Articolo metodologico

Analisi quantitativa intero-monta immunofluorescenza delle popolazioni di cellule progenitrici cardiache in embrioni di topo

DOI:

10.3791/56446

⸱

12 ottobre 2017

 ,  ,  , 
1Cell, Developmental, and Regenerative Biology Department, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Mindich Child Health and Development Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Black Family Stem Cell Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Microscopy Core, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Department of Neuroscience, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 6Friedman Brain Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, descriviamo un protocollo per immunofluorescenza intero supporto e basate su immagine quantitativa analisi volumetrica degli embrioni del mouse in fase precoce. Presentiamo questa tecnica come un potente approccio qualitativamente e quantitativamente valutare strutture cardiache durante lo sviluppo e proponiamo che possa essere ampiamente adattabile ad altri sistemi dell'organo.

Abstract

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L'uso di tecniche di imaging continuo progresso ha contribuito largamente alla nostra comprensione aumentata dello sviluppo embrionale. Due ambiti di ricerca che hanno notevolmente beneficiato di questi progressi, grazie all'elevata qualità dei dati che possono essere ottenuti direttamente da embrioni pre-impianto di imaging o ex vivo organi organogenesi e sviluppo pre-impianto. Mentre gli embrioni pre-impianto hanno dato i dati con particolarmente elevata risoluzione spaziale, fasi successive sono state meno favorevoli alla ricostruzione tridimensionale. Acquisizione dati 3D o volumetrici di alta qualità per strutture embrionali conosciute in combinazione con destino mapping o l'analisi genetica lignaggio permetterà per un'analisi più completa degli eventi morfogenetici che si svolgono durante l'embriogenesi.

Questo protocollo descrive un metodo di immunofluorescenza intero-monta che permette per l'etichettatura, la visualizzazione e la quantificazione delle popolazioni di cellule progenitrici entro la mezzaluna cardiaca in via di sviluppo, una struttura chiave formato durante lo sviluppo del cuore. L'approccio è disegnato in un modo che è possibile ottenere sia le informazioni sul livello delle cellule e dei tessuti. Mediante microscopia confocale ed elaborazione dell'immagine, questo protocollo permette per ricostruzione spaziale tridimensionale della Mezzaluna cardiaca, fornendo in tal modo la capacità di analizzare la localizzazione e l'organizzazione delle popolazioni specifiche progenitrici durante Questa fase critica dello sviluppo del cuore. D'importanza, l'uso degli anticorpi di riferimento consente successivo mascheramento della Mezzaluna cardiaca e successive misurazioni quantitative delle aree all'interno della mezzaluna. Questo protocollo non consentirà solo di un esame approfondito dello sviluppo iniziale di cuore, ma con adattamenti dovrebbe essere applicabile alla maggior parte dei sistemi dell'organo in gastrula di embrione di topo fase somite precoce.

Introduzione

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Lo studio dell'organogenesi ha a lungo invocato l'osservazione di eventi morfogenetici nell'embrione di sviluppo. Questi studi si basano spesso sull'uso di coloranti fluorescenti o lignaggio traccia reporter in combinazione con l'etichettatura delle popolazioni di riferimento definito. 1 confrontando le posizioni relative di queste etichette, informazioni possono essere raccolte sull'origine, il movimento o il contributo finale di una popolazione di interesse. Trapianto e gli esperimenti di mappatura del destino utilizzano punti di riferimento morfologici o iniezione di coloranti in linee cellulari non motili per definire il punto di partenza delle celle di interesse, che vengono poi esaminati per il contributo all'embrione sviluppato. 2 , 3 , 4 , 5 esperimenti genetici di lignaggio traccia utilizzano lo stesso concetto con alleli di reporter ben definite che vengono utilizzati per le popolazioni delle cellule etichetta senza manipolazione sperimentale. Chiave di questi approcci è la capacità di determinare, con elevata risoluzione spaziale, le posizioni di sperimentale e le etichette di riferimento. Questi approcci hanno prodotto eccezionali progressi nello sviluppo di pre-impianto ed explant studi di organogenesi. 6 , 7 , 8 , 9

