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Metodo del tubo rullo modificate per Imaging intermittente precisamente localizzata e ripetitivi durante la coltura a lungo termine delle fette di cervello in un sistema chiuso

DOI:

10.3791/56436

⸱

December 28th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology and Molecular, Cellular and Integrated Neuroscience Program, Colorado State University, 2IBMC-Instituto de Biologia Molecular e Celular, i3S-Instituto de Investigaçãoe Inovação em Saúde, ICBAS, Universidade do Porto, 3Denali Therapeutics

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentato qui è un metodo di tubo rullo modificate per la coltura e fette di imaging ad alta risoluzione intermittente del cervello del roditore sopra molte settimane con riposizionamento preciso sulle lamelle di fotoincisioni. Vitalità neuronale e fetta morfologia sono ben tenute. Vengono fornite applicazioni di questo sistema completamente chiusa usando i virus per espressione specifica del tipo di cella.

Abstract

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Fette del cervello del roditore coltivate sono utili per studiare il comportamento cellulare e molecolare dei neuroni e cellule gliali in un ambiente che conserva ancora molte delle loro interazioni normale in vivo . Fette ottenute da una varietà di linee di topi transgenici o uso di vettori virali per l'espressione di proteine fluorescente etichettate o reporter in fettine di cervello di tipo selvaggio consentono per imaging ad alta risoluzione da microscopia di fluorescenza. Sebbene diversi metodi sono stati sviluppati per l'imaging di fettine di cervello, che unisce la cultura fetta con la possibilità di eseguire ripetitivo imaging ad alta risoluzione di cellule specifiche a fette dal vivo nel corso di lunghi periodi di tempo ha posto problemi. Questo è particolarmente vero quando vettori virali sono usati per l'espressione di proteine esogene poiché questo è meglio farlo in un sistema chiuso per proteggere gli utenti e di evitare la contaminazione incrociata. Semplici modifiche apportate al metodo di coltura a rulli tubo cervello fetta che consentono per imaging ad alta risoluzione ripetitivo delle fette sopra molte settimane in un sistema chiuso sono segnalate. Coltura fette su vetrini coprioggetti fotoincisioni consente l'utilizzo dei marchi fiducial rapidamente e precisamente riposizionare il palco per il campo identico di immagine nel tempo prima e dopo i trattamenti differenti. Sono riportati alcuni esempi per l'utilizzo di questo metodo combinato con colorazione neuronale specifica espressione per osservare i cambiamenti nell'architettura di fettine di ippocampo, espressione di un neurone virale-mediata di proteine fluorescenti e lo sviluppo di patologia cofilina, che precedentemente è stata osservata nell'ippocampo del morbo di Alzheimer (annuncio) in risposta al trattamento della fetta con oligomeri del peptide amiloide-β (Aβ).

Introduction

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Colture primarie di neuroni dissociati dalle regioni del cervello del roditore sono un importante strumento usato dai ricercatori per osservare le risposte alla patologico implicato stimoli. Tuttavia, tali studi hanno lo svantaggio di guardando i neuroni in 2D solo e senza loro glial sistema di supporto. Inoltre, a meno che non coltivate in condizioni di densità molto alta (640 neuroni/mm2 o circa il 16% della superficie) in cui esso diventa impossibile seguire la conseguenza casuale di un dendrite o assone per più di una breve distanza dal suo corpo cellulare, hippocampal vitalità neuronale oltre 4 settimane diminuisce significativamente1, limitando l'uso di colture dissociate per gli studi estesi delle patologie età-correlate. Alla coltura delle fette preparati dal cervello del roditore è un'opzione attraente che supera queste limitazioni mantenendo un'architettura cellulare organizzata e vitalità per settimane o mesi. Condizioni per il mantenimento di molte regioni differenti del cervello del roditore nella fetta di cultura sono stati descritti2.

Due metodi principali sono ampiamente usati per la coltura a lungo termine di fette del cervello: coltura su membrane all' interfaccia aria-liquido3 o coltura sulle lamelle in provette sigillate permesso di ruotare in un incubatore a rullo per fornire aerazione4. Fette coltivate sulle membrane possono essere imaged direttamente con microscopia di fluorescenza ad alta risoluzione utilizzando un microscopio dritto e acqua immersione obiettivi5. In alternativa, fette coltivate sulle membrane sono stati trasferiti a piatti di fondo di vetro per ottenere una buona risoluzione delle spine dendritiche usando un microscopio invertito6. Tuttavia, entrambi i metodi di imaging fette coltivate sulle membrane sono sistemi aperti che richiedono modifiche medie e spesso utilizzano antimicotico e/o antibiotici per prevenire o ridurre la contaminazione5,6. Fette su una membrana all'interfaccia aria-medio mantengono eccellente morfologia e sopravvivenza, ma tornando a posizioni precise durante la formazione immagine ripetitiva ad alto ingrandimento è estremamente difficile a meno che l'esperimento è seguito solo piccoli gruppi di cellule esprimendo un marcatore fluorescente. Sebbene fette coltivate sulle membrane sono stati utilizzati con espressione virale-mediata di transgeni5,6, protocolli di biosicurezza potrebbero richiedere un sistema di coltura chiuso essere impiegato per alcuni vettori virali che sono utilizzati per esprimendo la fluorescente tagged proteine e reporter di fisiologia cellulare. Inoltre, obiettivi di immersione richiedono una decontaminazione tra i campioni che verranno seguite nella cultura5. Una delle principale applicazioni del culture interfaccia membrana sta combinando imaging ad alta risoluzione con elettrofisiologia a singola volta punti7.

