenere il distacco cellulare ottimale.
    4. Controllare il distacco delle cellule usando un microscopio invertito.
    5. Trasferire tutto indipendente celle per un tubo da 50 mL precompilato con 10 mL di terreno di coltura cellulare (stesso come utilizzata nel passaggio 1.1.1.) e risospendere le cellule pipettando.
    6. Posizionare la sospensione delle cellule rimanenti su un mixer di rullo orizzontale a RT e procedere con il passaggio di etichettatura.
  2. Vivere in marcature cellulari delle cellule bersaglio
    1. Diluire 1 µ l di 5mm CFSE (fornito in dimetilsolfossido, DMSO) in 1 mL di PBS 1X preriscaldato a 37 ° C per ottenere la soluzione di etichettatura CFSE ready-to-use 5 µM.
      Nota: Per risultati ottimali di colorazione, utilizzare soluzioni preparate al momento.
    2. Preparare una ready-to-use DNA soluzione colorante (tabella materiali e reagenti) in PBS 1X e conservarlo a 2-6 ° C al riparo dalla luce.
      Nota: Per risultati ottimali di colorazione, utilizzare soluzioni preparate al momento.
    3. Ottenere il cellule dal miscelatore orizzontale a rulli (passo 1.1.6.) e pellet che le cellule a 300 x g per 10 min. rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 10 mL di PBS 1X.
    4. Sciacquare le cellule ancora una volta con PBS 1X e risospendere il pellet cellulare in 500 µ l ready-to-use CFSE etichettatura di soluzione.
    5. Incubare le cellule a 37 ° C per 15 min e raccogliere le cellule dopo centrifugazione a 300 x g per 3 min.
    6. Risospendere le cellule marcate in 1 mL di mezzo di coltura cellulare pre-riscaldato e permettono alle cellule di rigenerarsi a 37 ° C per 30 min.
    7. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 300 x g per 3 min e risospendere il pellet di cellule in 1 mL di soluzione a 37 ° C per 10 min la macchiatura del DNA di ready-to-use.
    8. Appallottolare le celle, rimuovere il supernatante e risospendere le cellule in 4 mL di PBS 1X. Valutare la densità delle cellule usando un emocitometro e verifica per fluorescenza etichettatura utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e della fluorescina isotiocianato filtri (FITC) (Figura 2A e 2E).
    9. Centrifugare le cellule a 300 x g per 3 min e risospendere il pellet cellulare secondo la densità delle cellule, necessari per l'esperimento rispettivo come specificato nella sezione successiva e posto sul ghiaccio.

2. il cavo di ricarica

Nota: Le cellule possono essere isolate da destinazione cella/periferico sangue spikings a scala di millilitro o fornendo il basso numero di cellule in una scala di microliter. Considerando che il primo approccio permette che imita condizione rara delle cellule nel sangue periferico, quest'ultimo può essere il modo preferito per allegare alcune cellule allo scopo di ottimizzazione/test sul protocollo.

  1. Ricarica il filo utilizzando un grande volume di sospensioni cellulari
    1. Preparare un 2% BSA blocco soluzione sciogliendo 0,8 g di BSA in 40 mL di PBS 1X (uso della coltura delle cellule). Sciogliere BSA da Vortex iniziale e successiva incubazione a RT su un mixer di rullo orizzontale per 10-20 min.
    2. Risciacquo vuoto tubi/sodio eparina con EDTA con 2 mL di 2% BSA per rimuovere i residui dell'anticoagulante e scartare la soluzione. Bloccare la superficie del tubo mediante incubazione a RT con 5 mL di 2% BSA su un mixer di rullo orizzontale a 15 giri/min per 30 min e scartare la soluzione.
    3. Diluire le cellule marcate (punto 1.2.) ad una densità di 100 000 cellule/mL e utilizzare 5ml per ricaricare il filo.
    4. Aggiungere 5 mL della sospensione delle cellule etichettati (500 000 cellule in totale) al tubo. Evitare le bolle quando si aggiunge la sospensione cellulare.
    5. Rimuovere il cavo dal vano portaoggetti, così come il cappuccio di gomma che tiene il filo e sciacquarlo in PBS 1X (Figura 3).
    6. Penetrare il cappuccio del tubo di gomma della provetta EDTA (passo 2.1.4.) con l'aiuto di un ago di siringa (20G) e inserire il cavo in modo tale che la parte funzionale è completamente immersa in una sospensione cellulare quando il tappo viene indietro il tubo e il tubo posizionato sul mixer rulli inclinati.
      Nota: La parte funzionale tripla elica del filo dovrebbe essere ricoperta di sospensione cellulare durante la carica.
    7. Ruotare i tubi su un mixer di rulli inclinati a 5 giri/min per 30 min consentire alle cellule di allegare il filo.
    8. Sciacquare il filo con 5 mL di PBS 1X e conservarlo al buio a 2-6 ° C in una provetta da 15 mL contenente 1X PBS fino all'esame visivo.
      Nota: La parte funzionale del filo deve essere sommersa in PBS per evitare di danneggiare le cellule.
  2. Isolamento di cellule bersaglio da miscele artificiali con sangue periferico (alternativa metodo di ricarica: 2.1. Ricarica il filo utilizzando un grande volume di sospensioni cellulari)
    1. Diluire le cellule marcate (punto 1.2.) per ottenere sospensioni cellulari con densità cellulare alta (> 1 000 000 singoli cellule/mL), quindi mantenendo basso il volume della sospensione cellulare aggiunto al sangue periferico.
    2. Aggiungere 500 a 500 000 cellule a 5 mL di sangue periferico e mescolare capovolgendo la provetta.
    3. Rimuovere il cavo dal vano portaoggetti, rimuovere il tappo di gomma che tiene il filo e sciacquarlo in PBS 1X.
    4. Penetrare un nuovo cappuccio del tubo con la parte non-funzionali del dispositivo utilizzando un ago di siringa (20G) tale che la parte funzionale è completamente immersa nel sangue a spillo quando il tappo viene indietro il tubo e il tubo posizionato sul mixer rulli inclinati.
      Nota: La parte funzionale tripla elica del filo dovrebbe essere ricoperta di sospensione cellulare durante la carica.
    5. Incubare la provetta sul mixer rulli inclinati a 5 giri per 30 minuti a TA.
    6. Risciacquare il filo 3 volte in PBS 1X e conservarlo al buio in una provetta da 15 mL contenente 1X PBS fino all'esame visivo.
      Nota: La parte funzionale del filo deve essere sommersa per evitare di danneggiare le cellule.
  3. Il filo da sospensioni cellulari di basso volume di ricarica (alternativa metodo di ricarica: 2.1. Ricarica il filo utilizzando un grande volume di sospensioni cellulari)
    1. Risospendere le cellule marcate a 1 000 000 singoli cellule/mL in 1X PBS.
    2. Difficoltà un bicchiere usa e getta di 150mm pipetta Pasteur orizzontalmente su una cremagliera.
    3. Rimuovere il cavo dal vano portaoggetti, ma tenere il cappuccio di gomma gialla che tiene il filo.
    4. Posizionare il filo nella pipetta, tale che la parte funzionalizzata è situata nella punta della pipetta Pasteur non toccare il vetro.
      Nota: La punta del filo non deve sporgere dalla punta della pipetta Pasteur. Evitare di collegare la parte posteriore della punta della pipetta di Pasteur con il tappo di gomma che tiene il filo. Se attaccato stretto, sospensioni cellulari non possono essere caricate da altro lato verso la punta della pipetta.
    5. Caricare 15 µ l di sospensione cellulare nella punta della pipetta Pasteur che copre la parte funzionalizzata del filo.
    6. Incubare il filo per 10 min. quarto di giro manualmente la punta della pipetta assemblato filo/Pasteur ogni minuto.
    7. Rimuovere il filo dalla punta della pipetta di Pasteur, sciacquarlo in 5 mL di PBS 1X e conservarlo al buio a 2-6 ° C in una provetta da 15 mL contenente 1X PBS fino all'esame visivo.
      Nota: La parte funzionale deve essere sommersa in PBS 1X per evitare di danneggiare le cellule.