Gli eventi inerenti allo sviluppo che sono alla base della morfogenesi del cuore sono state descritti sempre più bene negli ultimi anni. 10 una delle scoperte più importanti in questo settore di ricerca è la descrizione di un certo numero di popolazioni di cellule progenitrici che può essere distinta dall'espressione di indicatori unici. 11 queste popolazioni sono il primo e il secondo campi di cuore (FHF e SHF), che sono presenti all'interno della Mezzaluna cardiaca sul lato anteriore dell'embrione al giorno embrionale (E) 8.25 dello sviluppo del mouse. 12 queste popolazioni sono frequentemente esaminate attraverso una combinazione di microscopia del largo-campo, che fornisce informazioni a livello di tessuto e sezionamento seriale con analisi di immunofluorescenza, che offre alta risoluzione cellulare ma solo informazioni spaziali bidimensionali. 13 in tal senso, mentre questi studi notevolmente hanno avanzato la nostra comprensione dello sviluppo di cuore, i metodi disponibili hanno limitato in profondità analisi quantitativa della morfogenesi durante queste fasi, creando la necessità di approcci esaminare la organizzazione di queste popolazioni a livello di intero-organismo.

I recenti progressi in microscopia confocale e analisi d'immagine 3D consentono per ricostruzioni algoritmici ad alta risoluzione e ad alta produttività di cellule e strutture in situ con relativa facilità, spianando così la strada per studi dettagliati del complesso strutture cellulari. 14 con l'aumento della potenza di calcolo e lo sviluppo di algoritmi gestione di grandi quantità di dati, entrambi necessari per gestire l'aumento esponenziale delle dimensioni del set di dati, di imaging analisi possono essere completamente automatizzati. 15 analisi automatizzata di imaging di insiemi di dati ha il vantaggio di essere imparziale, ma solo è affidabile come la qualità del set di dati di input; è indispensabile, quindi, che le migliori pratiche sono utilizzate durante l'acquisizione e pre-l'elaborazione immagine per garantire la massima qualità, analisi imparziale. 16 protocolli possono essere completamente automatizzate e condivisa per la riproducibilità, e gli algoritmi utilizzati dal software proprietario sono prontamente disponibili tramite librerie per essere utilizzato da scienziati che hanno familiarità con moderne proprietarie o open-source strumenti di sviluppo. 17

Il seguente protocollo vengono illustrati i passaggi necessari per eseguire tali analisi su un modello ben definito di organogenesi, la formazione della Mezzaluna cardiaca durante lo sviluppo del cuore. In particolare, questo protocollo descrive come (1) raccogliere e sezionare embrioni in fase crescente cardiaca, (2) eseguire l'intero supporto immunofluorescenza per riferimento (Nkx2-5) e sperimentale (Foxa2Cre:YFP18,19) marcatori, (3) preparare e gli embrioni usando la microscopia confocal, di immagine e infine (4) analizzare e quantificare le immagini risultanti utilizzando approcci avanzati tridimensionali. Mentre la mezzaluna cardiaca viene utilizzata come esempio qui, con modifica appropriata, questo protocollo può essere usato per l'analisi di stirpi multipli in gastrula di embrioni in fase precoce somite.

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Protocollo

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tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal comitato di utilizzo presso la scuola di medicina di Icahn al Mount Sinai e istituzionali Animal Care.

