Multiplex Cytokine Profilatura degli Splenocytes stimolati Mouse utilizzando una piattaforma basata su Cytometric Bead Immunoassay

Summary

Questo protocollo descrive la quantificazione degli obiettivi di citochina multipli simultaneamente in surnatanti di coltura del tessuto raccolti da splenocytes stimolati del mouse utilizzando la piattaforma di base di immunoassay perlina multiplex e un citometro a flusso.

Abstract

Test immunologici basati su tallone impiegano lo stesso principio di base come immunodosaggi panino. Catturare le perline, che possono essere differenziati dalle dimensioni e intensità di fluorescenza interno allophycocyanin (APC), sono coniugati di anticorpi specifici per un particolare analita. Successivamente, un gruppo selezionato di acquisizione definita perla set viene incubato con un campione biologico contenente destinazione analiti specifici per gli anticorpi di cattura. Viene aggiunto un anticorpo di rilevazione biotinilati cocktail, che conduce alla formazione di panini tallone-analita-rilevazione dell'anticorpo di cattura.

Infine, viene aggiunto streptavidina-ficoeritrina (SA-PE), che si lega agli anticorpi biotinilati rilevamento fornendo le intensità del segnale fluorescente in proporzione alla quantità di analita associato. Il PE fluorescente segnale delle regioni di analita specifico perline è quantificato mediante citometria a flusso, e le concentrazioni degli analiti particolare sono determinate utilizzando software di analisi dati e la curva standard generati nel dosaggio.

In questo esperimento, usiamo un pannello di citochina del mouse T helper contemporaneamente quantificare la concentrazione di 13 separata citochina target in surnatanti di coltura del tessuto raccolti da splenocytes del topo coltivate in varie condizioni di stimolatori.

Introduction

Nel loro ruolo di molecole di segnalazione solubile, citochine mediano i processi altamente coordinati e multifattoriali che governano la risposta immunologica dell'ospite. Essi sono espressi durante tutte le fasi del processo infiammatorio, da iniziazione alla risoluzione e regolano una rete complessa interazione che include la propria sintesi e quella dei loro recettori cellulari¹. Questa rete di comunicazione è a strati con una complessità che va oltre i rapporti sinergici o antagonistici che possono esistere tra i singoli componenti. Infatti, molte citochine sono conosciute per condividere funzioni ridondanti o almeno parzialmente sovrapposti^2,3.

Approcci di biologia dei sistemi integrati che quantificare contemporaneamente più citochina analiti sono attualmente forniscono una comprensione sempre più completa dell'unica cytokinomes che orchestrano le risposte immunitarie più malattia di fondo dichiara^4,5. Questi stati di malattia variano da infiammazione generalizzata a cancro, patologie neuro-degenerative e malattia cardiovascolare^6,7,8,9.

Tali reti di citochina possono essere interrogati in modo efficace utilizzando LEGENDplex basati su tallone immunoassays. Queste analisi sono basate sullo stesso principio come il panino Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) e utilizzano microsfere di fluorescenza codificato con legame covalente alla loro superficie gli anticorpi di cattura. Questi anticorpi sono immobilizzati su superfici molto più piccole rispetto a quelle richieste dai tradizionali formati di ELISA. In questo modo tali dosaggi essere eseguita con molto meno volume di campione, mentre allo stesso tempo riducendo non specifiche vincolanti e fornendo multiplexed analisi di diversi analiti.

Il test descritto in questo protocollo utilizza questa tecnologia per quantificare fino a 13 obiettivi simultaneamente. I dati da questo test possono essere ottenuti utilizzando una vasta gamma di citometri a flusso comunemente disponibili e a differenza di altri dosaggi disponibili non richiedono l'uso di strumentazione di analisi specifica dedicata. Con un catalogo di espansione di analita convalidato pannelli, queste analisi sono state utilizzate nella ricerca biomedica in corso diversi progetti^10,11,12,13.

Per dimostrare la facilità e l'utilità del formato saggio, in questo esperimento che usiamo un pannello di citochina Mouse T helper per quantificare 13 separare concentrazioni di citochina da surnatanti di coltura del tessuto ottenuti da splenocytes del topo coltivate sotto multiplo condizioni di stimolatori. Oltre a surnatanti di coltura del tessuto, questa analisi può essere eseguita anche utilizzando campioni di siero o plasma.

Protocol

tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le raccomandazioni di NIH contenute all'interno della Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio e sono stati approvati dal IACUC presso BioLegend.

Figura 1: filtro piatto dosaggio procedura riepilogo. Il protocollo per eseguire il dosaggio utilizzando piastre filtranti è rappresentato come un diagramma raffigurante chiave dosaggio componenti e fasi di incubazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. preparazione del campione biologico

Nota: il sito anatomico prescelto e il volume della raccolta del sangue è lasciata alla discrezione di ogni singolo ricercatore e non influiranno sul risultato del test. Tuttavia, una volta che sono ottenuti, i campioni devono essere smaltiti secondo i passaggi elencati di seguito.

