In questo protocollo, abbiamo descritte le tecniche per la corretta dissezione di Arabidopsis fiori e silique, alcune tecniche di base di schiarimento e selezionato le procedure per intero-monta le osservazioni delle strutture riproduttive di colorazione.
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Articolo metodologico
Intero-monta schiarimento e colorazione delle silique e organi del fiore di Arabidopsis
In questo articolo
Sommario
Abstract
A causa di suoi strumenti formidabili per studi di genetica molecolare, Arabidopsis thaliana è una delle più importanti specie modello in biologia vegetale e, soprattutto, in biologia riproduttiva delle piante. Tuttavia, pianta morfologica, anatomica e le analisi ultrastrutturali tradizionalmente coinvolgono l'incorporamento richiede tempo e sezionamento procedure per campo chiaro, scansione e microscopia elettronica. Recenti progressi nella microscopia a fluorescenza confocale, state-of-the-art 3D computerizzata analisi al microscopio e il continuo affinamento delle tecniche molecolari per essere utilizzato su campioni di intero-monta minimamente trattati, ha portato ad un aumento della domanda di lo sviluppo di tecniche di elaborazione del campione efficiente e minimale. In questo protocollo, descriviamo le tecniche per la dissezione correttamente Arabidopsis fiori e silique, compensazione, tecniche di base e alcune procedure di macchiatura per intero-monta le osservazioni di strutture riproduttive.
Introduzione
I fiori sono tra i più importanti definizione organi delle angiosperme. Piante da fiore è comparso circa 90 milioni anni fa1e così in fretta che loro aspetto rapido è stato descritto come un "abominevole mistero" di Charles Darwin2diversificato. Gli interessi dei ricercatori di pianta in sviluppo fiorale sono diversi. Alcune ricerche si sono concentrate sulla comprensione l'origine evolutiva del fiore nel suo insieme, o l'evoluzione delle specifiche proprietà anatomiche, strutturali e funzionali di fiori3,4,5,
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Protocollo
1. fiore e anemofila fissazione
- Silique da piante e fiori raccolto sincronizzate all'apertura del primo fiore.
Nota: Nelle circostanze sperimentali utilizzati qui, piante iniziano la fioritura circa 21 giorni dopo il trapianto da piastre di Murashige e Skoog (MS) al suolo. Semi sono stratificate per 3 – 4 giorni a 4 ° C e germinato/coltivate su piastre di MS a 22 ° C/16 h luce e 18 ° C/8 h scura per 8 a 10 giorni, prima del trapianto le piantine sul suolo ricco di sostanze nutritive in vasi tenuti sotto le stesse condizioni (Figura 1). Il numero delle ripetizioni dipende l'obiettivo specifico della ricerca, ma è consigliabile....
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Risultati
Arabidopsis appartiene alla famiglia Brassicacea, cuscinetto infiorescenze con fiori bisessuali disposti in un corimbo (Figura 1). Ogni fiore ha quattro sepali, petali di quattro, sei stami (quattro lunghi e due brevi) e un sincarpio gineceo costituito da due carpelli congenitamente fuse (Figura 1F-H) disposti in verticilli concentrici quattro25,26
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Discussione
L'esistenza di molti boccioli di fiori all'interno di una singola infiorescenza di Arabidopsis, che coprono tutte le fasi di sviluppo del fiore, offre un'opportunità unica per studi mirati alla caratterizzazione di un effetto di un trattamento o una caratteristica inerente allo sviluppo contemporaneamente attraverso le diverse fasi dello sviluppo del fiore. Un buon punto di riferimento tra le diverse singole piante è l'apertura del primo fiore dell'infiorescenza principale. Piante sono trattate in modo tale che .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dall'Università di Zurigo, un IEF Marie Curie Grant (grant no. TransEpigen-254797 di A.H.), un Advanced Grant del Consiglio europeo della ricerca (grant no. Medea-250358 di U.G.) e un progetto di ricerca e sviluppo tecnologico (grant MecanX a U.G.) da SystemsX.ch, l'iniziativa Svizzera in biologia dei sistemi.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagenti e materiali | |||