3. conteggio celle sul filo

Nota: Tenere sempre la parte funzionale del filo sommerso in 1X PBS per evitare di danneggiare le cellule.

  1. Utilizzare una penna di grasso per disegnare un'area del rettangolo su un vetrino e aggiungere 500 µ l di PBS 1X.
  2. Piegare la parte non-funzionale del filo e posizionarlo sul vetrino, tale che la parte funzionale è immerso in PBS 1X.
    Nota: Inserire l'area del rettangolo e volume di 1X PBS per coprire completamente la parte funzionale del filo. Utilizzare un nastro biadesivo per montare la parte non-funzionale del filo sulla diapositiva.
  3. Ispezionare visivamente entrambi i lati del filo per enumerare le cellule catturate (Figura 2B e 2F).
    Nota: La presenza di cellule è determinata utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di filtri per DAPI e FITC. Entrambi i lati del filo possono essere ispezionati e il numero di cellule sia valutato (per i numeri di cellulare alta) o contato (fattibile solo se un numero basso di cellule è attaccato al filo). Questo passaggio può essere ignorato se enumerazione delle cellule non è necessaria.
  4. Dopo la scansione, posizionare il filo nuovamente dentro il tubo da 15 mL contenente il PBS 1X (Vedi nota di 2.3.6. e sezione 3.), e conservare il filo al buio.
    Nota: la maggior parte della parte non funzionante del filo può essere tagliato (tra cui la curvatura) e rimosso deposito interpolazione.

4. distacco e recupero delle cellule bersaglio

Nota: Il distacco delle cellule deve essere assolto entro 4 h dopo l'isolamento.

  1. Sciogliere 4 mg del componente di buffer di rilascio (tabella materiali e reagenti) per mL di 1X PBS e filtrare la soluzione attraverso un filtro sterile di 0,2 µm per ottenere il tampone di ready-to-use.
    Nota: Il polimero del filo è composto da un idrogel che è funzionalizzato con anticorpi anti-EpCAM consentendo l'associazione di EpCAM-presentando le cellule bersaglio. Il buffer di uscita contiene un enzima proteolitico di carbonio-ossigeno in grado dell'idrogel di sfaldatura. Clivaggio proteolitico risultati nella degradazione del polimero e, quindi, la separazione delle cellule catturate.
  2. Pre-riscaldare il buffer di uscita a 37 ° C per 5 min.
  3. Aggiungere 1,6 mL di tampone di rilascio per riempire una provetta di reazione da 1,5 mL.
    Nota: Tubi progettati per volumi di reazione di 1,5 mL consentono applicazione di 1,6 mL che è necessario per la parte funzionale del filo la sommersione.
  4. Incubare la parte funzionale del filo nel buffer di uscita a 37 ° C (bagnomaria) per 20 min. utilizzare il tappo di gomma fornito con il filo invece il cappuccio del tubo per fissare il cavo nel tubo da 1,5 mL per evitare la contaminazione durante l'incubazione nel bagno d'acqua.
  5. Trasferire il gruppo del filo/tubo uno shaker a RT e 500 rpm per 15 min.
    Nota: Lo shaker ha un'orbita di 1,5 mm.
  6. Collocare il gruppo filo/tubo in una centrifuga e girarla a 300 x g per 10 min.
  7. Rimuovere il cavo dal tubo, chiudere il tappo e centrifugare la provetta nuovamente a 300 x g per 10 min.
    Nota: Il filo possa essere memorizzato in 1X PBS a 2-6 ° C al buio per conta cellulare per valutare il distacco/check dell'efficienza per le celle rimanenti sul filo.
  8. Per ridurre il volume della sospensione cellulare, rimuovere tutti tranne 100 µ l (micromanipolazione) o in alternativa 300 µ l (citocentrifugazione e microdissezione laser successivi) del surnatante e immediatamente procedere al campionamento di cella singola.