1. Preparazione di campioni di siero
   1. raccogliere il volume di sangue in provetta di raccolta preferita e lasciarlo coagulare per almeno 30 min.
   2. Centrifugare il campione per 10 min a 1.000 x g e a temperatura ambiente.
   3. Rimuovere siero e dosaggio immediatamente o aliquota in polipropilene per microcentrifuga e conservare i campioni a ≤ -20 ° C.
2. Preparazione di campioni di Plasma
   1. raccogliere il volume di sangue utilizzando acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) rivestito provette per prelievo ematico.
   2. Centrifuga per 10 min a 1.000 x g e a temperatura ambiente entro 30 min di collezione.
   3. Rimuovere il plasma e dosaggio immediatamente o aliquota in polipropilene per microcentrifuga e conservare i campioni a ≤ -20 ° C.
3. Preparazione dei campioni supernatante di coltura del tessuto
   1. Centrifugare il campione per 10 min a 1.500 x g a 4 ° C per rimuovere le cellule e i detriti.
   2. Raccogliere il surnatante e dosaggio immediatamente o aliquota in polipropilene per microcentrifuga e conservare a ≤ -20 ° C.
4. Lo scongelamento di congelati campioni biologici
   1. scongelare completamente eventuali campioni biologici precedentemente congelati su ghiaccio e vortex brevemente prima dell'uso. Evitare più di 2 cicli di congelamento/scongelamento.
      Nota: I campioni utilizzati in questo protocollo sono stati ottenuti coltivando splenocytes del topo BALB/c (1 x 10 ⁶ cellule a 37 ° C + 5% CO ₂ in varie condizioni: stimolate, LPS (100 ng/mL), αCD3 (1 µ g/mL-rivestita) + αCD28 (1 µ g/mL solubile), PMA (20 ng/mL) + ionomicina (500 ng/mL). Surnatanti sono stati raccolti dopo 48 h e trattati come descritto nella sezione 1.3.

2. Preparazione dei reagenti

1. Preparation of Pre-mixed Antibody-Immobilized perle
   1. Sonicate premiscelati perline bottiglia per 1 min in un bagno sonicatore a temperatura ambiente e poi vortice per 30 prima di s da utilizzare. Se nessun bagno sonicatore è disponibile, aumentare il tempo di vortice per 1 min.
2. Preparazione del tampone di lavaggio
   1. portare il 20x tampone di lavaggio (20x PBS con 1% Tween-20) fornito con il kit a temperatura ambiente e mescolare nel vortex per portare tutti i sali in soluzione.
   2. Diluire 25 mL di tampone di lavaggio con 475 mL di acqua deionizzata: 20x. Parte inutilizzata del negozio tra 2 ° C e 8 ° C fino ad un mese.
3. Preparazione della matrice B (per l'uso con siero e Plasma campioni solo)
   1. aggiungere 5,0 mL di tampone (PBS con 1% BSA) incluso nel kit per il flacone contenente il liofilizzato Matrix B. Consenti almeno 15 min per reconst completa ituation, poi vortice per mescolare bene. Avanzi B Matrix ricostituita può essere conservata a ≤-70 ° C fino ad un mese.

3. Preparazione standard

Nota: ciascun analita in questo pannello ha una concentrazione di standard superiore di 10.000 pg/mL.

1. Aggiungere 250 µ l di tampone di dosaggio per ricostituire il liofilizzato Mouse Th citochina Standard Cocktail. Mescolare nel Vortex brevemente e lasciare riposare il flaconcino a riposare a temperatura ambiente per 10 min.
2. Trasferire il cocktail standard ad un tubo del microcentrifuge in polipropilene etichettato " C7 ". Questo verrà utilizzato come parte superiore standard.
3. Etichetta 6 microcentrifuga in polipropilene come C1, C2, C3, C4, C5 e C6.
4. Aggiungere 75 µ l di tampone di dosaggio a ciascuno di questi tubi.
5. Trasferire 25 µ l del top standard C7 C6 tubo e mescolare bene di Vortex. Questo sarà lo standard C6.
6. Continua esecuzione seriale diluizioni 1:4 utilizzando una pipetta nuova punta per ogni provetta aggiungere 25 µ l di standard precedente al 75 µ l di tampone di dosaggio nel successivo più basso tubo standard seguito nel Vortex per ottenere norme C5, C4, C3 , C1 e C2. Utilizzare il tampone del saggio come standard 0 pg/mL (C0).

4. Diluizione di esempio

Nota: esperimenti pilota preliminari usando questa analisi con diluizioni multiple possono essere richiesti per determinare il fattore di diluizione più appropriato per un particolare set di campioni biologici. Un fattore di diluizione corretta produrrà calcoli di concentrazione per l'esempio che si trovano all'interno dei limiti della curva standard. I passaggi seguenti sono da intendersi come linee guida e potrebbe essere necessario essere determinata empiricamente a seconda del tipo di campione.

