Segnaliamo un short hairpin RNA (shRNA) e sequenziamento basato su protocollo di ultima generazione per l'identificazione dei regolatori di inattivazione del cromosoma x in una linea cellulare murina con luciferasi firefly e geni di resistenza igromicina fuse con il metil CpG binding protein 2 ( MeCP2) gene sul cromosoma di X inattivo.
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Articolo metodologico
In pool shRNA schermo per riattivazione di MeCP2 sul cromosoma di X inattivo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Avanti schermi genetici usando geni reporter inseriti l'eterocromatina sono stati ampiamente utilizzati per studiare i meccanismi di controllo epigenetico in organismi modello. Tecnologie tra cui short hairpin RNA (shRNA) e cluster regolarmente intercapedine ripetizioni brevi palindromi (CRISPR) hanno permesso tali schermi in cellule di mammifero diploide. Qui descriviamo una schermata di shRNA su larga scala per regolatori di inattivazione del cromosoma x (XCI), utilizzando una linea cellulare murina con luciferasi firefly e geni di resistenza igromicina bussò in al C-terminale di methyl CpG binding protein al 2 (MeCP2) gene sul cromosoma x inattivo (Xi). Riattivazione del costrutto nella linea cellulare reporter conferiti vantaggio di sopravvivenza sotto selezione igromicina B, consentendoci di schermo una biblioteca grande shRNA e identificare forcine che riattivato il reporter misurando il loro utilizzo di arricchimento post-selezione sequenziamento di nuova generazione. Le forcine arricchite poi sono state convalidate individualmente verificando la loro capacità di attivare il reporter di luciferase su Xi.
Introduzione
Uno le forme più comuni di danno mentale ereditario nelle femmine, la sindrome di Rett, è causato da mutazioni eterozigoti in MeCP2, un gene del cromosoma x che codifica per una proteina essenziale per la normale funzione di un neurone1. Un potenziale approccio per trattare questo disordine sarebbe riattivazione del selvaggio-tipo allele di MeCP2 su Xi, come ripristino dell'espressione di MeCP2 è stata indicata per invertire i deficit neurologici in un modello murino di questa malattia1, 2 , 4. Tuttavia, silenziamento epigene....
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Protocollo
Tutti i passaggi che coinvolgono animali sono stati effettuati utilizzando protocolli approvati dal Fred Hutchinson Cancer Research Center istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC). Non utilizzare reagenti utilizzati qui sono noti rischi significativi per la salute umana ad eccezione di 5-azacitidina (5-AZA).
1. generazione di una linea cellulare reporter con MeCP2- LUC-HR transgene su Xi
-
Preparazione dei fibroblasti del tendine del mouse da una donna X/xMeCP2-LUC-HR MeCP2 mouse
- Eutanasia di un giorno di 10-12-vecchia femmina X/xMeCP2-LUC-HRMeCP2
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Risultati
Fibroblasti di topo del tendine sono state raccolte da un precedentemente descritto X/xMeCP2-LUC-HRmouse femminileMeCP2 , immortalata da trasduzione retrovirale degli oncogeni E6 ed E7 di HPV-16 virus7, clonate mediante diluizione limitante e testato per l'attività luciferasica ed espressione della proteina MeCP2 selvaggio-tipo (Figura 1A e 1B). L'attività luciferasica era robusto, se il giornalista era XA e non rilevabile se il Xi; l'espressione di MeC.......
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Discussione
Nel nostro recente studio6, abbiamo generato una linea cellulare murina con luciferasi e geni di resistenza igromicina fusa per MeCP2 su Xi ed esso trasdotte con una libreria di > 60.000 shRNA targeting > 25.000 geni. Abbiamo trovato 30 geni cui vantaggio di sopravvivenza hanno conferito colpo sotto selezione igromicina B, suggerendo loro ruolo nel controllo di MeCP2 e silenziamento del x-cromosoma. Questi risultati sono stati convalidati trasdurre la linea cellulare segnalati co.......
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Dichiarazioni
Dr. Leko ha contribuito a questo articolo come un dipendente del Fred Hutchinson Cancer Research Center. Le opinioni espresse sono proprie e non rappresentano necessariamente le opinioni di National Institutes of Health o di governo degli Stati Uniti
Ringraziamenti
Grazie Ross Dickins dell'Università di Melbourne per fornire gentilmente la libreria di shRNA utilizzata nella schermata. Questo lavoro è stato finanziato da Rett sindrome Research Trust (A.B.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Linea cellulare 293FT | Invitrogen | R700-07 | |
| 5-Azacitidina | Sigma | A2385-100MG | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman-Coulter | A63881 | |
| Anticorpo anti-MECP2 | Millipore | 07-013 | |
| Collagenasi | Sigma | C2674-1G | |
| Corning 96-Well Solido Polistirene Bianco Micropiastre | Fisher Scientific | 07-200-336 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11965-092 | |
| Vettore retrovirale adattato al microRNA (pMSCV) | Open Biosystems | EAV4679 | |
| Arresto dell'espressione pSM2 Libreria shRNAmir retrovirale | Open Biosystems | RMM3796 | |
| Siero bovino fetale | Fisherbrand | 03-600-511 | |
| HiSeq 2500 | Illumina | SY– 401– 2501 | O equivalente |
| Igromicina B | Calbiochem | 400051-1MU | |
| Lipofectamina 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Sistema di analisi della luciferasi Bright-Glo Promega | E2610 | Saggio omogeneo per lo screening delle colonie Sistema | |
| di analisi della luciferasi | Promega | E4530 | Saggio non omogeneo per il test di forcine individuali |
| Luminometro TopCount NXT | Perkin Elmer | N/A | O luminometro simile |
| Kit di reagenti MiSeq v2 | Illumina | MS-102-2001 | Utilizzare il kit compatibile con la tua attrezzatura |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| Penicillina-Streptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | VSV-G envelope vector |
| Polybrene | Sigma | TR-1003-G | |
| Polietilenimmina | Polysciences | 23966-1 | |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | Vettore di imballaggio |
| Puromicina | Gibco | A11138-02 | |
| Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo | Gibco | 25300-054 |
Riferimenti
- Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).
- Guy, J., Gan, J., Selfridge, J., Cobb, S., Bird, A. Reversal of neurological defects in a mouse model of Rett....
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Ristampe e permessi