5. cella singola campionamento

  1. Micromanipolazione
    Nota: Singole cellule verranno aggiunto a 2 µ l di mix master di lisi cellulare permettendo di WGA. Preparare il mix master secondo il numero delle cellule per essere elaborati, calcolare volumi supplementari per la perdita a causa di pipettaggio e luogo delle cellule Lisi mix master sul ghiaccio.
    1. Preparare il mix master di lisi (componenti di kit di WGA, tabella materiali e reagenti) di cella secondo il protocollo descritto da Czyż et al.18. Mescolare brevemente, 2.0 µ l di tampone di reazione, 1,3 µ l di octylphenoxypolyethoxyethanol (soluzione al 10%), 1,3 µ l di 4-(1,1,3,3-tetrametilbutil) fenil-polietilene glicole (soluzione al 10%), 2,6 µ l di una soluzione di proteinasi K e 12,8 µ l privo di RNAsi e dnasi acqua per ottenere un mix master per 10 campioni (volume totale 20 µ l).
      Nota: Per ulteriori esempi, aumentare i volumi di conseguenza. La composizione del mix master di lisi delle cellule differisce da quello utilizzato nella procedura alternativa che utilizza esempi di microdissezione laser (vedere 5.2.).
    2. Utilizzare una penna di grasso per disegnare un'area tenendo la sospensione cellulare in posizione. Se la densità delle cellule è troppo alta, regolare area e volume (cioè. contrassegnare un'area più ampia su vetrino, 1x PBS e un'aliquota della sospensione delle cellule di carico).
    3. Dispensare la sospensione intera cella macchiato (ottenuta al passaggio 4.8.) sulla lastra di vetro.
    4. Trasferire il vetrino di un microscopio equipaggiato con un micromanipolatore. Lasciare che le celle stabilirsi per 5 min (Figura 2D e 2 H).
    5. Preparare 0,2 mL PCR tubi caricati con 2.0 µ l di master di lisi delle cellule mescolano (v. punto 5.1.1) e memorizzarlo sul ghiaccio.
    6. Raccogliere le singole cellule in 1 µ l di PBS 1X utilizzando il micromanipolatore e trasferire le cellule in una provetta contenente mix master di lisi delle cellule.
      Nota: Per il trasferimento di cellule micromanipulated nel buffer di lisi cellulare inserire direttamente il capillare il 2 µ l di soluzione di lisi ed espellere fino a quando bolle possono essere visto.
    7. Si sono fermati brevemente il campione a 2000 x g per 3 s usando un desktop microfuge per raccogliere tutto il liquido nella parte inferiore del tubo. Porre i campioni su ghiaccio.
    8. Procedere direttamente a cella singola WGA (vedere la sezione 6. and Face et al. 19).
  2. Microdissezione laser (metodo alternativo unicellulare campionamento a: 5.1. Micromanipolazione)
    Nota: La composizione del mix master utilizzati in questa sezione è diverso da quello utilizzato nella sezione 5.1 per micromanipolazione. Cellule singole verranno aggiunto a 4,5 µ l di mix master lisi di cellule (componenti di kit di WGA, tabella materiali e reagenti) per WGA.
    1. Preparare il mix master di lisi delle cellule secondo Czyż et al. 19 mescolando 5,0 µ l di tampone di reazione, 1,3 µ l di octylphenoxypolyethoxyethanol (soluzione al 10%), 1,3 µ l di 4-(1,1,3,3-tetrametilbutil) fenil-polietilene glicole (soluzione al 10%), Resp., 2,6 µ l di una soluzione di proteinasi K e 34,8 µ l della RNAsi / Privo di dnasi acqua per ottenere un mix master per 10 campioni (volume totale 45 µ l). Mettere il mix master sul ghiaccio.
      Nota: Per ulteriori esempi, aumentare i volumi di conseguenza.
    2. UV-ossequio rivestite con membrana scivoli adatti per microdissezione laser. Di conseguenza, porre i vetrini in un DNA cross linker dispositivo ed esporre ai raggi UV più alto per circa 10 min.
    3. Montare lo scivolo rivestite con membrana in una citocentrifuga cytospin la sospensione intera cella a 300 x g per 5 min.
      Nota: Quando si utilizza un sistema a liquido, dove le cellule sono citocentrifugate il vetrino nella soluzione, rimuovere il supernatante dopo citocentrifugazione e applicare una rotazione a secco a 1140 x g per 1 min.
    4. Procedere direttamente alla microdissezione laser o lasciare che il cytospins asciugare durante la notte e congelare i campioni a-20 ° C per la conservazione a lungo termine.
    5. 4,5 µ l di mix master di lisi delle cellule nella PAC di un tubo PCR 0,2 mL e raccogliere le singole cellule mediante microdissezione laser.
    6. Recuperare la provetta PCR dal microscopio laser microdissection e chiudere il tubo. Raccogliere tutto il liquido nella parte inferiore del tubo di breve-spin e posizionare il campione sul ghiaccio.
    7. Procedere con cella singola WGA o conservare i campioni isolati a-80 ° C fino a 1 mese prima del successivo trattamento.