1. raccolta ed elaborazione di embrioni di fase cardiaca Crescent

  1. Mate un topo femmina fertile con un maschio fertile stud.
  2. Check per la presenza di una copula vaginale spina utilizzando una sonda smussata o il forcipe. Mezzogiorno del giorno di rilevazione spina sono considerato embrionale (E) 0,5 (Vedi Figura 1A per timeline completo) del giorno.
    Nota: Spine dovrebbero essere controllate per la mattina, come sono persi tutto il giorno.
  3. La mattina dell'8 ° giorno (E8.25), sacrificare la diga incinta per inalazione di CO 2, o secondo le normative locali ed istituzionali.
    Nota: Tempistica esatta può essere sforzo dipendente e deve essere determinata empiricamente con morfologia.
  4. Spray l'addome del mouse con etanolo al 70% per pulire la zona e ridurre al minimo lo spargimento. Esporre i visceri eseguendo un'incisione addominale attraverso la pelle e la parete del corpo.
  5. Individuare l'utero e rimuovere con cura l'intero corno uterino dall'animale. Iniziare tagliando sopra un ovidotto, rifilatura grasso lontano l'utero mentre si sta procedendo alla fine cervicale. Tagliare attraverso la cervice e continuare all'estremità superiore dell'ovidotto, taglio per rilasciare l'intero utero.
    6. Piatto
  6. posto l'utero in un 10 cm con fosfato tampone (PBS, pH 7.4) per lavare via il sangue in eccesso. Sub-sezionare l'utero tagliando il Mesometrio tra ogni deciduum, che contiene gli embrioni. Trasferire gli embrioni per un piatto di 6cm con PBS freschi.
  7. Sotto un microscopio di dissezione, utilizzare una pinzetta (#5) per rimuovere il tessuto uterino lontano il tessuto deciduale.
  8. Using forcipe, affettare con attenzione la punta della metà embrionale del deciduum per rivelare l'embrione. Pizzicare la deciduum per spingere l'embrione ed estrarre delicatamente l'embrione.
  9. Sezionare tessuti extraembryonic lontani per quanto possibili senza danneggiare la morfologia dell'embrione ( Figura 1B).
  10. Utilizzare una pipetta di trasferimento per posizionare gli embrioni in una provetta da 1,5 mL con PBS fresco e metterli su ghiaccio. Ripetere 1.7-1.9 per gli embrioni rimanenti prima di continuare.
  11. Aspirato PBS e sciacquare una volta con PBS. Aspirare il PBS.
    Nota: Provare a rimuovere quanto più PBS possibili senza danneggiare o gli embrioni di essiccazione. Rimozione manuale delle soluzioni è consigliato a tutti i passi per evitare la perdita di embrioni.
  12. Fix embrioni con 4% paraformaldeide (PFA) in PBS per 1h a RT.
    Nota: Gli embrioni possono essere risolto durante la notte (O/N) a 4 ° C.
  13. Lavare tre volte con PBS. Conservare gli embrioni a 4 ° C fino al momento di procedere con l'immunofluorescenza.
    Nota: Punto di pausa. Gli embrioni possono essere memorizzati in modo sicuro in PBS a 4 ° C per diverse settimane.

2. Colorazione di immunofluorescenza

Nota: le seguenti condizioni di incubazione possono essere regolate per ospitare diverse pianificazioni. Si consiglia di agitazione delicata o a dondolo per tutte le fasi di incubazione lunga.