Il metodo del tubo rullo con lamelle all'interno del tubo di plastica non consente alcun elettrofisiologia o imaging ad alta risoluzione senza rimuovere il vetrino coprioggetti. Pertanto, questo metodo è stato applicato più spesso a studi a lungo termine in cui sono state fatte osservazioni post-fissazione,8. Qui descritto è un metodo che utilizza la tecnica della coltura tubo rullo ma sui tubi forati-out con fette sulle lamelle che possono essere imaged in modo ripetitivo per finchè le culture vengono mantenuto. Il sistema chiuso non richiede alcun cambiamento medio per l'imaging e utilizza vetrini coprioggetti fotoincisioni per fornire fiducial marchi che consentono di imaging ad alto ingrandimento, dopo giorni o settimane, i precisi campi precedentemente imaged.

Applichiamo questo metodo per esaminare i cambiamenti nel roditore ippocampo, una regione del cervello più importanti coinvolta nella memoria e l'apprendimento. L'ippocampo roditore è spesso studiata come un modello per patologiche o età-correlate cambiamenti osservati durante lo sviluppo di danno conoscitivo9, come quelle che si verificano in annuncio. Il nostro metodo è particolarmente adatto per studiare i cambiamenti patologici che si sviluppano all'interno di una singola fetta nel tempo in risposta ai cambiamenti ambientali, come aumenti di peptidi Aβ, che è caratteristica della AD8. Una patologia connessa con il cervello umano e del roditore dell'annuncio è la presenza di aggregati cofilina-actina e le bacchette, quest'ultimi contiene fasci di filamenti in cui cofilina e actina sono presenti un 1:1 rapporto molare10,11, 12. canne sono state osservate in fisse fette dell'ippocampo del ratto dopo il trattamento di Aβ, così come all'interno di una fetta di cervello del roditore vivo esprimendo cofilina-GFP sottoposti ad ipossia8, e possono contribuire alla disfunzione sinaptica ad esempio ad e di colpo. Qui usiamo questo nuovo metodo di coltura per osservare il decorso e la distribuzione all'interno di fette di proteine fluorescenti chimeriche esogene espresse introdotte da virus diversi. Utilizziamo quindi l'espressione specifica di un neurone di un costrutto di reporter cofilina di seguire lo sviluppo della cofilina rod e aggregata patologia nelle fette hippocampal in risposta al trattamento con oligomeri solubili di Aβ (Aβo).

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Protocol

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L'uso di animali segue approvato allevamento ed i protocolli di uso animale conformi alla cura degli animali e utilizzare le linee guida della Colorado State University.

Nota: Il protocollo sottostante descrive il metodo di preparazione e cultura per l'incubazione a lungo termine e intermittente imaging di fette hippocampal. Una sola fetta hippocampal è collegata a un vetrino coprioggetti fotoincisioni appositamente preparati utilizzando un coagulo di plasma, e poi le lamelle sono sigillate sul lato piatto di un tubo forato-out rullo, che viene mantenuto in un incubatore a rulli. I grumi del plasma sono dissolti con plasmina prima infezione virale per l'espressione della proteina fluorescente e imaging ad alta risoluzione. Un colorante vitale neuronale fluorescente viene utilizzato per i neuroni all'interno le fette di immagine.

