Qui descriviamo una tecnica che combina la mutagenesi transposon con sequenziamento ad alta produttività per identificare e quantificare il trasposone leptospirale mutanti in tessuti dopo una sfida di criceti. Questo protocollo può essere utilizzato per mutanti di schermo per la sopravvivenza e la diffusione negli animali e può essere applicato anche agli studi in vitro .
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Articolo metodologico
High throughput sequenziamento parallelo al Fitness misura di Leptospira interrogans trasposone inserimento mutanti durante dorato siriano criceto infezione
In questo articolo
Sommario
Abstract
In questo manoscritto, descriviamo un trasposone sequenziamento (Tn-Seq) tecnica per identificare e quantificare i mutanti di Leptospira interrogans alterati in palestra durante l'infezione di criceti dorati siriani. TN-Seq combina mutagenesi casuale trasposone con la potenza della tecnologia di sequenziamento ad alta velocità. Gli animali sono sfidati con un pool di mutanti trasposone (ingresso piscina), seguito dalla raccolta del sangue e nei tessuti un paio di giorni più tardi per identificare e quantificare il numero di mutanti in ogni organo (uscita piscine). Le piscine di uscita vengono confrontate con la piscina ingresso per valutare l'idoneità in vivo di ogni mutante. Questo approccio consente la proiezione di una grande piscina di mutanti in un numero limitato di animali. Con modifiche minori, il presente protocollo può essere eseguito con qualsiasi modello animale di leptospirosi, modelli di host di serbatoio come i ratti e i modelli di infezione acuta quali criceti, come pure gli studi in vitro . TN-Seq fornisce un potente strumento per schermo per mutanti con difetti di fitness in vivo e in vitro .
Introduzione
Identificazione di geni di virulenza per alcuni batteri, come ad esempio Leptospira spp., è difficile a causa del numero limitato di strumenti genetici disponibili. Un approccio comunemente utilizzato è la creazione di una collezione di mutanti di mutagenesi casuale trasposone seguita mediante l'identificazione del sito di inserimento in ogni mutante e virulenza prova di mutanti singoli trasposone in un modello animale. Questo approccio è che richiede tempo, costoso e richiede un gran numero di animali.
Quando mutagenesi casuale è stata sviluppata per l'agente patogeno Leptospira interrogans, sono stati identificati geni c....
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Protocollo
Attenzione: Ceppi patogeni di Leptospira spp devono essere gestiti secondo le procedure di contenimento del livello 2 di biosicurezza (BSL-2). Devono essere indossati appropriati dispositivi di protezione individuale (PPE). Una cappa di biosicurezza classe II deve essere utilizzato per tutte le manipolazioni di patogeni Leptospira spp.
1. creazione del trasposone mutante biblioteca15
-
Trasferimento del trasposone in Leptospira spp. di coniugazione (Figura 1)
- Inoculare un volume della fase esponenzia....
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Risultati
Creazione di una libreria di mutanti trasposone in L. interrogans mediante coniugazione richiede un'unità di filtrazione, come mostrato nella Figura 1. Abbiamo recuperato 100-200 transconjugants da ogni accoppiamento.
Il sito di inserzione del trasposone è identificato in ogni mutante ordinando il prodotto PCR generato da PCR semi-casuale che gli obiettivi alla fine del trasposone e accogli.......
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Discussione
Anche se il nostro esperimento pilota per criceto sfidato intraperitonealmente con 42 L. interrogans mutanti i risultati sono presentati17, ci aspettiamo che piscine più grandi di mutanti possono essere schermate da Tn-segg. Perché la frequenza di transconjugants è bassa (100-200 transconjugants/accoppiamento), parecchi accoppiamenti sono necessari per generare un numero sufficiente di mutanti per grandi esperimenti di Tn-Seq. Mantenere un gran numero di mutanti in colture liquide present.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da un premio di merito di affari di veterani (a D.A.H.) e un istituto superiore di sanità concede R01 AI 034431 (per D.A.H.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kanamicina solfato da Streptomyces kanamyceticus | Sigma-Aldrich | K4000 | |
| acido 2,6-diaminopimelico | Sigma-Aldrich | D1377 | |
| Spectinomicina dicloridrato pentaidrato | Sigma-Aldrich | S4014 | |
| Axio Lab A1 microscopio con condensatore in campo scuro | Zeiss | 490950-001-000 | |
| Kit di sangue e tessuti DNeasy | Qiagen | 69504/69506 | |
| Purificazione PCR MinElute | Qiagen | 28004/28006 | |
| Kit di purificazione PCR QIAquick | Qiagen | 28104/28106 | |
| Modello 505 Dismembratore sonico | Fisher Scientific | FB-505 | |
| Tromba a tazza da 2,5" | Fisher Scientific | FB-4625 | |
| Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | Passaggio 3.1.2.4 |
| Deossinucleotidiltransferasi terminale | Promega | M828C | |
| Master mix Phusion | Thermo Scientific | F531 | Preparazione di librerie genomiche, passaggio 3.4. |
| DreamTaq Master Mix | Thermo Scientific | K9011/K9012 | Identificazione del sito di inserimento del trasposone, passaggio 1.2. |
| dCTP | Thermo Scientific | R0151 | |
| ddCTP | Affymetrix/ USBProducts | 77112 | |
| T100 Termociclatore | BioRad | 1861096 | |
| Qubit 2.0 fluorimetro | Invitrogen | Q32866 | passo 3.6. |
| Kit di analisi Qubit dsDNA HS | Invitrogen | Q32851/Q32854 | passo 3.6. |
| Tubi per saggi Qubit | tecnologie per la vita | Q32856 | passaggio 3.6. |
| PBS pH 7.2 (1X) | Gibco | 20012-027 20012-050 | |
| Bisturi monouso No10 | Feather | 2975#10 | |
| Plastica K2 Provette EDTA 2 ml | BD vacutainer | 367841 | |
| siringa U-100 con 26G x ½ ” ago | BD vacutainer | 329652 | sfida IP, passaggio 2.2.1. |
| Siringa con punta Luer-Lok da 3 mL | vacutainer | 309657 | Puntura cardiaca, passaggio 2.4.2. |
| 25G X 5/8" ago | BD vacutainer | 305901 | puntura cardiaca, passaggio 2.4.2. |
| Base in vetro frittato da 25 mm con tappo | EMD Millipore | XX1002502 | Sistema di unità di filtrazione, passaggio 1.1.7. |
| Morsetto a molla in alluminio da 25 mm | EMD Millipore | XX1002503 | Sistema di unità di filtrazione, passaggio 1.1.7. |
| Imbuto in vetro borosilcato da 15 ml | EMD Millipore | XX1002514 | Sistema di unità di filtrazione, passaggio 1.1.7. |
| Pallone Erlenmeyer a braccio laterale da 125 ml | EMD Millipore | XX1002505 | Sistema di unità di filtrazione, passaggio 1.1.7. |
| Filtro in acetato-cellulosa VVPP (dimensione dei pori 0,1 mm; diametro 25 mm) | EMD Millipore | VVLP02500 |
Riferimenti
- Murray, G. L., et al. Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species. Infect Immun. 77 (2), 810-816 (2009).
- Adler, B., Lo, M., Seemann, T., Murray, G. L. Pathogenesis of leptospirosis: the influence of genomics. Vet Microbiol. 153 ....
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Ristampe e permessi