  1. PBS di rimuovere e aggiungere 1 mL di tampone bloccante (saponina 0,5%, 1% di albumina di siero bovino (BSA) in PBS).
  2. Incubare almeno 4 h a TA. Questo può anche essere fatto O/N a 4 ° C.
  3. Rimuovere il tampone bloccante e aggiungere la miscela di anticorpo primario diluito in tampone bloccante. Incubare O/N a 4 ° C.
    Nota: Vedere sezione per descrizione di anticorpi utilizzati e ha suggerito di diluizioni di materiali. Diluizioni di anticorpo devono essere determinate empiricamente. L'uso di Nkx2-5 come una macchia di riferimento per il crescent cardiaco è consigliato ed è immagine chiave a valle passaggi di segmentazione e analisi.
  4. Rimuovere gli anticorpi primari dall'aspirazione.
  5. Lavare 3 volte per 1h ciascuna con 0,1% Triton in PBS.
  6. Rimuovere lavare e aggiungere la miscela di anticorpo secondario diluito in un tampone di blocco. Incubare per 3 ore a RT. Questo può anche essere fatto O/N a 4 ° C.
  7. Lavare 3 volte per 1h ciascuna con 0,1% Triton in PBS. Questo può anche essere fatto O/N a 4 ° C.
  8. Controcolorazione con 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) in PBS per 10 min.
    Nota: Questo colorante di contrasto possono essere eseguite simultaneamente con anticorpo secondario.
  9. Lavare 2 volte per 5 minuti ciascuno con 0,1% Triton in PBS.
  10. Lentamente sospendere gli embrioni in mezzi di montaggio antislittamento (2% w/v n-Propyl gallate (nPG), 90% glicerolo, 1x PBS; Per maggiori dettagli vedere la sezione materiali). Permettono di equilibrare almeno 1 h prima del montaggio. Delicatamente a scatti la provetta periodicamente per aiutare gli embrioni drop in soluzione anti-dissolvenza.
    Nota: Punto di pausa. Gli embrioni possono essere conservati per diversi giorni in soluzione anti-dissolvenza fino al momento di montare e immagine.

3. Embrioni di montaggio per microscopia

vetrini da microscopio
  1. prepara per il montaggio tramite biadesivo o distanziatori in silicone. Se usate un nastro doppio bastone, fare due stack in parallelo di 5-6 strati circa 15-20 mm apart. Questo lascerà spazio sufficiente per riporre gli embrioni e fissare il vetrino coprioggetti ( Figura 1).
  2. Mettere una goccia di 15 µ l di anti-dissolvenza sulla diapositiva, tra il biadesivo. Trasferire con cautela un embrione alla diapositiva.
    Nota: più di un embrione può essere inserito in una diapositiva. Tuttavia, i passaggi successivi di orientamento sono più difficili con più embrioni, e lunghe durate di imaging può portare a foto-candeggio.
  3. Sotto un microscopio di dissezione utilizzando una pinzetta, posizionare l'embrione in modo tale che il lato anteriore si allontana la diapositiva con l'asse del corpo in linea con l'asse lungo della diapositiva. Vedere la Figura 1 per una schematica dell'installazione montaggio.
  4. Posizionare un vetrino coprioggetto sopra il campione che riposa un lato su una pila di biadesivo e utilizzando forcipe per abbassare delicatamente il vetrino coprioggetti, fino a quando non si mette in contatto l'altro nastro.
    Nota: Punti 3.3 e 3.4 sono fondamentali per garantire il corretto orientamento dell'embrione per l'imaging. Abbassando il coprioggetto lungo la parte posteriore di senso anteriore, l'embrione non dovrebbe rotolare e regione cardiaca mezzaluna rimarrà orientata dalla diapositiva, che è l'ideale per l'imaging su un microscopio invertito.
  5. Utilizzare una pipetta per aggiungere ulteriore anti-dissolvenza tra la diapositiva e il vetrino coprioggetti per mantenere il campione da morire durante l'archiviazione/imaging.

4. Formazione immagine confocal

  1. acquisire immagini utilizzando il più alto obiettivo di ingrandimento che permette per la regione intera cardiaca mezzaluna essere catturati in un campo di vista. Utilizzare frequenze di campionamento di Nyquist per determinare le dimensioni del voxel di x-y-z. Maggior parte dei produttori microscopio avrà un " ottimizzare " pulsante per accertarsi del campionamento di Nyquist.
    Nota: La macchiatura per Nkx2-5 è utile qui, come sarà delineare l'intera regione cardiaca mezzaluna. Dimensioni più piccole di Z-passo (oversampling) produrrà meglio 3D modellazione risultati ma può portare a tempi di acquisizione prolungati e/o sbiancamento per alcuni campioni.
  2. Impostare parametri utilizzando le pratiche standard di Best-Seller imaging di imaging. Vale a dire, utilizzare l'intensità del laser possibile più basso per ottenere buon rapporto segnale-rumore per ogni fluoroforo e scegliere guadagno e offset livelli che producono un'ampia gamma dinamica senza saturare il segnale.
    Nota: Essere coerenti con imaging parametri tra i campioni che verranno confrontati direttamente. Ciò è particolarmente importante per l'analisi 3D a valle e quantificazione.