| Etanolo | Scharlau | ET00102500 | |
| acido acetico | Applichem | A3686,2500 | 100% Acido |
| acetico glaciale | biologia | Sigma-Aldrich | 320099 |
| Metanolo | Scharlau | ME03062500 | |
| Soluzione di formaldeide | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Acido propionico | Sigma-Aldrich | 81910-250 ml | |
| Idrato di cloralio | Sigma-Aldrich | 15307 | |
| Glicerolo | Roth | 3783.1 | |
| Gomma arabica | Fluka | 51198 | |
| Acido lattico | Fluka | 69773 | |
| Fenolo | Sigma-Aldrich | 77607-250ML | Abbiamo usato fenolo liquido (usa la densità per trovare il volume richiesto per la tua soluzione) |
| Olio di chiodi di garofano | Sigma-Aldrich | C8392-100ML | |
| Xilene | Roth | 4436.1 | |
| Iodio | Fluka | 57665 | |
| Ioduro di potassio | Merck | 5043 | |
| Malachite Green | Fluka | 63160 | |
| Acido fucsin | Fluka | 84600 | |
| Arancio G | Sigma | 7252 | |
| Sodio Dodecil Solfato | Sigma-Aldrich | L3771 | Grado di biologia molecolare |
| Idrossido di sodio | Sigma-Aldrich | 71690 | |
| Sodio di-idrogeno fosfato | Applichem | A1047,1000 | |
| Sodio fosfato bibasico | Sigma-Aldrich | S9763-1KG | |
| Fosfato di potassio | Sigma-Aldrich | 04347 | |
| EDTA | Applichem | A2937,1000 | |
| Calcofluor | Sigma | F6259 | Sbiancante fluorescente 28 |
| Auramine | Chroma | 10120 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | tossico |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | |
| Blu anilina | Merck | 1275 | |
| MS medio | Carolina | 19-57030 | |
| Substrato ricco di sostanze nutritive | Einheitserde | ED73 | |
| Vetro | Nessuna marca specifica | ||
| 15 ml di provette da centrifuga falcon | VWR | 62406-200 | |
| Pinze Dumond | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| Pinze | DUMONT BIOLOGY | 0108-5 | |
| Siringa | BD | BD Plastipak 300013 | 1 ml |
| Ago di preparazione | BD | BD Microlance 304000 | |
| Vetrini per microscopio | Thermo Scientific | 10143562CE | bordi tagliati |
| Vetrini coprioggetti | Thermo Scientific | DV40008 | |
| Una | scatola di plastica con tovagliolo di carta umido e supporti scorrevoli all'interno | ||
| Name | Company | Numero di catalogo | Comments |
| Solutions | |||
| Fissativi | |||
| Carnoy (Farmer) | Etanolo assoluto : acido acetico glaciale, 3:1 (ml:ml) | ||
| Metanolo/acido acetico fissativo | 50 % (v/v) metanolo, 10 % (v/v) acido acetico glaciale in acqua deionizzata | ||
| FPA50 fissativo | Formalina, acido propionico, 50% etanolo; 5:5:90 (ml:ml:ml) | ||
| Soluzioni di chiarificazione | |||
| Idrato di cloralio/glicerolo | Idrato di cloralio : glicerolo : acqua, 8:1:2 (g:ml:ml). Può essere utilizzato per tutte le fasi di sviluppo dei fiori e per lo sviluppo della silique con la microscopia DIC. Il miglior fissativo è la gomma | ||
| 7,5 g, cloralio idrato 100 g, glicerolo 5 ml, acqua 30 ml. Può essere utilizzato per tutte le fasi di sviluppo dei fiori e per lo sviluppo della silique con la microscopia DIC. Il miglior fissativo è il | |||
| Herr's 4½ | , acido lattico, idrato di cloralio, cristalli di fenolo, olio di chiodi di garofano, xilene; 2:2:2:2:1, in peso. Può essere utilizzato per tutte le fasi di sviluppo dei fiori (in particolare per lo sviluppo degli stami) e per lo sviluppo della silique con la microscopia DIC. Il miglior fissativo è la | ||
| SDS/NaOH | Mix-diluire la SDS e la soluzione madre di NaOH all'1% di SDS / 0,2 N NaOH (diluizione 10x). Per tutte le fasi di sviluppo dei fiori e della silique. Il miglior fissativo è il fissativo metano/acido acetico; Possono essere utilizzati anche gli altri due fissativi. Può essere combinato con calcofluor, auramina, DAPI e soluzione colorante blu all'anilina. | ||
