Questo rapporto descrive un approccio semplice per indurre con successo la neurite autoimmune sperimentale (EAN) utilizzando la proteina della mielina zero (P0)180-199 del peptide in combinazione con adiuvante completo di Freund e tossina della pertosse. Vi presentiamo un paradigma sofisticato in grado di valutare con precisione l'entità dei deficit funzionali e neuropatologia che si verificano in questo EAN.
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Articolo metodologico
Un approccio semplice per indurre la neurite Autoimmune Sperimentale in topi C57BL/6 per le valutazioni funzionali e Neuropathological
In questo articolo
Sommario
Abstract
Neurite autoimmune sperimentale (EAN) è un modello sperimentale ben apprezzato delle malattie demielinizzanti periferiche autoimmuni. Malattia EAN è indotto immunizzando topi con peptidi neurogeni di dirigere un attacco infiammatorio verso componenti del sistema nervoso periferico (PNS). Gli avanzamenti recenti hanno permesso l'induzione di EAN nella linea di mouse C57BL/6 relativamente resistente usando la proteina del myelin zero (P0)106-125 o peptidi180-199 P0 consegnati in adiuvante combinato con l'iniezione di tossina della pertosse. La capacità di indurre EAN nel ceppo C57BL/6 consente l'utilizzo di numerosi strumenti genetici che esiste su questo sfondo del mouse e permette così sofisticato studio della patogenesi della malattia e interrogatorio dell'azione meccanicistico di approcci terapeutici in combinazione con approcci transgenici. In questo studio, dimostriamo un approccio semplice per indurre correttamente EAN utilizzando il peptide di180-199 P0 in topi C57BL/6. Abbiamo anche delineare un protocollo per la valutazione dei deficit funzionali che si verificano in questo modello, accompagnato da una serie di caratteristiche neuropathological. Così, questo modello è un potente modello sperimentale per studiare la patogenesi delle neuropatie demielinizzanti periferiche umane e per determinare l'efficacia di potenziali terapie che mirano a promuovere la riparazione della mielina e proteggono da danno del nervo in autoimmune neurite.
Introduzione
Neuropatie periferiche possono essere di origine genetica o acquisita, con neuropatie acquisite avendo entrambi metabolica, ischemica, infiammatorie, o tossici precipitanti. Queste malattie sono anche utilmente classificate come assonale o demyelinative in origine. Il più comune acquisita demielinizzante neuropatie periferiche sono la polineuropatia Demyelinating infiammatoria acuta (AIDP, noto anche come sindrome di Guillain-Barré, GBS) e cronica infiammatoria demielinizzante polineuropatia (CIDP)1, 2 , 3 , 4; entrambi sono patogeneticamente caratterizzati da una reazione autoimmune diretta contro la guaina di mielina, che causa demielinizzazione dei nervi periferici. In queste malattie, le cellule di T attivate attraversano la barriera del nervo e generano una reazione immune all'interno il PNS. Attivazione dei macrofagi all'interno del nervo quindi causa demielinizzazione o direttamente tramite attacco fagocitica, oppure indirettamente tramite secrete mediatori infiammatori, con conseguente disabilità clinica come paralisi e disfunzione sensitiva5. Mentre gli assoni demyelinated mantengono la capacità di essere remyelinated seguito demielinizzazione, remyelination è spesso ritardato o incompleta, con conseguente suscettibilità degli assoni nudi a danni irreversibili, che è la causa principale della clinica permanente disabilità. Attualmente, i trattamenti più efficaci sono immunomodulatori, ma nonostante la loro efficacia, in molti casi il recupero è spesso lento e ~ 25% pazienti avvertiranno i deficit funzionali residui che riducono significativamente la loro qualità di vita6, 7.
EAN è un modello animale ampiamente usato di demielinizzanti neuropatia periferica che ha fornito le comprensioni importanti nella patogenesi e un mezzo per valutare nuovi agenti terapeutici4. Questo modello può essere indotta in specie diverse come i conigli, ratti, topi e porcellini d'India e viene indotta tramite immunizzazione con antigeni neurogeni. Tuttavia, l'induzione di EAN successo dipende in ultima analisi su una risposta immunitaria adeguata per la malattia si verifichi. In considerazione delle variazioni di specie (e inter-specie/ceppo) nella funzione immune, molteplici combinazioni di antigeni e adiuvanti sono stati sviluppati per indurre correttamente EAN. In termini di strumenti genetici murini, C57BL/6 è il più ampiamente usato; Tuttavia, il peptide di proteina P2 tradizionale 57-81 (P257-81) che provoca la malattia nel ceppo suscettibili SJL mouse8 è in grado di patogenesi illeciti portando a deficit funzionali nel ceppo C57BL/6. Fortunatamente, paradigmi di sensibilizzazione utilizzando il P0106-125 o P0180-199 peptidi, consegnato in adiuvante combinato con l'iniezione di pertosse tossina può superare questa barriera, abilitazione sofisticati strumenti genetici per essere utilizzato nella modello murino di EAN.