1. Diluire siero o plasma campioni 2 volte con tampone di dosaggio (ad es. Diluire 50 µ l di campione con 50 µ l di tampone del saggio) in polipropilene per microcentrifuga.
   Nota: Se è necessarie ulteriori diluizione del campione, diluizioni devono essere eseguite con matrice B invece di tampone per garantire misure accurate. Aggiungendo i campioni di siero o plasma senza diluizione si tradurrà in accuratezza basso dosaggio e possono ostruire la piastrina filtro. Matrice B è composto da siero di topo in pool impoverito di obiettivi di analisi endogena. Utilizzarlo come un campione di siero o plasma diluente per evitare effetti di matrice, che sono conosciuti per la sensibilità analitica di effetto di test immunodiagnostici.
Il campioni surnatante cultura senza diluizione di celle
2. test.
   Nota: I livelli di analita possono variare notevolmente da campione a campione. Se necessario, diluire i campioni surnatante usando una preparazione fresca del loro terreno di coltura cellulare corrispondente o tampone.

5. Procedura di analisi

Nota: il dosaggio può essere effettuato in piastre filtranti in polipropilene, tubi micro FACS o piastre microtiter fondo V. La procedura del dosaggio piastra filtro è consigliata per buono campione a campione, coerenza, test di robustezza e maneggevolezza. Questa procedura richiede un'unità di filtrazione sotto vuoto per il lavaggio (fornito dall'utente finale).

1. Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente (20-25 ° C) prima dell'uso.
2. Insieme la piastrina filtro sulla copertina di un piastra capovolta in ogni momento durante la procedura di installazione e incubazione di dosaggio, affinché il fondo del piatto non toccare le superfici come può causare perdite.
3. Tenere la piastra in posizione verticale durante la procedura di dosaggio intero, comprese le fasi di lavaggio, per evitare di perdere perle.
4. Tenere la piastra in scuro o avvolto con carta stagnola per tutte le fasi di incubazione.
5. Eseguire tutti gli standard ed i campioni come duplicati, disposti sul piatto in un ordine sequenziale.
6. Pre-bagnato la piastrina filtro aggiungendo 100 µ l di tampone di lavaggio 1X in ciascun pozzetto e lasciare riposare per 1 minuto a temperatura ambiente (se si utilizza il filtro-fondo micropiastre).
7. Volume di tampone di rimuovere utilizzando il collettore del vuoto (5-10 s). Non superare i 10 " Hg di vuoto. Lavaggio in eccesso della macchia Del buffer dalla parte inferiore della piastra premendo la piastra su una pila di asciugamani di carta pulita. Posizionare la piastra sopra il coperchio piastra capovolta.
   Nota: Passaggi 5.1-5.2 possono essere omesso se il dosaggio utilizzando un fondo V micropiastra o micro tubi di FACS.
8. Per campioni supernatante di coltura di cellule, aggiungere 25 µ l di tampone ai pozzetti. Aggiungere 25 µ l di ogni standard ai pozzetti standard. Aggiungere 25 µ l di ogni campione per pozzetti.
9. Per la misurazione di campioni di siero o plasma, aggiungere 25 µ l di matrice B pozzetti standard. Aggiungere 25 µ l di tampone ai pozzetti. Aggiungere 25 µ l di ogni standard ai pozzetti standard. Aggiungere 25 µ l di ogni campione di plasma o siero diluito per pozzetti.
10. Vortice misto Perline per 30 s. aggiungere 25 µ l di perline miste in ciascun pozzetto, scuotendo la bottiglia di perlina a intermittenza per evitare perlina sedimentazione. Il volume finale dovrebbe essere 75 µ l in ogni pozzetto dopo l'aggiunta di perline.
11. Sigillare la piastra con un foglio sigillante. Avvolgere l'intera piastra, compresa la copertina di piastra capovolta, con foglio di alluminio. Collocare la piastra su un agitatore per piastre, fissarlo e agitare a circa 500 giri/min per 2 h a temperatura ambiente. Onde per evitare perdite, non applicare pressione positiva per il copripiastra.
12. Senza invertire, posizionare la piastra sul collettore di aspirazione e applicare il vuoto come prima e aggiungere 200 µ l di tampone di lavaggio 1X in ciascun pozzetto.
13. Rimuovere il contenuto dei pozzetti della piastra dosaggio di filtrazione sotto vuoto. Asciugare il tampone di lavaggio in eccesso dalla parte inferiore della piastra con un tampone assorbente o carta assorbente. Ripetere questo passaggio un'altra volta.
    Nota: Se il test viene fatto utilizzando un fondo V e FACS per micropiastre o micro tubi Salta passaggi 5.12 e 5.13. Invece Centrifugare la piastra a 1.000 x g per 5 min a temperatura ambiente, quindi rimuovere il surnatante con una pipetta multicanale.
14. Aggiungere 25 µ l di anticorpi di rilevamento (Vedi la tabella materiali) in ciascun pozzetto.
15. Sigillare la piastra con un foglio sigillante fresco. Avvolgere l'intera piastra, compresa la copertina di piastra capovolta, con foglio di alluminio.
16. Collocare la piastra su un agitatore per piastre e agitare a circa 500 giri/min per 1 h a temperatura ambiente.
17. Senza aspirare, aggiungere 25 µ l di reagente di SA-PE direttamente a ciascun pozzetto. Nessuna diluizione del reagente è necessaria.
18. Sigillare la piastra con un foglio sigillante fresco. Avvolgere l'intera piastra, compresa la copertina di piastra capovolta, con foglio di alluminio.
19. Collocare la piastra su un agitatore per piastre e agitare a circa 500 giri/min per 30 min a temperatura ambiente.
20. Ripetere il punto 5.13 sopra.
Beh
21. aggiungere 200 µ l di tampone di lavaggio di ciascuno: 1x. Risospendere le perline su un agitatore per piastre per 1 min.
22. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire campioni dalla piastra filtro ai tubi di FACS per leggere i campioni su un citometro a flusso.
    Nota: Volume del campione può essere aumentato da 200 µ l a 300 µ l con l'aggiunta di un extra 100 µ l di tampone di lavaggio 1X in ogni provetta per evitare il funzionamento a secco di campione. Se necessari campioni possono essere conservati a 4 ° C al riparo dalla luce e analizzato il giorno seguente. Tuttavia, conservazione dei campioni prolungata può portare a ridotta segnale.