1. preparazione del rullo portaprovette

  1. Utilizzare il modello illustrato nella Figura 1A stampato sulla dimensione indicata nella barra della scala. Con un chiodo, pugno piccoli fori (abbastanza grande per un marcatore punta fine) nel modello centrato sui fori.
  2. Impostare il modello sul fondo di un piatto di coltura del tessuto di 15 cm (diametro nominale di 14 cm) e segnare la posizione dei fori. Ripetere questa operazione su un secondo piatto.
  3. Con punte da trapano progettati per l'utilizzo su plastica, praticare sei fori di diametro di 1,5 cm su ogni piatto in una matrice esagonale (4,8 cm da centro a centro) con centri del foro 2,5 cm dal bordo del piatto. Eseguire tre fori (3 mm di diametro) 12 mm dal bordo che vengono inseriti equidistante tra due dei fori più grandi come mostrato in Figura 1A.
  4. Con i fondi di ogni piatto si fronteggiano, posizionare una vite di macchina lunga 2,5 pollici (3/16 di pollice di diametro) con una rondella piana attraverso uno dei fori piccoli seguiti da una seconda rondella piatta, un pezzo di polietilene tubi (distanziale, 4,7 cm), un'altra rondella piana , il secondo piatto di coltura del tessuto, un'altra rondella piana, una rondella e un dado.
  5. Ripetere il passaggio 1.4 sulle altre due viti di macchina e stringendo soltanto senza bloccare fino a quando tutte le viti di macchina sono a posto. Quindi serrare i dadi.
  6. Lavorare i gommini (5/16 pollici spessore, diametro foro 5/8 di pollice) nei fori del piatto inferiore per ottenere il tubo rullo finale rack (Figura 1B; indicato con due tubi in luogo). Collocare un adesivo su ogni rack con un numero univoco.

2. preparazione del rullo tubi e vetrini coprioggetti

  1. Rendendo la dima per la foratura in rullo tubi
    1. Praticare un foro di 1,5 cm profondità 8 cm sul lato del centro di un 2 x 4 x 5,5 pollici blocco di legno ad un angolo tale che il lato piatto del rullo tubo volontà essere quasi paralleli con il blocco quando inserito (Figura 2A).
    2. Allargare il foro utilizzando un file di legno tondo per ampliare sia il foro per consentire l'inserimento del tubo del cono (rullo tubi sono leggermente più grandi di diametro verso la fine di tappo) (Figura 2B).
    3. Praticare un foro verticale di diametro 1,5 cm, 5,5 cm dal lato del blocco e centrato sopra il foro laterale (Figura 2C).
    4. Quando il foro laterale è conico abbastanza, inserire un tubo del rullo che è segnato nel punto desiderato per centrare il foro per la fetta e posizionare il tubo così punto marcato è centrato nel foro verticale di 1,5 cm.
    5. Rimuovere il tubo e misurare la distanza dal posto all'estremità del tubo. Contrassegnare questa distanza dal centro del foro nell'attrezzatura e inserire un chiodo per fornire una fermata per posizionare correttamente il tubo per la perforazione (freccia in Figura 2C).
    6. Utilizzare un seghetto per tagliare l'unghia a filo con la superficie del blocco di legno per evitare lesioni.
    7. Aggiungere clip a molla sulla parte inferiore della dima se c'è una pressa di trivello con asole che permettono che sia ancorata (frecciaFigura 2D nero). In caso contrario, utilizzare C-morsetti per tenere la dima saldamente sulla pressa di trivello.
  2. Utilizzando la dima descritto sopra per tenere e posizionare un tubo di plastica cultura piatto parteggiato 11 cm con il lato piatto verso l'alto (Figura 2A), praticare un foro del diametro di 6 mm con il centro 1,0 cm dal fondo e centrato tra i lati del tubo.
    Nota: Deve essere utilizzato un trapano progettato per plastica.
  3. Con un utensile sbavatore girevole, smussare i bordi del foro (Figura 2E) e fare 4 scanalature all'interno bordo del foro (Figura 2E, inserto) per facilitare lo scarico del foro durante la rotazione.
  4. Con un foro di 12 mm punch, tagliare i dischi di diametro 12 mm da strati di gomma non tossico doppio ha parteggiato adesivo silicone. Utilizzando un pugno di carta un foro standard (6 mm di diametro), fare un buco al centro di ogni disco.
  5. Sciacquare i tubi forati con etanolo al 70%, aria asciugateli in un armadio, di sicurezza biologica e sterilizzare i tubi e i dischi adesivi punzonati per 40 minuti sotto la lampada UV (30 W a 70 cm di distanza media) in cappa di sicurezza biologica.
  6. Riposizionare i tubi e i dischi dopo 20 min, in modo che tutte le superfici esposte sono sterilizzate. In condizioni di sterilità, staccare la protezione bianca da un disco adesivo e apporre la gomma di silicone all'esterno di un tubo, allineando i fori (Figura 2F).
    Attenzione: Per evitare l'esposizione ai raggi UV, indossare occhiali di protezione e chiude il gabinetto prima di accendere la lampada UV.
  7. Pulire il vetro tedesco di lamelle di 12 mm diametro fotoincisioni (100 centro numerato 1 mm quadrati). Tenere i coprioggetti delicatamente con le pinzette e immergere in etanolo assoluto, seguita da acqua, seguita da etanolo assoluto nuovamente e infine immergere i vetrini coprioggetti in una fiamma di bruciare l'etanolo. Consentire le lamelle raffreddare.
  8. Tenendo i coprioggetti con il forcipe, immergere nel 2% 3-amminopropiltrietossisilano in acetone per 10 s. Sciacquare i vetrini coprioggetti con acqua ultrapura e lasciare asciugare all'aria.
  9. Impostare i coprioggetti su carta da filtro sterile all'interno di una sicurezza biologica cabinet e accendere il UV luce. Esporre ogni lato delle lamelle per 20 min.
    Attenzione: Per evitare l'esposizione ai raggi UV, indossare occhiali di protezione e chiude il gabinetto prima di accendere la lampada UV.