5. Analisi e modellazione 3D quantitativa immagine

Nota: Per questo protocollo, le immagini sono stati analizzati utilizzando il pacchetto software Imaris. Analisi simile potrebbero essere possibile utilizzando pacchetti alternativi. La descrizione qui sotto riguarda la pipeline di analisi per un canale di riferimento (cioè Nkx2-5) e un canale sperimentale (cioè YFP). Canali aggiuntivi possono essere analizzati attraverso la ripetizione di questi passaggi. Un set di dati di esempio è stato previsto che può essere utilizzato per replicare la seguente analisi.

  1. Caricare set di dati di immagine raw in vista di Imaris Arena e aprire il file per embrione desiderata nella visualizzazione Surpass. I dati devono essere caricati nella vista 3D in modalità (max) MIP. Aprire la finestra di regolazione del Display e selezionare solo il canale di riferimento.
  2. Regolare la soglia dell'immagine se necessario per una migliore visualizzazione. Per questa analisi, regolare la gamma se il rapporto segnale-rumore è troppo basso per segmentazione.
    Nota: Se eseguire correzioni di gamma, che sono non-lineare rettifiche, le immagini rettificate non utilizzabile per misure di intensità o confronti. In questa fase è possibile eseguire ulteriore pre-elaborazione delle immagini (cioè illuminazione correzioni, sfocatura gaussiana o altra filtrazione), se il vostro rapporto segnale-rumore non è soddisfacente. Se si sceglie di fare pre-elaborazione, è necessario eseguire la stessa procedura di pre-elaborazione per tutte le immagini del set di dati.
  3. Creare una nuova superficie per il canale di riferimento utilizzando il dialogo di superficie algoritmo.
    1. Selezionare la " solo un'area di interesse del segmento " checkbox.
    2. Regolare l'area di casella di delimitazione, in modo che esso contiene la regione di interesse (ROI, cioè della zona cardiaca mezzaluna) come delineato dalla macchia riferimento.
    3. Selezionare il canale di riferimento dal menu a discesa canale sorgente. L'impostazione predefinita per levigature (uguale alla dimensione del voxel di z) è in genere sufficiente, ma può richiedere ottimizzazione empirica. Per questa analisi, utilizzare levigante uguale a metà della z voxel-dimensione.
    4. Eseguire la soglia di intensità assoluta. Per assicurare che la superficie non si estende oltre il segnale del canale, regolare il limite inferiore utilizzando i cursori.
      Nota: Per alcune immagini dove le cellule possono essere delineate facilmente, è possibile includere il " Spalato toccare oggetti " algoritmo, per separare ulteriormente il segnale da background.
    5. Filtrare gli oggetti di voxel numero o il volume e respingere gli oggetti di sfondo (piccolo o trovati nelle aree di fuori della zona di Nkx2-5) che l'algoritmo potrebbe hanno generato. Finire l'algoritmo.
  4. Utilizzando la superficie appena creata, creare un canale per il canale sperimentale è mascherato.
    1. Con le superfici selezionate, scegliere il " maschera Sel... ͟ " funzione dalla finestra Edit.
    2. Selezionare il canale sperimentale di interesse (cioè YFP). Assicurarsi che il " Duplica canale prima di applicare la maschera " è selezionata la casella di controllo.
  5. In the Display regolazione finestra selezionare solo il canale è mascherato. Creare una nuova superficie per il canale è mascherato seguendo passaggi 5.3-5.3.5.
    Nota: A questo punto può essere utile regolare l'aspetto di ogni maschera per facilitare la visualizzazione del modello 3D: selezionare ogni superficie e selezionare la scheda colore regolare il colore di Base e la trasparenza come necessario. Colori di superficie non uniscono quando sovrapposte.
  6. Per ottenere i dati volumetrici, con ogni superficie selezionata selezionare la scheda statistiche. Nella " Detailed " Sub-tab, scegliere " valori medi " dal menu a discesa. Il volume totale della superficie può essere trovato nella colonna importo della tabella generata.
    Nota: Se la superficie generata contiene frammenti di erronee (cioè frammenti da segnale di fondo non esclusi durante la segmentazione o aree discontinue dalla superficie principale), potrebbe essere necessario calcolare il volume totale manualmente, o la superficie di volume o numero di voxel filtro e garantire che solo i segmenti di segnale sono inclusi nel calcolo. Il volume per ogni porzione della superficie può essere trovato selezionando " tutti i valori " dal menu a discesa. Selezionare ogni valore renderà la regione corrispondente appaiono di colore giallo, che aiuta nella determinazione dei valori per escludere.