6. Set-up Cytometer di flusso

Nota: al fine di generare dati affidabili, il citometro a flusso deve essere impostato correttamente prima di acquisizione dati. Questo processo può variare per i singoli utenti in alcuni saluti a seconda della configurazione dello strumento particolare, su che il test viene fatto. Un processo di installazione generalizzata per un citometro in grado di misurare PE e APC e attrezzato con entrambi un laser di 488 e 633 nm viene illustrato di seguito.

1. Avviare il software di acquisizione e citometro a flusso secondo il produttore ' s istruzioni fornite con lo strumento.
2. Crea una stampa di puntino con FSC (forward scatter) sull'asse x e SSC (dispersione laterale) per l'asse y. Impostato sulla modalità lineare FSC e SSC.
3. Crea una seconda stampa di puntino con PE l'ascissa e l'APC per l'asse y. Questa trama deve essere impostata su una modalità di visualizzazione basato su log.
4. Vortex il flaconcino di crudi perline inclusi nel kit per 30 s per risospendere le perline. Queste sfere contengono un colorante APC interno e sono costituite da due popolazioni di dimensioni.
5. Trasferire 400 µ l dei branelli crudi ad un nuovo tubo di FACS.
6. Impostare il tasso di flusso cytometer di flusso basso.
7. Eseguire le perline crude, attentamente regolando il guadagno e la tensione per FSC e SSC affinché entrambe le popolazioni di dimensioni di queste perle sono visibilmente separati e facile al cancello.
8. Regolare la soglia FSC per escludere gli eventi indesiderati (cioè detriti o aria bolle).
9. Plot in the FSC e SSC, disegnare un cancello che include tutte le popolazioni del branello.
   Nota: Le perle di crude contengono due popolazioni di dimensioni di perline, il più piccolo " branelli " e il più grande " della perla B " regioni.
10. Visualizzare le popolazioni di perlina gestita dal plot FSC e SSC sulla trama del seconda punto con PE l'ascissa e l'APC per l'asse y.
11. Regolare la tensione PMT per il canale di fluorescenza di APC, in modo che il segnale APC per tutte le popolazioni del branello ha un'intensità di fluorescenza media (MFI) che si trova tra 1 x 10 ¹ e 5 x 10 ³.
12. Vortex il flaconcino dell'installazione PE perline per 30 s per risospendere i branelli.
13. Trasferire 400 µ l del PE perle ad un nuovo tubo di FACS.
14. Sostituire le perline raw tube dal citometro a flusso con il PE perline tubo.
15. Regolare la tensione di fotomoltiplicatore (PMT) tubo per il PE fluorescenza canale impostazione in modo che l'IFM di perline PE cade tra la gamma di lotto trovata elencati sul flacone perline PE.
    Nota: Le perle di installazione PE contengono perle di dimensioni di una popolazione (" branelli " solo).

7. Acquisizione dati

Nota: le procedure esatte associate all'acquisizione di dati su un determinato strumento può variare e dipendono il citometro ' s configurazione specifiche e il software di interfaccia utilizzata. Le istruzioni riportate di seguito sono pertanto destinate per evidenziare i passaggi necessari da adottare nell'analisi indipendentemente il citometro impiegato nel dosaggio.