6. adattatore-linker base intero genoma amplificazione 18,19

Nota: Assicurarsi che tutti i necessari master mix (componenti di kit di WGA, tabella materiali e reagenti) sono preparati e conservati nel ghiaccio pronto all'uso. Mix master includono il mix di digestione del DNA 1 per micromanipulated (Vedi 5.1.) campioni (contenente 2,0 µ l di tampone di reazione, 2.0 µ l di Mseho degli enzimi di limitazione e 16,0 µ l di acqua RNasi/dnasi-free) o digestione del DNA mescolare 2 per microdissezione laser (vedere 5.2). campioni (contenente 2,5 µ l di Mseho degli enzimi di limitazione e 2,5 µ l di acqua RNasi/dnasi-free), pre-ricottura mix master (contenente 5,0 µ l di tampone di reazione, 5,0 µ l di ciascuna delle schede preannealing PCR e 15.0 µ l di acqua RNasi/dnasi-free), legatura mix master (contenente 30.0 µ l di pre-temprato PCR adattatori, 10.0 µ l di soluzione di trifosfato di adenosina e 10.0 soluzione di ligasi T4 µ l) e primario PCR master mix (contenente 30.0 µ l di un tampone di PCR, 20,0 µ l di soluzione di mix di deossinucleotidi 10 mM, 10,0 µ l di una polimerasi mix e 340.0 µ l di acqua RNasi/dnasi-free). Tutti i volumi sono dati per la preparazione di 10 campioni. Regolare di conseguenza il numero di campioni.

  1. Per lisi cellulare, inserire i campioni di microdissezione laser/micromanipulated in un termociclatore ed eseguire unicellulare Lisi incubando la cella a 42 ° C per 45 min, 65 ° C per 30 min e 80 ° C per 10 min.
    Nota: Utilizzare un termociclatore con coperchio riscaldato. Lisi delle cellule possono essere fatto O/N per 10-15 h. In tal caso, omettere la fase di incubazione a 65 ° C.
  2. Eseguire la pre-ricottura delle schede di PCR. Di conseguenza, incubare il mix master pre-ricottura in un termociclatore a 65 ° C per 1 min seguita da ulteriori 49 cicli, 1 min ciascuno, con progressivamente diminuendo la temperatura di 1 ° C/ciclo. Dopo 50 cicli (a 15 ° C), incubare il mix master a 15 ° C fino all'utilizzo ulteriore.
    Nota: Questo passaggio è necessario per generare asimmetrici adattatori adatti per legatura (v. punto 6.6) con cella singola DNA sottoposto a Mseho raccolta di limitazione.
  3. Dopo la lisi cellulare, rallentare i campioni lisati a 2000 x g per 3 s per raccogliere tutto il liquido nella parte inferiore e posizionarlo sul ghiaccio.
  4. Per frammento di DNA, aggiungere 2 µ l di DNA digestione mix 1 a ciascun campione lisato micromanipulated o 0,5 µ l della digestione del DNA mescolare 2 per il campione di microdissezione laser ed eseguire la raccolta di limitazione. Utilizzare un termociclatore con un coperchio riscaldato a 37 ° C per 5 min seguita da una fase di inattivazione degli enzimi di limitazione a 65 ° C per 5 min.
    Nota: La digestione a 37 ° C può essere estesa a 3h. Questo è l'unico passaggio di protocollo diverse tra i campioni ottenuti da micromanipolazione e campioni ottenuti da microdissezione laser.
  5. Rotazione verso il basso i campioni per raccogliere tutto il liquido nella parte inferiore e posizionarlo sul ghiaccio.
  6. Per la legatura del DNA digerito di restrizione e schede di pre-temprati, 5,0 µ l di master legatura mescolare per ciascun campione di DNA digerito e lega i in un termociclatore a 15 ° C per 1 h.
    Nota: Questo passaggio può essere esteso a 12 h o eseguita O/N.
  7. Rotazione verso il basso i campioni per raccogliere tutto il liquido nella parte inferiore e posizionarlo sul ghiaccio.
  8. Per WGA µ l 40.0 di primaria mix master di PCR per ciascuno dei prodotti di legatura ed eseguire WGA in un termociclatore con un coperchio riscaldato come segue: primo, incubare i campioni a 68 ° C per 3 min. In secondo luogo, ciclo per 15 volte a 94 ° C per 40 s, 57 ° C per 30 s e 68 ° C per 1 min 30 s + 1 s/ciclo. Quindi aggiungere 9 cicli a 94 ° C per 40 s, 57 ° C + 1 ° C/ciclo per 30 s, 68 ° C per 1 min 45 s + 1 s/ciclo. Da allora in poi, ciclo per 23 volte a 94 ° C per 40 s, 65 ° C per 30 s, 68 ° C per 1 min 53 s + 1 s/ciclo. Infine, eseguire un'estensione finale a 68 ° C per 3 min 40 s e raffreddare i campioni a 4 ° C.
  9. Rotazione verso il basso i campioni per raccogliere tutto il liquido nella parte inferiore e controllare la qualità di DNA o conservare i campioni a-20 ° C o da-80 ° C per la conservazione a lungo termine.

7. controllo di qualità dei prodotti WGA

Nota: Controllare la qualità dei prodotti WGA basato sull'intervallo di striscio il DNA e il numero dei prodotti di amplificazione dopo aver eseguito un 4plex QC-PCR 5. Eseguire WGA aliquote e rispettivi campioni di QC-PCR su un gel di agarosio 1,0% per la valutazione.