3. hippocampal fetta preparazione

  1. Prima di iniziare la dissezione, preparare metà di lame a doppio taglio di rasoio per l'elicottero di tessuto. Piegare le lame longitudinalmente accuratamente con le dita e spezzare a metà.
  2. Sciacquare le metà di lama con acetone, utilizzando un tampone di cotone per pulirli, seguito da un risciacquo in etanolo assoluto ed essiccazione all'aria.
Prima di montare una lama mezza sull'elicottero del tessuto, sterilizzarlo risciacquando con etanolo al 70%.
  • Seguire protocolli approvati dal istituzionale Animal Care e Comitato di uso; dopo l'anestesia isoflurano, eutanasia di un cucciolo di topo o ratto di 4-7 giorno vecchio di decapitazione e togliere la testa con forbici o a ghigliottina.
    Nota: Il protocollo di cultura fetta di cervello è indipendente di topo o ratto ceppo o genotipo. Sono state utilizzate molte linee di topi transgenici con diverso background genetico.
  • Sciacquare la testa con etanolo al 70% e metterlo in una capsula di Petri di 60 mm. Fino al montaggio finale della fetta del cervello sul tubo del rullo, tutte le seguenti operazioni vengono eseguite in una cappa a flusso laminare per mantenere la sterilità.
  • Utilizzando una lama chirurgica #21, fare un taglio sagittale attraverso la pelle e il cranio. Con un forcipe di Dumont #5, buccia indietro la pelle e il cranio per esporre il cervello.
  • Con pinze chiuse, delicatamente prendere in giro l'intero cervello, rilasciandolo pizzicando con il forcipe attraverso il tronco encefalico dietro il cervelletto. Mettere il cervello in un piatto di 60mm sterile contenente glucosio di Solution/0.5% sale bilanciato di 4 ° C Gey (GBSS/glucosio).
  • Usando un microscopio di dissezione per visualizzare il cervello (Figura 3A), inserire il lato dorsale del cervello verso l'alto e tagliare il terzo anteriore del cervello e il cervelletto con una lama chirurgica (Figura 3B).
    1. Con il forcipe, tenere il lato posteriore del profilato cervello fino e lato ventrale contro il lato del piatto Petri per la stabilità. Delicatamente prendere in giro lontano meninges intorno alla linea mediana sagittale e rimuovere il tessuto del midbrain utilizzando un forcipe Dumont #5 punta fine (Figura 3C, cerchio tratteggiato).
    2. Fare due tagli lungo il lato del cervello per la sua diffusione aperta (Figura 3C, linee tratteggiate). Una volta che il cervello è posto lato dorsale giù e diffusione aperta, la fessura hippocampal dovrebbe essere visibile (Figura 3D, freccia).
    3. Trasferire il cervello aperto di diffusione per un pezzo di pellicola plastica policlorotrifluoroetilene e posizionarlo per affettare sul palco di un elicottero di tessuto. Bagnate la lama con GBSS/glucosio e tritare l'ippocampo fette spesse ~ 300 µm.
    4. Con una pipetta di trasferimento, è necessario svuotare il cervello affettato fuori la pellicola di plastica in un piatto fresco 60 mm contenente GBSS/glucosio (Figura 3E). Delicatamente pizzico fuori e prendere in giro, con una pinzetta punta, le meningi rimanenti e altri tessuti non-ippocampale (Figura 3F) dalle fette (Figura 3G, H).