Qui, un metodo semplice per l'induzione di EAN nei topi C57BL/6 è presentato. Inoltre, viene fornito un approccio globale e dettagliato da cui valutare i deficit funzionali e neuropathological associati alla malattia. Il peptide di P0180–199 9 è stato scelto preferenza l' alternativa1057-81 di P0. Il modello di199 180–P0 è stato descritto per produrre meno gravi segni clinici rispetto con l' alternativa1057-81 di P0 e rischia pertanto di sostenere l'introduzione di potenzialmente perturbazioni genetiche deleterie, recuperare dalle procedure chirurgiche (ad esempio l'impianto pompa osmotica) ed è favorevole alla prova4funzione di andatura di tapis roulant. Tuttavia, i tapis roulant andatura funzione test e istologici protocolli descritti qui facilmente potrebbero essere applicati quando si studia la malattia in una variante di57-81 indotto P0.
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Protocollo
tutte le procedure qui descritte sono state approvate dall'Istituto Florey di Neuroscienze e salute mentale (Melbourne cervello Centre) Comitato di etica degli animali e seguire la Australian codice di pratica per l'uso degli animali per scientifico Scopi.
1. induzione di EAN
Nota: EAN può essere indotta con successo nei topi C57BL/6 maschi di età compresa tra 6-8 settimane. Il protocollo di induzione dura 9 giorni in totale. Giorno 0 si riferisce al giorno della prima immunizzazione. Per questo protocollo, le iniezioni sono state condotte nell'ambito dell'anestesia (Vedi punto 1.1.2 qui sotto).
- On Day -1:
- preparare la tossina della pertosse (Vedi Tabella materiali) soluzione di 1,6 µ g/mL utilizzando il fosfato del mouse-isotonica sterile di 0.1 M tampone (MT-PBS).
- Amputate con isoflurano:
- posizionare il mouse (C57BL/6, uomo, 6-8 settimane) in aula amputate e regolare il flusso di ossigeno a 1 L/min.
- Accendere il vaporizzatore isoflurano, regolarlo al 2,5% per amputate e monitor di respirazione e attesa per 2 min, o fino a quando i riflessi primari (arto cornea e posteriore) sono non più reattivo
- Rimuovere il mouse dalla camera amputate e amministrare 250 µ l della soluzione di tossina della pertosse sopra tramite un'iniezione intraperitoneale (i.p.) utilizzando una siringa da 0,5 mL con ago 30 1/2 G.
- Preparare l'inoculo iniettabile per immunizzazione:
- preparare soluzione A utilizzando 2 mg/mL soluzione del peptide 180-199 P0 (con > 98% di purezza, sequenza S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) in soluzione fisiologica allo 0,9%.
- Preparare Soluzione B utilizzando 20 mg/mL soluzione della tubercolosi del micobatterio (Vedi Tabella materiali) in Freund ' adiuvante completo s (FCA, composto da: 15% mannide monoolate + 85% di olio di paraffina e 0,5 mg/mL di essiccata uccisi e secchi M Mycobacterium butyricum).
- Per rendere l'inoculo finale per via parenterale, combinare parti di uguale volume di soluzioni A e B in un battitore di perlina e mescolarli alla massima velocità per 1 minuto a temperatura ambiente.
Nota: Le soluzioni A e B possono essere mantenute come magazzino e conservate a 4 ° C per un massimo di un mese ma l'inoculo finale combinato dovrà essere preparata il giorno dell'iniezione del mouse.
- Il giorno 0, amministrare 50 µ l di inoculo (preparazione descritta in passaggio 1.1.4) in un mouse tramite un'iniezione sottocutanea con un ago di 23 G.
Nota: L'iniezione può essere collocata tra le scapole, o tra le arti posteriori e la coda sopra il dorsum caudale. - Il giorno 1, rendono la soluzione di tossina della pertosse di 1,2 µ g/mL (in MT-PBS) e amministrare 250 µ l in un mouse via i.p. iniezione utilizzando una siringa da 0,5 mL con ago 30 1/2 G.
- Il giorno 3, ripetere passo 1.3 qui sopra.