  1. Preparare soluzioni di riserva 100 µM di tutti i primer utilizzati per il controllo di qualità 4plex PCR (tabella 1). Aggiungere 8 µ l di ogni primer a 136.0 µ l di acqua di PCR-grado per generare 200 µ l di piscina di primer. Vortice la soluzione per 3 s, rotazione verso il basso a 2000 x g per 3 s e aliquota 20 µ l per conservazione a-20 ° C.
  2. Kit PCR standard l'uso di preparare un multiplex PCR master mix contenente 6,0 µ l di 2 componenti, x PCR (ad eccezione di primer), 4,5 µ l di acqua di PCR-grado e 0,5 µ l della piscina di primer.
  3. Aggiungere 1,0 µ l dei prodotti WGA, lo spin down ed esecuzione PCR a 94 ° C per 2 min seguita da 35 cicli di denaturazione a 94 ° C per 1 min, primer di ricottura a 56 ° C per 1 min ed estensione dell'iniettore a 72 ° C per 1 min 30 s e un passo di estensione finale a 72 ° C per un minimo di 7 raffreddare a 4 ° C, si sono fermati e mettere i campioni sul ghiaccio per analisi del gel lo stesso giorno o a-20 ° C per un'analisi successiva.
    Nota: Agghiacciante nel termociclatore può essere eseguita a 12 ° C per aumentare la longevità di elementi Peltier.
  4. Analizzare i prodotti WGA (ottenuti da 6,8.) e 4plex rispettivi prodotti di QC-PCR su un gel di agarosio5.

Risultati

Le cellule dopo CFSE e colorazione acido nucleico possono essere valutate utilizzando un microscopio di immunofluorescenza dotato di filtri per DAPI e FITC. I nuclei presentano una colorazione brillante nel canale DAPI mentre citoplasma delle cellule Visualizza etichettatura uniforme con CFSE con intensità eterogenea Inter-cellula (Figura 2A e 2E). Forma e intensità di colorazione simile sono previsto dalle cellule collegate al cavo (Figura 2B e 2F) così come staccati dal filo e recuperati su un vetrino (Figura 2D e 2 H).

Densità elevata delle cellule (ad es. > 1 000 000 singoli cellule/mL) potrebbe causare una copertura totale del filo con cellule quando i cavi di ricarica. Tuttavia, bassa densità delle cellule, cambiamenti nella velocità di rotazione durante l'incubazione e l'uso di diverse linee cellulari influenzano l'efficienza di isolamento e devono essere testati separatamente. Quando i fili sono stati incubati con 5 mL di cellule HT-29 a 100 000 cellule / mL come descritto al punto 2.1., una media di 254 ± 103 cellule (n = 5) sono stati catturati i fili. Con lo stesso esperimento utilizzando cellule di LNCaP, una media di 440 ± 319 cellule (n = 5) per filo è stata ottenuta.

Che presenta cellule HT-29 500, 5 000 e 50 000 in una priorità bassa di 5 mL di sangue periferico per fili (secondo protocollo sezione 2.2.) ha provocato la cattura di 75 ± 18 celle, 25 ± 9 celle e 47 ± 57 cellule (n = 3, ogni), rispettivamente. Se il filo è stato incaricato da 15 µ l di sospensione cellulare (1 000 000 singoli cellule/mL) secondo il protocollo nella sezione 2.3., fino a 1 000 (HT-29) cellule possono essere agganciato a un filo.

Efficienze di distacco ha variate da 81% in cellule HT-29 di cella (gamma 54,9% - 93,2% e n = 5) all'81% (gamma 63.51-92.87%, n = 6) e 91% (gamma 84,7% - 95,3%, n = 6) le cellule LNCaP e VCaP, rispettivamente. Allo stesso modo, il recupero delle cellule indipendente differisce tra linee cellulari: una media del 28% delle cellule HT-29 indipendente sono stati recuperati da citocentrifugazione. Considerando che il tasso di recupero per LNCaP era inferiore al 10%, il tasso di recupero medio per VCaP cellule era 55%.

Circa il 75% delle singole cellule sottoposte a prodotti di WGA WGA resa alta qualità: questo è 1) striscio di prodotti WGA che vanno da 0,1 a > 1 kb (Figura 4, pannello superiore) e 2) tre o quattro bande nella qualità 4plex controllano PCR (Figura 4, pannello inferiore) . WGA prodotti possono essere utilizzati per 1) array-CGH profilatura soddisfano i criteri di qualità per cella singola array-CGH profili 6,7 e 2) mirata NGS dopo ri-amplificazione WGA 7.