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Risultati

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La qualità finale dei dati di analisi dipende in gran parte (1) l'integrità e la morfologia di embrioni dissecati, (2) l'uso degli anticorpi di alta specificità e (3) la corretta impostazione dei parametri di imaging. Embrioni danneggiati verranno confondere il processo di generazione di superfici e ostacolare l'analisi quantitativa. Esempi di embrioni correttamente dissecati e messa in scena sono mostrati in Figura 2B. Gli embrioni possono essere ulteriormen...

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Discussione

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Il protocollo di cui sopra descrive una strategia per ottenere dati quantitativi da immagini di alta qualità intero supporto immunofluorescenza degli embrioni del mouse post-impianto. Se eseguita correttamente, i dati volumetrici 3D generati con la procedura utilizzabile per l'analisi comparativa e Intersezionali di più domini all'interno dell'embrione. Il segnale superficiale approccio descritto di mascheratura è di particolare utilità durante l'analisi di popolazioni di cellule romanzo rispetto alle strutture di riferi...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato finanziato dal NIH/NHLBI R56 HL128646 e il Mindich Child Health and Development Institute (MCHDI) a ISMMS (a N.D.). E.B. è supportato da un HD075735 di NIH/NIDCR tirocinio T32. Microscopia e analisi delle immagini è stata eseguita il nucleo di microscopia presso la scuola di medicina di Icahn sul Monte Sinai, che è sostenuta in parte dal Tisch Cancer Institute presso la Mount Sinai P30 CA196521 – Cancer Center Support Grant.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Sonda smussataRobozRS-9580
PinzeRobozRS-8100
Pinze finiRobozRS-5015
Forbici da dissezioneRobozRS-5912
SaponinaSigma Aldrich84510
Siero bovino AlbuminaSigma AldrichA8022
TritonRPIA4490
Capra anti-Nkx2-5Santa Cruz Biotechsc-8697Usato a 1:100-1:500
Pollo anti-GFPabcamab13970Usato a 1:500
Coniglio anti-Islet1abcamab109517Usato a 1:100
Coniglio anti-Hcn4MilliporeAB5808Usato a 1:100
488 anti-polloJackson Immunoresearch703-546-155Ricostituito in acqua e conservato a -20 ° C in concentrazione finale del 50% di glicerolo. Usato in scala 1:500.
555 anti-capraThermo Fisher ScientificA21432Usato a 1:500
647 anti-coniglioJackson Immunoresearch711-606-152Ricostituito in acqua e conservato a -20 ° C in concentrazione finale del 50% di glicerolo. Usato in scala 1:500.
DAPISigma AldrichD9542
n-propil gallatoSigma Aldrich2370La soluzione stock è del 20% p/v in DMSO. Soluzione di lavoro preparata mescolando 1 parte di 10x PBS con 9 parti di glicerolo al 100% e aggiungendo lentamente 0,1 parti di soluzione madre.
Vetrini per microscopia Superfrost PlusVWR Scientific48311-703
22x22 mm vetrini coprioggettiVWR Scientific48366-227
Imaris 8.4.1Bitplane

Riferimenti

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