Una nuova tecnica per la visualizzazione rapida dell'antigene su una superficie batterica è presentata, che coinvolge la superficie biotinylation seguita dall'esposizione alle proteine di interesse in fusione con avidina monomerico. Caricamento di BCG con antigeni selezionati correttamente, migliora la sua immunogenicità, suggerendo che la decorazione di superficie può sostituire tradizionali approcci genetici.
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Articolo metodologico
Espressione di antigeni esogeni nel Mycobacterium bovis BCG vaccino via genetica decorazione superficiale con il sistema avidina-biotina
In questo articolo
Sommario
Abstract
Tubercolosi (TB) è una malattia infettiva grave e il bacillo di M. bovis vaccino disponibile solo Calmette-Guérin (BCG) è sicuro ed efficace per la protezione contro la meningite di TB severa per bambini e alcune forme di TB diffusa, ma non riesce a proteggere contro la tubercolosi polmonare, che è la forma più diffusa della malattia. Strategie più promettenti per migliorare BCG attualmente si basano sia sulla sua trasformazione con geni codificanti immunodominanti M. tuberculosis (Mtb)-antigeni specifici e/o complementazione con geni codificanti co-fattori di che stimolerebbero l'antigene cellule presentanti. Principali limiti di questi approcci includono bassa efficienza, bassa stabilità e l'incerto livello di sicurezza dei vettori di espressione. In questo studio, presentiamo un approccio alternativo al miglioramento di vaccino, che consiste di complementazione di BCG con proteine esogene di interesse sulla superficie dei batteri, piuttosto che la trasformazione con plasmidi codifica geni corrispondenti. In primo luogo, le proteine di interesse sono espressi in fusione con avidina monomerica in standard Escherichia coli sistemi di espressione e quindi utilizzato per decorare la superficie di biotinylated BCG. Utilizzando BCG superficie decorata con antigene ovoalbumina surrogato gli esperimenti sugli animali dimostrano che il batterio modificato è completamente immunogenico e capace di indurre risposte delle cellule T specifiche. Complessivamente, i dati presentati qui fortemente sostengono un romanzo e un metodo efficiente per rimodellare l'attuale vaccino BCG che sostituisce l'approccio convenzionale laborioso di complementazione con acidi nucleici esogeni.
Introduzione
Sono state proposte varie strategie per sostituire l'attuale vaccino BCG, inclusi sistemi proteici adiuvante, tecnologie basato su vettori virali, ceppi di M.tb vivo attenuati e geneticamente ceppi di BCG, sia per introdurre geni di TB che iper-esprimono gli antigeni di BCG che non sono sufficientemente espressi durante infezione1 o Mtb-antigeni specifici non presentano in BCG2. Ingegneria genetica, tuttavia, affronta molte barriere tra cui l'incerto livello di sicurezza, il processo che richiede tempo e la bassa efficienza di vettori di espressione4,....
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Protocollo
Tutti gli animali sono stati mantenuti secondo protocolli approvati dalle commissioni di utilizzo presso la University of British Columbia e cura degli animali. Gli esperimenti sono stati approvati dalle commissioni di utilizzo e cura degli animali ed eseguiti secondo il canadese Consiglio sugli orientamenti di cura degli animali. Il numero di benessere animale assicurazione è A11-0247.
1. generazione di proteine di fusione di avidina monomerico esprimendo plasmidi
- Sub-clonare monomerico avidina sequenza12 in plasmide pDEST17 tra i siti "CTC" e "GAA", che corrisponde a 133-134bp. (vale a dire, tra ....
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Risultati
Con le procedure generali descritte sopra, è stata esaminata la fattibilità di BCG superficie biotinylation e decorazione con antigene surrogato OVA. L'immunogenicità del BCG modificate è stato poi testato in vivo. La superficie batterica è stato facilmente etichettata con biotina per la visualizzazione rapida di antigeni chimerico avidina senza modifiche rilevabili nei fenotipi batterici. Il BCG modificate risultante viene ingerito efficientemente dalle cellule di presentazione .......