figure-results-1
Figura 1: flusso di lavoro per isolare e recupero di cellule bersaglio per analisi unicellulare. (A) le cellule sono coltivate a confluency di 90% e (B) raccolte per ottenere una sospensione unicellulare. Dopo colorazione con CFSE e acido nucleico macchia, (C) il filo funzionalizzato viene incubato in presenza di cellule in un volume di 5 mL utilizzando provette di reazione o in un volume basso usando la punta di una pipetta di Pasteur. Quest'ultimo permette di volumi di sospensione cellulare partir 15 µ l. (D) le cellule hanno bisogno di essere indipendente all'interno di 4 h dopo la ricarica. Di conseguenza, il filo è collocato in una provetta di reazione 1,5 mL riempita con buffer di uscita. Dopo l'incubazione di 15 min su un rocker e 10 min di centrifugazione, il filo viene rimosso e la sospensione cellulare viene centrifugata per agglomerare le cellule. (E) cellule recuperate sono sia trasferite a una lastra di vetro per cella singola micromanipolazione (in alto) o citocentrifugate su un vetrino rivestite con membrana e inoltrate a laser microdissection (in basso). (F) infine, raccolte singole cellule sono amplificate mediante amplificazione del genoma intero (WGA). WGA prodotti sono compatibili con array-CGH e mirate analisi a valle di NGS. EpCAM epitopo: cerchio verde sulla superficie delle cellule. Funzionalizzati filo: dispositivo, grigi fili tripla elica. Polimero: linee viola. Gli anticorpi anti-EpCAM: arancione. Attività di buffer di uscita: freccia rossa. Marcatore di grasso per mantenere la sospensione cellulare in posizione: ellisse blu scuro. Recuperata la sospensione cellulare: blu chiaro. Capillare per micromanipolazione: linea nera. Ingrandimento: recuperati delle cellule raccolte di micromanipolazione, cytospin su rivestito diapositive contenenti celle recuperate (ellisse piena grigia). Ingrandimento: essere recuperato cella laser microdissected (grigio linea circolare: membrana da diapositiva di membrana che funge da spina dorsale per il laser microdissection) obiettiva con raggio laser (linea blu si avvicina la diapositiva di membrana dal basso). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: visualizzazione di cellule marcate. (A, E) Cellule prima della ricarica: le cellule sono etichettate con CFSE e controcolorate con un DNA intercalanti tintura che mostra un'intensità di segnale gamma di CFSE (verde). (B,F) Cellule marcate catturate sul filo. (C,G) Filo dopo procedura di distacco cellulare. (D,H) Cellule staccate dal filo e recuperati da citocentrifugazione in una diapositiva. CFSE: Canale FITC (verde). Macchia di DNA: canale DAPI (blu). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: filo e conservazione vano. (A) scomparti del filo. (B) dettaglio della parte funzionalizzata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: controllo di qualità dei prodotti WGA ricavate dalle celle singole micromanipulated. Pannello superiore: prodotti WGA ottenuti da singole cellule in genere risultato nel DNA sbavature che vanno da 0,2 kb a > 1,0 kb con un'intensità di picco a circa 0,5 kb. Numero di campioni 1, 7 e 13 (contrassegnati con un asterisco) Visualizza suboptimale o nessun DNA sbavature. Pannello di fondo: WGA prodotti sono di qualità sufficiente se la PCR 4plex produce tre o quattro di quattro prodotti di PCR (100, 200, 300 e 400 bp). Campioni 1, 7, 10 e 13 mostrano meno di tre bande e sarebbero esclusi da ulteriori analisi. Il vicolo M contiene una scala di bp 100 e gli asterischi indicano i campioni di qualità di prodotto WGA insufficiente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Sequenza più supereleganteNOTA
5 ′-gtt cca ata tga ttc cac cc-3 ′primer in avanti di 100 bp
5 ′-ctc ctg gaa gat ggt gat gg-3 ′primer inverso di 100 bp
5 ′-agg tgg agc gag gct agc-3 ′primer in avanti di 200 bp
5 ′-ttt tgc ggt gga aat gtc ct-3 ′primer inverso di 200 bp
5 ′-agg tga gac att ctt gct gg-3 ′300 primer forward bp
5 ′-tcc atto aac cag tca gcg tc-3 ′300 primer inverso di bp
5 ′-aca gtc gatto gcc atc atto gc-3 ′primer in avanti di 400 bp
5 ′-gct tga caa agt ggt cgt tg-3 ′primer inverso di 400 bp

Tabella 1: Sequenze di Primer per il controllo di qualità 4plex PCR

Discussione

Il protocollo descritto mira al recupero di cellule da un filo funzionalizzato (denominato dispositivo) per ex vivo l'analisi genomica unicellulare. Abbiamo testato tre linee cellulari EpCAM-positivi (HT-29, LNCaP e VCaP), ma in linea di principio, questo metodo può essere applicato a qualsiasi linea cellulare che esprime EpCAM. Cellule bersaglio EpCAM-positivi possono essere presentate al dispositivo come sospensione cellulare puro (Vedi 2.1.) o misto in un surplus di cellule della priorità bassa (ad es. periferico del sangue, vedere 2.2.). Considerando che soprattutto quest'ultimo potrebbe essere utilizzato per testare le capacità di isolamento in condizioni di rara delle cellule, la messa a punto del numero delle cellule allegate al filo può essere fatto utilizzando il basso volume descritto approccio (Vedi punto 2.3.). Differenze tra linee cellulari sono da attendersi, densità delle cellule adatto per la ricarica il filo, rotazione velocità così come tempo di incubazione devono essere testati empiricamente valutando il numero di cellule allegate utilizzando un microscopio di immunofluorescenza.

Per applicazioni a valle genomiche a livello di singola cellula WGA, è richiesto. Il metodo WGA di scelta può variare tra i laboratori e, in linea di principio, il nostro metodo è aperto a tutti i metodi che può gestire campioni ottenuti da micromanipolazione o laser microdissection. In questo protocollo, utilizziamo un metodo basato sul DNA enzimaticamente frammentato a causa di una migliore performance rispetto ad un calore-frammentazione basato WGA7. Opzionale, singole cellule possono essere inoltrate ad isotermico WGA permettendo successivo DNA profiling20,21.