1. Verificare la portata del citometro è ancora impostata su basso.
2. Impostare il numero di eventi di tallone per essere acquisita a circa 300 all'analita. Per un 13-plex pannello questo equivale all'acquisizione di 3.900 eventi combinati da entrambe le popolazioni dimensioni di perle (perle di A + B).
3. Vortex ciascun campione per 5 s prima dell'analisi.
4. Lettura campioni. Durante la lettura di campioni, innanzitutto impostare il citometro a flusso alla modalità di installazione e attendere che popolazione tallone si stabilizzi prima di passare alla modalità acquisizione.
5. Utilizzare nomi semplici con numerazione consecutiva per i file di dati per facilitare l'analisi dei dati.
6. Esportare solo gli eventi con cancello (A + B perlina regioni) piuttosto che eventi totali.
7. Memorizzare tutti i FCS file nella stessa cartella per ogni dosaggio. Se in esecuzione saggi multipli, creare una cartella separata per ogni dosaggio.

< classe p= "jove_title" > 8. Procedere all'analisi dei dati

Nota: file il FCS generati sul citofluorimetro dovrebbero essere analizzati utilizzando il software di analisi di dati, che può essere scaricato gratuitamente ¹⁴.

1. Installare il software di analisi di dati su un PC.
2. Trasferire tutti i file di test FCS al computer che contiene il software di analisi.
3. Collegare il dongle chiave di licenza (incluso nel kit) in una porta USB del computer.
4. Avviare il software di analisi dati.
5. Scegliere il blu " Aggiungi file " pulsante situato nella parte superiore dello schermo.
6. Passare alla cartella che contiene i file di FCS del dosaggio nella pop-up finestra che appare.
7. Fare clic e trascinare tutti i file di test FCS dalla finestra pop-up per la visualizzazione di software. Ora dovrebbero essere visualizzati tutti i file in un elenco.
8. Scegliere il verde " prossimo " pulsante in basso a destra del display. Fare clic e tenere premuto per trascinare il piccolo blu curva standard tasti (C7 a C0) ai loro file FCS corrispondenti dall'elenco per definire la curva standard.
9. Scegliere il verde " prossimo " pulsante in basso a destra del display per aprire la finestra a comparsa gating.
10. Sul lato sinistro della finestra di gating immettere i nomi di entrambi i A e regioni di perlina B tenore analita obiettivi e loro ID associato perlina (trovato nel manuale fornito con il dosaggio) in ordine crescente.
11. Selezionare lo strumento gating dalla parte superiore della finestra pop-up e usarlo per disegnare 2 cancelli nel plot FSC e SSC, uno intorno le perline A e un secondo attorno le perline di B.
12. Esaminare l'APC vs PE tracciati a dispersione che appaiono sotto il plot FSC e SSC che appaiono. Ci saranno 6 analita nelle perline A (grafico di sinistra) e 7 bande di analita dei granuli di B (grafico di destra).
    Nota: Cancelli potrebbero essere ridisegnato manualmente selezionando lo strumento gomma nella parte superiore e facendo clic per eliminare un determinato cancello. Lo strumento di gating può quindi essere selezionato e utilizzato per applicare manualmente un cancello nella regione di banda desiderata.
13. Scegliere il verde " OK " pulsante per chiudere il gating finestra pop-up e tornare all'elenco dei file FCS.
14. Definire eventuali diluizioni effettuate ai campioni biologici di destra facendo clic su un determinato file, selezionando " Fold diluizione " dal menu e input il valore corretto.
15. Scegliere il verde " eseguire " pulsante nella parte inferiore destra del display per generare le curve standard per il dosaggio e calcolare le concentrazioni di campioni biologici sconosciuti.

Results

Questo protocollo viene illustrato l'utilizzo di una piattaforma basata su tallone immunodosaggio per quantificare contemporaneamente profili di cytokine da campioni biologici utilizzando un citometro a flusso. I campioni biologici utilizzati in questo esempio sono stati surnatanti delle cellule da splenocytes del topo che aveva in precedenza stato incubato in varie condizioni di attivazione, anche se il formato di test è stato convalidato anche per l'uso con campioni di siero o plasma.