    • 4. placcatura fette

    1. Fette di una volta sono stati ottenuti, porre al centro del lato di fotoincisioni di un vetrino coprioggetto preparato 2 µ l di plasma di pollo. Diffondere il plasma leggermente per ottenere un posto di diametro di 3-4 mm.
      Nota: Il lato di fotoincisioni è il lato superiore del coprivetrino quando viene visto attraverso un microscopio di dissezione, tale che i numeri siano orientati correttamente.
    2. Trasferire 1 fetta di cervello con una spatola stretta-punta sterile (Figura 4A) al posto del plasma (Figura 4B). Utilizzare pinze chiuse per mantenere la fetta sulla punta spatola mentre si solleva la fetta dal GBSS/glucosio.
    3. Toccare la spatola al plasma spot sul vetrino coprioggetto e con una pinza chiusa, spingere la fetta sul vetrino coprioggetti.
    4. Mix 2,5 µ l di plasma con 2,5 µ l di trombina in un tubo separato. Inserire rapidamente 2,5 µ l di questa miscela sopra e intorno la fetta e dispensare su e giù delicatamente di mescolarla (Figura 4B).
      Nota: Il plasma sarà coagularsi entro 10-15 s, quindi questo deve essere fatto rapidamente. Se fetta adesione è un problema, mescolare 5 al plasma µ l con trombina di 5 µ l e usare 4-5 µ l sulla fetta, rimozione di alcuni dopo la miscelazione di modo che la fetta si trova pianamente sul vetrino coprioggetti.
    5. Rimuovere la plastica trasparente che copre dal lato esposto dell'adesivo di gomma del silicone precedentemente fissato al rullo di avvolgimento e porre il coprivetrino con la fetta di cervello sull'adesivo allineando la fetta all'interno del foro (Figura 4C).
    6. Per assicurare una adesione, morbido, applicare una pressione uniforme per il coprioggetto con il pollice premendo uniformemente il vetrino coprioggetto e tenendolo premuto per circa 1 min durante il trasferimento e la cappa di sicurezza biologica.
    7. In una cappa di sicurezza biologica, aggiungere 0,8 mL di terreno di coltura Neurobasal A completa (Tabella materiali) ad ogni provetta (Figura 4D).
    8. Flusso di una miscela di 5% CO295% aria attraverso una sterile pipetta Pasteur cotone-collegato saldamente da un morsetto. Lavare il tubo rullo con la miscela di gas e rapidamente richiudere la provetta, come si è ritirato da intorno la pipetta.
    9. Etichettare le provette con il numero di slice e numero di rack. Inserire tubi in un rack di rullo, garantendo che geometricamente sono equilibrati. Se c'è un numero dispari di tubi, aggiungere tubi per bilanciare.
    10. Posizionare le cremagliere in un incubatore a 35 ° C a rulli con rulli girando rack rullo a circa 10-13 RPH (Figura 4E). Per mantenere il mezzo nella parte inferiore dei tubi, inclinare l'incubatrice indietro di circa 5° sollevando la relativa parte anteriore su una tavola.
    11. Immettere il numero di sezione e il tubo su un foglio di calcolo, che viene utilizzato per registrare tutte le informazioni di fetta trattamenti e date di osservazione.
    12. Su circa giorno 6 nella cultura, aggiungere 1 µ l (0.002 U) di plasmina attiva in ogni provetta.
    13. Dopo la formazione di coaguli sciogliere completamente (di solito entro poche ore), rimuovere il mezzo e sostituirlo con medium fresco senza plasmina. Se necessario, fette possono essere incubate con plasmina durante la notte e il mezzo ha cambiato il giorno successivo.
    14. Fette di solito vengono incubate per almeno 7-10 giorni prima dell'uso in esperimenti. Medio di aspirare e sostituirlo il giorno 3 o 4, ancora una volta il giorno 7 e successivamente ogni 7 giorni.

    5. preparazione di vettori virali per l'espressione del Transgene

    Nota: Espressione dei transgeni in neuroni di culture della fetta si ottiene utilizzando cervelli da roditori geneticamente o introducendo il transgene da infezione con virus carenti replica ricombinante.Gli adenovirus (AV), virus adeno-associato (AAV) e vettori lentivirus ricombinanti sono stati utilizzati nelle nostre culture hippocampal fetta per espressione di chimere differenti della proteina fluorescente nelle fette del cervello.