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Discussione
Abbiamo segnalato in questo studio un approccio non-genetica per visualizzazione rapida ed efficace delle proteine esogene sulla superficie di BCG per aggiungere gli antigeni specifici o specifiche proprietà funzionali dovuto migliorare in modo efficiente l'immunogenicità del batterio. Abbiamo dimostrato che la superficie della cellula di BCG potrebbe essere facilmente biotinilato per decorazione di superficie istantanea con proteine di fusione di avidina. La procedura totale può essere eseguita entro 2 h, mentre la tras.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Dr. R Stokes per il ceppo di BCG Pasteur e r. Talal per il supporto tecnico. Ringraziamo anche GenScript per aiuto con sintesi di geni.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tecnologie RPMI 1640 | StemCell | 36750 | |
| Sulfo-NHS SS biotina | Thermo Fisher | 21328 | |
| Streptavidina coniugata FITC | Sigma-Aldrich | S3762 | |
| Ficoeritrina (PE)-coniugata I-Ab-OVA323-339 tetramero | MBL Internazionale | TS-M710-1 | |
| 7-AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| TALON poliistidina-Resina per purificazione Tag | Clontech | 635501 | |
| Alexa Fluor (AF) 647 coniugato ratto anti-topo CD4 | BD Bioscience | ||
| AF647 ratto anti-topo IFN-g | BD Bioscience | ||
| AF647 ratto anti-topo I-A/I-E | BD Bioscience | ||
| PeCy7 ratto anti-topo CD4 | BD Bioscience | ||
| PE ratto anti-topo CD8 Ab | BD Bioscience | ||
| AF 647 ratto anti-topo H-2kb | BD Bioscience | 562832 | |
| FITC-coniugato capra anticorpo coniglio | Thermo Fisher | 31635 | |
| AF 647 ratto anti-topo CD4 | BD Bioscience | ||
| Microscopia elettronica | anti-coniglio di capra coniugata in oro ultra-piccolo Scienze | 25100 | |
| Brodo Middlebrook 7H9 | BD Diagnostic Systems | 271310 | |
| OADC | BD Diagnostic Systems | B11886 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| RAW 264.7 linee cellulari di macrofagi murini | Tipo americano Collezione | ||
| pDEST17 plasmide | Invitrogen | 11803012 | |
| plasmide pUC57-OVA | GenScript | SD1176 | |
| BP clonasi | Invitrogen | 11789020 | |
| LR clonasi | Invitrogen | 11791043 | |
| plasmide pDONR221 | Invitrogen | 12536017 | |
| colonne Ni-NTA | Concentratori di proteine Qiagen | 31014 | |
| Pierce | Thermo Fisher | 88527 | |
| Flurosave | Calbiochem-Novabiochem | 345789 | |
| Axioplan II microscopio per epifluorescenza | Carl Zeiss Inc | ||
| CCD fotocamera digitale | Retiga EX, Microscopio elettronico QImaging | ||
| Tecnai G2 200kV | Azienda FEI | G2 200Kv | |
| 70μ m Filtro cellulare Falcon | Thermo Fisher | 87712 | |
| Kit di selezione positiva della biotina del mouse EasyStep | StemCell | 18556 | |
| biotina-Ter119/Cellule ertiroidi anticorpo | BioLegend | 116203 | |
| Brefeldin A | BD Pharmingen | 555029 | |
| kit Cytofix/Cytoperm | BD Pharmingen | 554714 | |
| Sistema di dosaggio della luciferasi Bright-Glo | Promega | e2620 | |
| Luminometro Turner Biosystem | Microtomo Promega | TD-20/20 | |
| Leica EM UC6 | Liofilizzatore Leica Microsystems | UC6 | |
| Novalyphe NL 500 | Savant Instruments | NL 50 | |
| Fiale in vetro boroscilicato | Wheaton | VWR 66011-675 |
Riferimenti
- Horwitz, M. A., Harth, G. A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis. Infect. Immun. 71 (4), 1672-1679 (2003).
- Pym, A. S., et al.
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Ristampe e permessi