Dati generati dai test vengono utilizzati per costruire curve standard per tutti gli analiti nel pannello "multiplex". Il software di analisi dati classifica ciascun analita specifico basato su un unico tallone dimensioni e intensità APC e quantifica li utilizzando un reporter di PE. Le gamme dinamiche, come pure la sensibilità del dosaggio è dimostrati quando tracciati su scala log-log nella Figura 2A. Il software utilizza i dati di analisi e un algoritmo di adattamento curva 5-parametro per calcolare con precisione non solo le concentrazioni degli analiti in utente fornito campioni biologici, ma anche i limiti di rilevazione su entrambe le estremità alta e bassa di tutte le curve standard (tabella 1 ). Il formato descritto in questo protocollo fornisce anche precisione dosaggio estremamente robusto. In Figura 2B e 2C dati sono presentati raffigurante la variabilità intra-analisi di ciascun analita. Due concentrazioni di proteina standard separato (alta e bassa) sono state analizzate in un saggio con 16 replicati per ciascun campione. Figura 2 e 2D rappresentano la variabilità inter-dosaggio degli analiti di destinazione da tre saggi indipendenti. Come con gli esperimenti di precisione intra-saggio, alte e basse concentrazioni standard sono state analizzate con 3 replica in ciascuno degli esperimenti indipendenti. Minima variabilità nella concentrazione calcolata delle proteine target è chiaramente visibile.

Al fine di dimostrare l'utilità di analisi cytometric basati su tallone a interrogare i profili di espressione di citochine, splenocytes del topo sono stati incubati in varie condizioni di attivazione. Oltre a un controllo non stimolato, cellule inoltre sono state incubate con LPS, gli anticorpi anti-CD3/anti-CD28, o phorbol 12-myristate 13-acetato e ionomicina. Surnatanti della cultura delle cellule sono stati raccolti 48h successive e analizzati utilizzando il pannello di citochina Mouse T helper. I risultati di quantificazione da questo esperimento sono rappresentati nella Figura 3 , e l'effetto delle condizioni di stimolazione sulle concentrazioni di citochina è chiaramente delineato.

I risultati descritti sopra sono tipici, fintanto che lo sperimentatore ha buona pratica di laboratorio e segue il protocollo del test fornito. Fonti di errore in questo formato di dosaggio possono sorgere da deviazioni in tempi di incubazione, volumi di reagente, lavare, o da impostazioni non corrette di PMT sul citometro a flusso utilizzato per analizzare i campioni. In Figura 4A uno scatter plot da un saggio di successo Mostra 2 popolazioni distinte della perla che sono chiaramente definiti. Questo può essere contrapposto alla Figura 4B, dove la scarsa aderenza lavaggio e protocollo hanno portato ad aggregati di perlina che confondono le due popolazioni. Inoltre, come testimoniano i detriti nel quadrante inferiore sinistro, citometro totale eventi sono stati esportati per analisi anziché il formato preferito di gated eventi solo. Corretto citometro istituito è fondamentale per la generazione di dati affidabili in questo test. In Figura 4 corretto PMT impostazioni consentono per la risoluzione di ciascuno degli 6 analiti nel canale di classificazione di APC. Impostazioni non corrette di PMT si tradurrà in dati simili a quello presentato in Figura 4 dove il canale APC ha popolazioni perlina con intensità sovrapposti di classificazione. Questo invaliderà il dosaggio dato che sarà Impossibile calcolare le concentrazioni di analita senza popolazioni ben definite di perline di dosaggio.

Figura 2: campi di curva Standard e precisione dosaggio. (A) una curva standard rappresentativa generata utilizzando il pannello di citochina Mouse T helper. Una curva standard deve essere eseguita ogni dosaggio. (B-C) Precisione intra-dosaggio. Due campioni con differenti concentrazioni di proteine bersaglio (alta e bassa) sono stati analizzati in un saggio con 16 replicati per ciascun campione. I dati sono rappresentati come la media + deviazione standard. (D-E) Precisione inter-dosaggio. Due campioni con differenti concentrazioni di proteine bersaglio (alta e bassa) sono stati analizzati in tre esperimenti indipendenti con 3 ripetizioni per ogni campione. I dati sono rappresentati come la media + deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: quantificazione dei risultati rappresentante. Splenocytes del topo (1 x 10⁶ cellule) sono state coltivate a 37 ° C + 5% CO₂ in varie condizioni: stimolate, LPS (100 ng/mL), αCD3 (1 µ g/mL-rivestita) + αCD28 (1 µ g/mL solubile), PMA (20 ng/mL) + ionomicina (500 ng/mL). Surnatanti sono stati raccolti dopo 48 h poi quantificato utilizzando il pannello di citochina Mouse T helper. Profili di espressione differenziale di citochina in risposta a condizioni di stimolazione sono chiaramente visibili. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: risultati da successo vs saggi infruttuosi. (A) saggi di successo avrà popolazioni distinte della perla per le popolazioni di microsfere. (B) analisi esito negativo avrà separazione della popolazione povera, perlina aggregazioni e troppi eventi raccolti. (C) saggi di successo sono chiaramente definiti intensità nel canale di fluorescenza di classificazione che sono facili da cancello e quantificare. (D) analisi esito negativo verranno hanno scarsamente separati e intensità di classificazione che si sovrappongono più popolazioni di perlina, rendendo difficile la quantificazione. Molti di questi errori possono essere evitati attraverso un'attenta aderenza al protocollo di dosaggio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