    1. Preparare la replica carenti AV per esprimere il RNA di interesse secondo i metodi descritti altrove13,14. Titolo i virus per infettive U/mL con il metodo di diluizione seriale utilizza un anticorpo ad una proteina virale espressa come descritto14. Per osservare cofilina aggregati e formazione di rod cofilina-actina, utilizzano la cofilina-R21Q-mRFP cDNA (plasmide #51279)16.
      Nota: Il promotore della sinapsina 1 è una scelta eccellente per un neurone specifico espressione15, considerando che il promotore del citomegalovirus è utile per guidare i livelli di alta espressione in molti tipi di cella13.
    2. Preparare AAV co-transfezione di trasferimento del plasmide contenente il gene di interesse e un plasmide rep/cap, con o senza un plasmide helper, in cellule HEK293 imballaggio, che forniscono il gene virale E1, come descritto in precedenza17,18.
      Nota: AAV ricombinante realizzabile anche per l'inserimento mirato nel genoma delle cellule host19. Per il plasmide di trasferimento, usiamo umano cofilina 1 con un C-terminale mRFP1 fluorescenza della proteina tag (plasmide #50856) clonato in un sinapsina contenenti promotore AAV plasmide a valle dal calcio sensore GCaMP5G20. Un pezzo di DNA codificante la sequenza del peptide self-che fende P2A è inserito da PCR tra GCaMP5G e cofilina-RFP durante la preparazione del plasmide trasferimento per offrire un'espressività di entrambe le proteine da un singolo AAV trascrizione21.
    3. Preparare i vettori ricombinanti lentivirus di co-trasfezione del plasmide di trasferimento contenente il gene o cDNA dei segnali di interesse e integrazione, insieme a un terza generazione dei lentivirus imballaggio miscela che divide il virali gag, pol, rev e geni vsv-g sul tre plasmidi separati22,23.
    4. Per il plasmide di trasferimento, utilizzare un solo passo clonazione sistema24 per assemblare il promotore della sinapsina e cofilina-R21Q-mRFP cDNA (dal plasmide #51279) in pLKO.1-GFP (plasmide #30323), con il promotore della sinapsina e cofilina-R21Q-mRFP sostituendo la hPGK promotore e cDNA GFP, rispettivamente.
    5. Transfect il plasmide finale nelle cellule HEK293T dal fosfato di calcio come descritto in precedenza23.
    6. Raccogliere medio da quattro piatti di 10cm, concentrarsi a 500 µ l utilizzando concentratori centrifughi 150K-cutoff e memorizzare il lentivirus finale a-80 ° C in piccole aliquote dopo il congelamento rapido in azoto liquido. Scongelare un'aliquota solo una volta per infettare altre cellule.
    7. Determinare empiricamente che il volume di ogni tipo di virus pronti a raggiungere il grado di espressione desiderato impostando un numero di sezione diversa culture per seguire l'espressione dei transgeni dopo l'infezione con i vari volumi del virus.
      Nota: In genere, 1-10 µ l di virus viene utilizzato per fetta.

    6. fetta trattamenti

    1. Fette d'infezione con virus
      1. Lavorando in una cappa di sicurezza biologica approvato per il lavoro di virus a livello di sicurezza biologica, appropriato per il vettore, mescolare una parte aliquota del virus (solitamente 1-10 µ l) di 0,8 mL di terreno completo.
      2. Aspirare il mezzo dalla sezione utilizzando una pipetta Pasteur sterile in una trappola di raccolta contenente candeggina. Una trappola secondaria viene sempre utilizzata tra la prima trappola e fonte di vuoto.
      3. Sostituire questo mezzo con l'aliquota contenenti virus preparato in precedenza, restituire le provette di coltura ad un rack e collocare nell'incubatrice.
      4. Dopo 2-5 giorni di incubazione le fette con il virus in cappa di sicurezza biologica, rimuovere il supporto contenente virus con una pipetta sterile e metterlo in una bottiglia contenente un agente antivirale approvato per uccidere il virus.
    2. La macchiatura dei neuroni con colorante vitale
      1. Preparare e conservare le aliquote di colorante vitale neuronale fluorescente25 µ l 4 congelamento rapido delle aliquote in azoto liquido ad una concentrazione di 100 µM e memorizzare questi a-20 ° C. Non congela/scongela il colorante più di una volta.
      2. Per etichettare i neuroni per la visualizzazione mediante microscopia a fluorescenza, scongelare un'aliquota del colorante vitale neuronale e diluire a 4 mL di terreno Neurobasal completo (concentrazione finale di tintura è di 100 nM).
      3. Rimuovere il mezzo da fette di aspirazione (o con una pipetta di trasferimento se il supporto contiene virus) e sostituirlo con 0,8 mL di terreno contenente colorante vitale neuronale di 100 nM. Restituire le fette all'apparato rullo nell'incubatrice.
      4. Dopo incubazione le fette per 2 h, aspirare il mezzo contenente colorante e sostituirlo con 0,8 mL di terreno nuovo completo in una cappa di sicurezza biologica.
        Nota: Etichettatura dei neuroni a fette con colorante vitale richiede diverse ore di incubazione. Le prime immagini sono di solito prese 24 h dopo il trattamento colorante. Anche se i neuroni sono etichettati in modo specifico, non c'è fluorescenza di fondo che si declina in 2-3 giorni per dare il meglio di un neurone imaging. Intensità del colorante vitale declina dopo 72 h.
      5. Per seguire i cambiamenti nella morfologia fetta nel corso del tempo, rietichettare le fette ogni 7 giorni.