Il protocollo descritto mira al recupero di cellule intatte dopo essere stato collegato a una nuova generazione di fili funzionalizzati per l'analisi genomica di cella singola. La prima generazione di fili funzionalizzati, che rappresentano anche i dispositivi di arricchimento solo CE-approvato in vivo sul mercato finora, sono stata utilizzata per l'enumerazione CTCs in malati di cancro metastatizzato. Precedenti pubblicazioni e i nostri dati suggeriscono la tecnica di isolamento in vivo per essere più sensibile rispetto all'attuale tecnologia gold standard2. Quindi, dotare questa tecnica di isolamento in vivo con una funzionalità di ripristino come realizzato nel dispositivo permette che unisce alto recupero CTC con caratterizzazione a livello di singola cellula.

Tuttavia, il dispositivo non viene cancellato per l'uso in pazienti, quindi, non sono disponibili dati clinici. Applicazioni ex vivo (cioè isolare CTCs da sangue periferico dopo il campionamento) non sono raccomandati come la tecnologia si adatta le impostazioni presenti nel cubitale invano, ad es. basso diametro della vana (aumentando la probabilità di contatto diretto tra CTCs e cattura gli anticorpi) e tempo di lunga conservazione (30 min, consentendo di 2-3 L di sangue per far passare il filo). Tuttavia, come indicato nella sezione 2.2. cellule bersaglio possono anche essere isolate da campioni misti7.

Una limitazione di corrente del metodo è il recupero inefficiente delle cellule non fissati dopo distacco dai fili. Questo, tuttavia, potrebbe essere migliorata da una fase di fissazione delle cellule prima del trattamento di distacco.

In sintesi, questo protocollo è un primo passo verso l'uso combinato di una tecnica di isolamento in vivo con recupero delle cellule per caratterizzare geneticamente le cellule singole. Bisogno di ulteriori sforzi affrontare l'ottimizzazione del recupero delle cellule e liquidazione per la sua applicazione in pazienti1,2. Tuttavia, la medicina personalizzata per le decisioni di trattamento, monitoraggio e terapia esula enumerazione di CTCs. Pertanto, questo metodo è un primo passo verso la caratterizzazione genomica di CTC a livello di singola cellula.

Le applicazioni verso l'analisi del trascrittoma di singola cellula sembrano attuabile come vengono raccolte le cellule intatte. Tuttavia, resta da valutare se la procedura di recupero ha un impatto sull'integrità di RNA (es. inoltro recuperati celluli alla lisi diretta seguita da RT-qPCR22). In caso di successo, caratterizzazione delle singole cellule (per esempio CTCs) può essere spostata al livello del trascrittoma, consentendo un'analisi più dettagliata. A questo proposito, RNA-seq utilizzando Smart-seq2 fornisce un prezioso strumento per analisi a valle del RNA di singole cellule, come il cDNA preamplificato (ottenuto durante la preparazione della biblioteca di RNA-seq) possa essere sottoposti a PCR quantitativa. Questo vi permetterà una destinazione combinato e screening-base di analisi di singole cellule recuperate22,23.

I fili funzionalizzati attuali sono basati sugli anticorpi anti-EpCAM che è un marker epiteliale ampiamente utilizzato per la selezione positiva di CTCs24. Come diversi CTCs potrebbe downregulate marcatori epiteliali quali i cytokeratins o EpCAM25, l'aggiunta di anticorpi ad esempio HER2/new aumenterebbe la possibilità di isolamento CTC. Diversi anticorpo basato arricchimento strategie sviluppate e recensite da Ferreira et al. nel 201626. Una miscela di anticorpi immobilizzati su un filo potrebbe essere un miglioramento futuro della tecnologia che porta all'isolamento di un numero superiore e ulteriori sottotipi di CTCs.

È obbligatorio per tutti i passaggi che coinvolgono filo movimentazione per mantenere la parte funzionale del filo immerso in soluzione al fine di mantenere la sua funzionalità. Si consiglia di posizionare il filo in 1X PBS durante la valutazione (microscopio; ad es. punti 3.1. -3.3.) e deposito. Al fine di evitare macchie inappropriati, si consiglia di uso fresco preparato soluzione colorante nei passaggi 1.2.1. e 1.2.2. Cellule debolmente marcate ostacolano cella contando sul filo e possono condurre a sottovalutazione delle cellule collegate.

È necessario evitare di collegare la pipetta di Pasteur con il tappo di gomma quando si inserisce il filo nella pipetta Pasteur per caricamento successivo della sospensione delle cellule (passo 2.3.4.). Il tappo di gomma è usato per tenere il filo in posizione in modo che la parte funzionale è situata all'interno della punta della pipetta Pasteur. Se il tappo è fissato troppo saldamente alla parte posteriore della pipetta Pasteur, caricamento della sospensione delle cellule non è possibile. In questo caso, di facilitare il tappo tale che l'aria che si è spostata da una sospensione cellulare caricato può lasciare la pipetta.