	Curva standard			Sensibilità (pg/mL)
Analita	Formula adatta	CURRICULUM VITAE	R2	Min.	Max.
IFN-Γ	5-P.log(4.43, 14.40, 0.54, 9.11, 0.01)	1,77%	0.99	2.1	18105.0
IL-5	5-P.log(4.36, 12.68, 0.64, 5.73, 0.36)	1,32%	1	1.9	14514.0
TNF-Α	5-P.log(4.36, 11.63, 0.79, 5.45, 0.37)	1,48%	0.99	1.9	20109.0
-2	5-P.log(4.46, 12.62, 0.78, 5.07, 0.34)	1,34%	1	1.9	25109.0
IL-6	5-P.log(4.58, 11.66, 0.64, 5.77, 0.37)

TD>1.70% 0.99 2.0 7022.0 IL-4 5-P.log(4.27, 12.23, 0.62, 5.72, 0.36) 1,36% 1 2.0 13273.0 IL-10 5-P.log(4.67, 11.65, 1.20, 6.28, 0.61) 1.81% 0.99 2.2 5190.0 IL-9 5-P.log(4.32, 13.86, 0.86, 5.90, 0.45) 1.82% 1 1.9 12602.0 IL-17A 5-P.log(4.06, 14.03, 0.47, 6.52, 0.32) 0,99% 1 2.0 12285.0 IL-17F 5-P.log(4.52, 12.15, 0.61, 5.52, 0.34) 0.92% 1 2.0 14841.0 IL 21 5-P.log(4.90, 8.03, 1.77, 4.74, 1.11) 0,79% 1 9,0 12943.0 IL-22 5-P.log(4.57, 12.56, 0.63, 6.06, 0.39) 1.16% 1 2.0 6408.0 IL-13 5-P.log(4.40, 11.44, 0.22, 3.19, 1.45) 1.11% 1 2.1 16728.0

Tabella 1: adattamento della curva Standard e sensibilità del test. Il software di analisi di dati è stato utilizzato per generare le curve standard per tutti gli analiti contenute nell'analisi della multisala. Questa analisi completamente automatizzata applica una curva di parametro 5 robusta algoritmo di montaggio per gli standard di serie di diluizione del dosaggio e fu anche utilizzata per definire la sensibilità del test utilizzando i limiti teorici di rilevazione.

Discussion

Il formato di test descritto in questo protocollo può fornire quantificazione solida di profili di mediatore solubile in campioni biologici forniti lo sperimentatore ha buona pratica di laboratorio e aderisce al protocollo consigliato.

Ci sono diversi passaggi chiave che devono essere seguite al fine di garantire risultati affidabili. In primo luogo, le norme ricombinante deve ricostituire nel tampone il raccomandato a tempo pieno e dopo solo diluito in provette di polipropilene. Provette di polistirene possono promuovere l'aderenza delle proteine di parete dei tubi, che può portare a segnali bassi quando si genera la curva standard. In secondo luogo, adeguata agitazione durante fasi d'incubazione è fondamentale. Senza adeguata agitazione, le caratteristiche di associazione dei branelli dosaggio possono essere gravemente ostacolate. Inoltre, è necessario anche corretto lavaggio tra fasi di incubazione. Lo sperimentatore deve assicurare che i reagenti in eccesso vengono rimossi dai pozzi prima di procedere al passaggio successivo nel protocollo. Impostazioni di strumenti per il citometro a flusso utilizzato per interrogare i branelli di dosaggio devono essere ottimizzate pure. In particolare, le impostazioni di PMT devono essere regolate per garantire perlina corretta separazione e ampi range dinamico per le curve standard. Infine, poco prima di essere analizzati sul citometro, perline devono essere agitati con vortex per assicurare adeguata sospensione ed evitare la formazione di aggregati che possono falsare i risultati.

Questo protocollo può potenzialmente essere modificato per analizzare omogenati, nonché i tipi di esempio discussi in questo manoscritto, purché il ricercatore è disposto a ottimizzare il loro protocollo di lisi prima di eseguire dosaggi grande piatto completo. La tecnica reale naturalmente varia a seconda del tipo di tessuto; Tuttavia, in generale il protocollo dovrebbe utilizzare un tampone a pH neutro che contengono le concentrazioni fisiologiche di sali ionici, nessun prodotti chimici denaturante e preferibilmente senza detergenti. Se detergente deve essere utilizzato, le concentrazioni di detergenti non ionici possono essere conservate come minimo (ad es. non più di 1%). Il buffer deve contenere anche gli inibitori della proteasi sufficiente per impedire la degradazione proteolitica di proteine bersaglio. Indipendentemente dal protocollo Lisi utilizzato, i preparativi devono essere centrifugati per rimuovere particelle prima dell'analisi.