    7. fetta Imaging

    1. Mostra fette su un microscopio invertito. Per l'imaging di fluorescenza più brillanti, a 24 h prima di formazione immagine, cambio di terreno di coltura con terreno Neurobasal A completo senza l'indicatore di pH rosso fenolo.
      Nota: Per gli esperimenti riferiti qui, fette vengono visualizzati su un microscopio a fluorescenza confocale invertito filatura disco dotato di un lineare codificato x, y fase con controllo z piezo e una fotocamera digitale ad alta risoluzione sensibile.
    2. Trasferire il tubo con la fetta di cultura essere imaged dall'apparato di tubo a rulli per il supporto di tubo su misura (Figura 5A), che viene inserito nella scheda di fase (Figura 5B), per mantenere il coprioggetto perpendicolare alla L'obiettivo e mantenere la fetta nello stesso orientamento durante le sessioni di formazione immagine ripetitive per lunghi intervalli di tempo.
    3. Innestare il dispositivo di scorrimento sulla fase stretto contro il tubo per tenere il tubo in posizione (Figura 5B).
    Mantenere fetta temperatura 35 ° C durante la formazione immagine di uso di riscaldamento strisce e un controller termoregolatorio integrato nell'adattatore su misura fase (Figura 5C).
    Nota: Dettagli di fissaggio del tubo, tappa adattatore e riscaldatore può essere letta in: https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/.
  • Utilizzando una bassa potenza (ad es., 4x) obiettivo e la transilluminazione del campo luminoso, concentrarsi sul modello di griglia di fotoincisioni (Figura 6A) sotto la fetta. Per la prima sessione di imaging, analizzare rapidamente intorno la fetta per individuare e registrare il numero per le varie regioni dove la formazione immagine ingrandimento superiore è desiderata (ad es., cornu ammonis (CA) 1, CA3, giro dentato (DG), ecc.).
  • Spostare il palco per la prima Piazza della griglia contenente una regione di interesse. Passare a 20x obiettivo aria e individuare un marchio fiducial (ad es., suggerimento di un numero inciso) (Figura 6B).
  • Passare a un obiettivo di potenza più elevato (40 X o 60 X), localizzare il fiducial mark e allora record la x e la posizione y del palco. Spostare il palco per trovare i campo o i campi di interesse nelle vicinanze e registrare loro x e y offset dal marchio fiducial (Figura 6B, freccia). Ripetere in altre aree della griglia.
    Nota: Queste posizioni Disassata da mark fiducial consentono coerente individuazione della stessa posizione coprioggetto quando la fetta è immaginata, anche se l'originale x, y impostazione del marchio fiducial cambia quando l'adattatore tubo o fase sono rimossi e sostituiti.
  • Catturare un'immagine dello stack Z all'interno di ogni campo selezionato utilizzando il controllo obiettivo del microscopio o una fase di controllo di piezo, se disponibile.
    Nota: Piani di immagine sono ottenuti solitamente a intervalli di 0,5 µm a 2 µm, secondo il formato e la risoluzione desiderata delle caratteristiche immagine. Creazione di un'immagine 3D di qualità richiede che caratteristiche dell'immagine si estendono su più piani di acquisizione, e quindi per visualizzare caratteristiche minori, intervalli più piccoli sono necessari tra i piani.
  • Mantenere il totale imaging tempo per ogni fetta più breve possibile.
    Nota: La maggior parte delle sessioni di formazione immagine segnalato qui erano sotto 18 min/fetta. Tuttavia, noi abbiamo ripreso alcune fette di dieci o più volte e anche come lungo come 40 min in un'unica sessione, senza apparente danno la sopravvivenza a lungo termine della fetta.

    • Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Results

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Per determinare con precisione come fiducial contrassegni possono essere utilizzati per creare una nuova immagine delle stesse cellule all'interno dei campi stessi nel corso del tempo, abbiamo esaminato fette coltivate su vetrini coprioggetti fotoincisioni (Figura 6A). I neuroni sono stati visualizzati tramite colorazione con un colorante vitale (100 nM per 2 h; non macchia le cellule non neuronali), che scompare da neuroni nel tempo senza da...

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    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Il metodo del tubo rullo descritto qui consente la coltura a lungo termine e di imaging ad alta risoluzione dal vivo del tessuto di cervello affettato. Un grosso problema con la tecnica di fetta come applicato qui è nel montaggio e manutenzione delle fette. Rivestimenti di vetrino coprioggetto che supportano fetta adesione, promuovere la fetta assottigliamento migliorando la conseguenza dei neurites e migrazione delle cellule fuori la fetta; così, abbiamo evitato l'uso di questi substrati. L'inserimento di gruppi amminic...