Piegare il filo è cruciale per il suo orientamento durante la cella conteggio nei passaggi 3.2. e 3.3. Montare i fili utilizzando il nastro adesivo, tale che la fine non funzionali del filo arriva a mentire su un lato. Dopo la scansione dell'intera lunghezza della parte funzionale, il filo è rotolato 180° quindi l'altra metà del filo funzionale possa essere scansionata. Questo passaggio è importante per gli esperimenti iniziali valutare il numero di cellule in transito. Una volta che viene valutato il numero di celle per una certa linea cellulare e procedura, la procedura può essere ripetuta senza conta cellulare (ad es. solo il controllo per la presenza di cellule o omettere questo passaggio). Attenzione il pipettaggio è fondamentale per evitare la perdita delle cellule quando si riduce il volume del surnatante nel passaggio 4.8. Assicurarsi di pipettaggio è svolto senza intoppi senza causare turbolenze al pellet.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Questo studio è stato finanziato il fondo austriaco per scienza (FWF), progetto-no. Ho 1220-B19 (al P.S.) come parte del progetto ERANET in Translational Cancer Research (TRANSCAN) "Cellule tumorali di circolazione come biomarcatore per malattia minima residua nel cancro della prostata (CTC-SCAN)". PH.d. candidate S.C. è stata addestrata all'interno della cornice della medicina molecolare programma PhD dell'Università medica di Graz. Gli autori riconoscono con gratitudine Nina Schlögl, Daniel Kummer, Gabi Wendt, Claudia Chudak, Julia Schulz e Johanna Schiller per la loro assistenza tecnica. Gli autori ringraziano Georg Peinhaupt per il supporto di progettazione grafica.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Gilupi Release BufferGilupiGIL083Utilizzato per staccare le cellule dal filo
McCoy's 5A Medium (1x) suppl. con L-GlutamminaThermo Fisher Scientific16600-082Terreno di coltura utilizzato per cellule HT-29, adattare il terreno di coltura alla linea cellulare utilizzata per gli esperimenti
HEPES Buffer Solution (1 M)PAAS11-001Supplemento per McCoy's 5A Medium
Siero bovino fetale GoldPAAA15-151Integratore per McCoy's 5a Modified Medium
Penicillina-Streptomycin (100x)BiowestL0018-100Supplement for McCoy's 5a Modified
Medium Phosphate Buffered Saline (1x PBS)Thermo Fisher Scientific10010-015
AccutaseBiowestL0950-100Soluzione per il distacco cellulare (coltura cellulare)
Bagno d'acquaGFLTipo 1003Utilizzato per soluzioni di preriscaldamento
IncubatoreThermo Fisher ScientificUtilizzato per incubare le cellule (coltura cellulare)
Provette di reazione da 50 mLVWR525-0403
Miscelatore a rulliStuart ScientificSRT6DUtilizzato per fissare le cellule al filo impedendo alle cellule di sedimentare
CellTrace CFSE Proliferazione cellulare KitThermo Fisher ScientificC34554Utilizzato per marcare cellule viventi (etichetta citoplasmatica)
Hoechst 33342H3570Thermo Fisher ScientificUtilizzato per colorare il DNA (controcolorazione nucleica)
Centrifuga (attrezzata per contenere provette di reazione da 15 mL e 50 mL)Thermo Fisher ScientificHeraeus Megafuge 40RUtilizzato per la pellettizzazione di celle
Observer Z1 (Microscopio a fluorescenza/microdissezione laser)Carl Zeiss MicroimagingMicroscopio invertito (immunofluorescenza) in grado di eseguire la microdissezione laser; I microscopi a fluorescenza devono essere in grado di rilevare Hoechst 33342 (filtro DAPI) e CFSE (filtro FITC)
Albumina sierica bovina (BSA)Sigma-AldrichA4503-50GUtilizzato per il rivestimento di superfici in vetro/plastica
MS1 MinishakerSigma-AldrichZ404039Utilizzato per il vortice
di provette Vacutainer EDTA (o Na-eparina)BD366450 (o 366480)Utilizzato come provetta di reazione per la cattura ex vivo di cellule bersaglio
Detektor CANCER03 DC03GilupiGIL003Filo funzionalizzato in grado di isolare e staccare celle EpCAM-positive (note anche come catch& rilascio, C& R)
Aghi per siringhe (G20)VWR613-0554Utilizzato per forare i cappucci di gomma al fine di consentire la parte non funzionale del C& R per condurre attraverso di esso
Camera NeubauerRothT729.1Utilizzato per contare le cellule
Pipette Pasteur 150 mmVolacD810Utilizzato per l'applicazione a basso volume di cellule al C& R
Grease penDakoS2002Utilizzato su vetrini per mantenere in posizione la sospensione cellulare
Filtro per siringa steril (0,2 & micro; m)Corning431219Per filtrare il tampone di rilascio Gilupi appena preparato
Delfia PlateShakerPerkin Elmer1296-003Utilizzato per l'agitazione durante il distacco delle cellule
Provette da 1,5 mLEppendorf30,125,150
Ampli1 WGA KitSilicon BiosystemsDa ordinare tramite Silicon Biosystems
Axiovert M200 dotato di Mikromanipulator MMJ e CellTram varioZeiss/EppendorfUtilizzare la micromanipolazione a portata di mano
Microcapillari (25 &; micro; m di diametro), CustomTip Tipo IEppendorf930001201Utilizzato per la micromanipolazione di cellule
Provette PCR da 0,2 mLBiozym710920
Citocentrifuga e attrezzatureHettichUniversal 32Utilizzare la citocentrifuga a portata di mano
TermociclatoreBio-RadDNA Engine DyadOgni termociclatore con coperchio riscaldato può essere utilizzato
MicrocentrifugaRothCX73.1Utilizzare la centrifuga da tavolo a portata di mano
MembraneSlide 1.0 PETZeiss415101-4401-050Vetrini rivestiti con membrana utilizzati per la microdissezione
laser UV Stratalinker 1800 Stratagene400072Utilizzare il reticolante del DNA a portata di mano
Reagenti
6x Caricamento del DNAThermo Fisher ScientificR0611Utilizzare il gel caricamento del colorante a portata di mano
Scala del DNABioLabsN0551GUtilizzare la scala da 100 bp a portata di mano
AgarosioBiozym840004
Stazione di elettroforesi su gelBio-RadUtilizzare il sistema di elettroforesi a portata di mano
Gel Red Nucleic Acid StainBiotium41003Colorante intercalante per la visualizzazione del DNA Nei gel di agarosio
PCR standard

Riferimenti

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