Per quanto riguarda i limiti di dosaggio, le concentrazioni di analita target in tipi di campione biologico possono variare notevolmente. Al fine di quantificare correttamente le concentrazioni di analita, devono cadere entro i valori superiore e inferiore per la curva standard. Estrapolazione dei valori della curva non è necessariamente affidabile e non è consigliabile. Gli investigatori devono pertanto ottimizzare diluizioni dei loro campioni particolare in esperimenti pilota prima di eseguire un'analisi completa-piatto. Inoltre, l'accurata preparazione dei campioni biologici deve essere analizzato è fondamentale per il successo di questo formato di dosaggio. Campioni lipemici, emolizzati, o contenenti residui di proteina saranno influenzare le interazioni anticorpo antigene che definiscono il principio di base di questo dosaggio immunologico e il rendering dei risultati non interpretabili.

Questo test è significativo per quanto riguarda i metodi di quantificazione esistenti per diversi motivi. Quando esegue correttamente, il formato di dosaggio può quantificare fino a 13 analiti da un campione utilizzando volumi ben più piccoli quanto sarebbe necessario per analizzare il campione mediante saggi ELISA tradizionale. Inoltre, questo formato di test non richiede strumentazione dedicata al fine di essere eseguita. Si tratta di un vantaggio rispetto agli altri disponibili in commercio test immunologici basati su tallone, come il test può essere eseguito utilizzando un numero qualsiasi di citometri a flusso comunemente usati.

Indagine scientifica sul ruolo svolto dalle citochine e fattori secreti reti in salute e malattia si sta espandendo. Il formato di test descritto in questo manoscritto può essere uno strumento prezioso per i ricercatori che cercano di comprendere questi fenomeni multiforme e complessi. Programmi di ricerca biomedica attivi stanno cominciando ad esplorare il ruolo delle reti di citochina non solo aree come generalizzate infiammazione⁶, ma anche nel contesto degli Stati di malattia specifica quali aterosclerosi, cancro e neuroinflammation ^15,16,17. Senza dubbio, indagine continuerà a crescere in questi settori come la ricerca di nuove terapie per il trattamento di queste patologie croniche si espande. La necessità per la quantificazione accurata e affidabile dei mediatori solubili associati a queste malattie rimarrà una priorità di ricerca critica.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuga Allegra 6R con adattatore per portante MICROPLUS	Beckman Coulter	366816	Per i saggi LEGENDplex viene eseguito in microprovette, piastra a 96 pozzetti con fondo a V o U (opzionale)
Pannello di citochine LEGENDplex Mouse T helper	BioLegend	740005	Multiplex Immunoassay (13-plex)
Anticorpo CD3&epsilon anti-topo	BioLegend	100314	Clone 145-2C11, a basso contenuto di endotossine, formato privo di azidi
Anticorpo CD28 anti-topo	BioLegend	102112	Clone 37.51, a basso contenuto di endotossine, formato privo di azidi
Pompa a vuoto	EMD Millipore	WP6111560	Per saggi LEGENDplex con piastre filtranti (consigliato)
Collettore a vuoto	EMD Millipore	MSVMHTS00	Per saggi LEGENDplex con piastre filtranti (consigliato)
Serbatoi di reagenti sterili monouso Fisher	Scientific	07-200-130	O equivalente
Provette MicroFACS in polipropilene	Fisher Scientific	11-842-90	Per i saggi LEGENDplex viene eseguito in microprovette, piastra a 96 pozzetti con fondo a V o U (opzionale)
Kit di pipette	Fisher Scientific	14-388-100	Quattro dimensioni di pipette (0,2-2µ L, 2-20µ L, 20-200µ L, 100-1000µ L)
Pipetta Multicanale	Fisher Scientific	FA10011G	in grado di erogare 5 μ L a 200 μ L
Agitatore per micropiastre	Fisher Scientific	88880023	O
microcentrifuga	Fisher Scientific	75002410
provette FACS equivalenti	Fisher Scientific	NC9885747	12 x 75 mm a fondo tondo
PMA (Phorbol 12-miristate 13-acetato)	Sigma-Aldrich	P8139
Lipopolisaccaride (LPS)	Sigma-Aldrich	L-8274	Escherichia coli O26:B6
Ionomicina	Sigma-Aldrich	I0634
Branson B200 Pulitore ad ultrasuoni	Sigma-Aldrich	Z305359	O
provette per microcentrifuga equivalenti	Sigma-Aldrich	Z666505	1,5 mL provette in polipropilene
Citometro a flusso	Vari	Vari	Citometro dotato di laser singolo (488nm blu) o due laser (488nm blu o 532nm verde + 633nm rosso) in grado di leggere lunghezze d'onda di emissione a 575nm e 660nm
Piastra in polipropilene a 96 pozzetti	VWR	82050-662	Per i saggi LEGENDplex viene eseguito in microprovette, piastra a 96 pozzetti con fondo a V o U (opzionale)