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    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    Fondi da piastre di coltura da 15 cmVWR Scientific25384-326
    Viti a macchina con testa a croce (#10-32)Ace Hardware2,5" di lunghezza e 3/16" di diametro
    Rondelle piatte #10ACE Hardware
    Vite a macchina (#10-32)Occhielli in gomma ACE Hardware
     Ferramenta5/16", spessore; 5/8", diametro foro; 1.125", diametro esterno
    tubo in polietilene (5/16"; OD, 3/16"; ID)ACE HardwareTagliato a 1,8 "di lunghezza
    Rondella di sicurezza # 10ACE Hardware
    Trapano a colonna, 5 velocità Ace HardwareProTech Modello 1201
    Nunclon Delta Tubi a lato piatto VWR62407-076
    Punte da trapano, 3 mm, 6 mm e 15 mm Ace HardwareDiablo marca freudPunte da trapano per il taglio della plastica.
    Ace Hardware1,5 cm e 1 mm
    Ace Harwarerotonde da 1/4",
    utensile per sbavatura con testa girevole
    (Secure Seal)Grace Bio-Labs666581spessore 0,5 mm
    Perforatrice da 6 mmOffice Perforatrice Max
    da 12 mmthepunchbunch.com
    70% etanolo
    , diametro 12 mmBellco Glass, Inc.1916-91012
    Bruciatore
    Etanolo Assoluto Acqua
    Nanopura
    3-amminopropiltrietossilanoSigma-AldrichA3648
    AcetoneSigma-Aldrich179124
    #5 Dumont ForcipeStrumenti di Fine Science11251-30
    Tritatutto McIlwain TedPella, Inc.10180
    Lame di rasoio a doppio taglioTed Pella, Inc.121-6
    Carta da filtro WhatmanVWR28450-182Tagliata in cerchi di 5,8 cm di diametro
    Poli-cloro-trifluoro-etilene (Aclar)Ted Pella, Inc.10501-10Tagliare in cerchi di 5,8 cm di diametro
    #21 Lama chirurgicaVWR Scientific25860-144
    #5 Dumont ForcepsFine Science Tools11251-30
    Spatola, acciaio inossidabile con estremità conicaVWR82027-518
    Soluzione salina bilanciata di GeySigma-AldrichG9779 
      GlucosioThermoFisher Scientific15023-02125% (p/v), filtro da 0,2 mm sterilizzato
    Plasma di polloCocalico Biologicals30-0300-5LReidratare in acqua sterile, centrifugare a 2500 x g 30 min a 4 ° C, congelare rapidamente le aliquote in azoto liquido e conservarle -80 °C.
    Trombina, topica (bovina)PfizerThrombin-JMIAliquote di congelamento rapido in azoto liquido a 1.000 unità internazionali/mL in diluente fornito e conservare a -80 °C. Utilizzare a 250 unità/mL.
    Sistema di rulli cellulariBellco BiotechSciERA
    Incubatore a rulliForma Modello3956
    N21-MAXThermoFisher ScientificAR008
    Pen/Strep (100X)ThermoFisher Scientific15140122
    200 mM GlutamminaThermoFisher Scientific25030081
    glucosioThermoFisher Scientific15023-021Soluzione al 25% (p/v), filtro da 0,2 mm sterilizzato
    Neurobasal AThermoFisher Scientific10888-022 Terreno completo: 48 mL di Neurobasal A, 1 mL di N21-MAX, 0,625 mL di 200 mM di glutammina, 0,180 mL di glucosio al 25%, 0,250 mL di penne/streptococco 100x.
    Packaging lentivirus di terza generazioneLife TechnologiesK4975-00
    159 K cutoff filtri centrifughi (Centricon)EMD Millipore
    Sistema di clonazione lentivirale (InFusion)Clonetech
    Plasmids 30323, 50856, 51279Addgene
    Colorante per la vitalità delle cellule neuronali (NeuO)Tecnologie delle cellule staminali1801Scongelare una volta e congelare rapidamente in 4 µ L aliquote. Conservare a -20 ° C
    Microscopio invertitoOlympusIX83
    Obiettivi per microscopioOlympusaria: 4X, 20; olio: 40X, 60X,
    sistema confocale a disco rotanteYokagawaCSU22
    Microscopio Fotocamera EMCCDFotometriaCascade II
    Lineare codificato (x,y), piezoelettrico z stadio superiore piattoASI
    Laser per microscopi e integrazioneInnovazioni
    HEK293T celluleCollezione di colture di tipo americanoCRL-3216
    Plasmina umanaSigma AldrichP18670,002 U/mL in albumina sierica bovina allo 0,1% (filtro sterilizzato da 0,2 mm), congelamento rapido in azoto liquido e conservazione a -80 °C.
    ACE Punte da trapano per legno, lima per legno da , clip a molla Ace Hardware da 16 mm, foglio adesivo in silicone Ace Hardware 26307 da 5" vetrini coprioggetti fototecnologici al Bunsen Soluzione al di imaging intelligente

    References

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