| Soluzione madre | 10 % (p/v) di sodio dodecil solfato. Sciogliere 10 g di solfato di sodio dodecilfato in 80 ml di acqua deionizzata e portare a 100 ml con acqua deionizzata. | ||
| Soluzione | 2 N Soluzione di NaOH: sciogliere 4 g di NaOH in 40 ml di acqua deionizzata e portare a 100 ml con acqua deionizzata | ||
| Soluzioni combinate di chiarificazione e colorazione | |||
| Herr's IKI-4½ | A uno standard 4½ (9 g in totale) aggiungere: 100 mg di iodio, 500 mg di ioduro di potassio. Questa soluzione di chiarificazione può essere utilizzata per tutte le fasi di sviluppo dei fiori e per lo sviluppo della silique, sia per aumentare il contrasto che per caratterizzare la dinamica dell'amido. Utilizza FPA50 per l'analisi strutturale e il fissativo di Carnoy per l'analisi quantitativa dell'amido. | ||
| Colorazione | Etanolo 95% 10 ml, verde malachite (1% in 95% EtOH) 1 ml, acido fucsina (1% in ddH2O) 5 ml, arancia G (1% in ddH2O) 0,5 ml, fenolo 5 g, cloralio idrato 5 g, acido acetico glaciale 2 ml, glicerolo 25 ml. Questa pulizia/colorazione da sola o in combinazione con il 4½ di Herr; può essere utilizzata per valutare l'aborto del polline in fiori con granuli di polline maturi e tricellulari. Si utilizza su materiale non fisso appena levigato. | ||
| Soluzioni coloranti | |||
| Calcofluor soluzione | Calcofluor 0,007% in acqua (g:ml). Originariamente utilizzato come sbiancante ottico. Può essere utilizzato per la colorazione di cellulosa, polisaccaridi carbossilati e calcosio nelle pareti cellulari. Frequentemente usato per colorare l'intine del granello di polline. Tutti e tre i fissativi possono essere utilizzati con questa soluzione. | ||
| di auramina | Auramina 0,01% in acqua (g:ml). Questo colorante fluorescente lipofilo può essere utilizzato per colorare cuticole, cutina ed esina, tra gli altri. Tutti e tre i fissativi possono essere utilizzati con questa soluzione | ||
| Calcofluor-Auramine | Soluzione di Auramina : Soluzione Calcofluor, 3:1. Può essere utilizzato per una colorazione combinata con entrambe le soluzioni. Altre proporzioni possono essere dosate mantenendo una percentuale minore di calcofluor rispetto all'auramina. | ||
| Soluzione | DAPI 0,4 ug/ml, tampone fosfato di sodio 0,1 M (pH 7), Triton-X-100 0,1%, 1 mM EDTA. Questa soluzione può essere utilizzata per colorare le diffuse cromosomiche durante la meiosi maschile e femminile e i nuclei cellulari di qualsiasi tessuto. Utilizzato frequentemente per studiare lo sviluppo dei granuli di polline. Il Carnoy e il metanolo/acido acetico sono i migliori fissativi per questa soluzione. I fissativi a base di formaldeide come l'FPA50 possono interferire con la colorazione. Eccitazione nell'UV ed emissione massima intorno ai 461 nm. | ||
| Tampone fosfato di sodio (0,1 M) | Recettore del protone: 0,2 M Na2HPO4, donatore di protoni: 0,2 M NaH2PO4, rapporto donatore di protoni / recettore del protone: 1,364 (per un pH 7) | ||
| Soluzione di blu | 0,1% (p/v) blu di anilina, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glicerolo. Questa soluzione può essere utilizzata per la colorazione di calclosio e cellulosa di molti stadi di sviluppo (ad es. deposizione di callosio in terad maschili e femminili, tappi di callosio in tubi pollinici). Eccitazione nei raggi UV ed emissione massima intorno a 455. Può anche essere eccitato a 514 nm con emissione in rosso per la colorazione del contenuto cellulare. |
Riferimenti
- Crane, P. R., Friis, E. M., Pedersen, K. R. The origin and early diversification of angiosperms. Nature. 374 (6517), 27-33 (1995).
- Friedman, W. E. The meaning of Darwin's 'abominable mystery'. Am J Bot. 96 (1), 5-21 (2009).
- Sun, G., Dilcher, D. L., Zheng, S., Zhou, Z.
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Ristampe e permessi