Nota: Soluzioni Stock A e B possono essere composti e conservate a 4 ° c per un massimo di un mese. Tuttavia, l'inoculo finale iniettabile, prodotto dalla combinazione di soluzioni di riserva A e B, deve essere fatto il giorno dell'iniezione. - Il giorno 8, amministrare 50 µ l di inoculo (preparazione descritta in passaggio 1.1.4) in un mouse tramite un'iniezione sottocutanea (Vedi punto 1.2. su indicato), al sito di iniezione stesso come descritto al punto 1.2 (per ogni animale)
2. Scoring clinico
- eseguire segnando clinica quotidiana a partire il giorno 0.
- Dare ogni mouse un punteggio pari a 0, 1, 2, 3 o 4 secondo i criteri pubblicati 4. Vedere la tabella 1 per il punteggio clinico EAN.
Nota: Per coerenza, uno sforzo dovrebbe essere fatto per segnare i topi allo stesso tempo ogni giorno dal ricercatore stesso.
3. Valutazione di funzione a motore
Nota: le prestazioni del motore sono valutata in parallelo con il punteggio clinico per la stessa coorte degli animali. L'apparato di valutazione della funzione motoria deve essere collegato a un computer che dispone di un sistema di imaging funzione andatura (Vedi Tabella materiali) installato. Si raccomanda inoltre che tutti i topi da valutarsi dovrebbero essere abituati all'attività in esecuzione prima di induzione di EAN. Per effettuare questa operazione, esecuzioni di pratica (2 esecuzioni di test per topo) vengono eseguite tre giorni prima di induzione di malattia (giorno -3).
- Accendere la funzione motoria valutazione apparato ed il commutatore sul pulsante luce.
- Scruff il mouse saldamente e suoi piedi di inchiostro abbassando esso su un contenitore riempito con inchiostro rosso mentre si tiene la sua coda.
Nota: Questo passaggio è obbligatorio per il ceppo C57BL/6, ma può essere ignorato se viene utilizzato un ceppo del mouse con un colore del mantello bianco. - Posizionare il mouse nel vano piedi e impostare la velocità di tapis roulant a 15 cm/s.
- Accendere il tapis roulant e cliccare il " record " pulsante per catturare il movimento in esecuzione del mouse utilizzando la funzione di andatura sistema di imaging (Vedi Tabella materiali).
- Utilizzare un timer e misurare ogni corsa per 36 s. Dopo 36 s, interrompere la registrazione e stop il tapis roulant.
Nota: I topi che non è in grado di completare con successo l'attività in esecuzione per questo intervallo s 36 sono considerati di avere fallito. - Salvare il file video nella cartella designata.
- Ripetere i passaggi precedenti per ogni mouse per essere valutato. Testare i topi con la stessa attività in esecuzione ogni 3 giorni.
- Analizzare i file video modificati utilizzando il software per i parametri di funzione di andatura (Vedi Tabella materiali).
Nota: I dettagli di come analizzare diversi parametri del motore variano tra software così consultare il produttore ' istruzione di s prima dell'analisi. Per ottenere l'evidenza istologica di axonal e danni di mielina tramite immunoistochimica o microscopia elettronica, tessuti possono essere assunto in qualsiasi fase post funzione motoria valutazione a seconda degli obiettivi specifici della ricerca animale.
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Risultati
Peptide180-199 P0 indotto EAN nei cavi di topi C57BL/6 per una malattia monofase con punteggio clinico inizio dal post di 6 giorni prima immunizzazione (dpi) e massimo punteggio gravità è osservata da 25 dpi seguita da alcuni punteggio clinico miglioramento da 40 dpi durata (Figura 1)4,9. In termini di funzione di andatura, topi cominciano a fallire in una semplice attività in esecuzione pi...
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Discussione
Questo rapporto descrive un metodo semplice per indurre EAN utilizzando il peptide di180-199 P0 in topi C57BL/6, consentendo la quantificazione dei principali deficit neuropathological e funzionale in topi indotti con EAN. Distinto per il protocollo di induzione di EAN descritto qui è l'uso dell'anestesia durante l'esecuzione le iniezioni di immunizzazione. L'uso dell'anestesia isoflurano migliora notevolmente la capacità di garantire che il volume totale dell'inoculo viene iniettato per via sottocutanea nella...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nessun conflitto di interessi per quanto riguarda questo lavoro.
Ringraziamenti
DGG è un NHMRC Peter Doherty e sclerosi multipla ricerca Australia (MSRA) precoce carriera Fellow. JLF è supportato da una borsa di studio post-dottorato di MSRA. Questo lavoro è stato supportato dal Australian National Health e progetto del Consiglio di ricerca medica (NHMRC) concedere #APP1058647 JX.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| C57BL/6, maschio, 6-8 settimane | Australian Bioresources Cenre, WA, Australia | ||
| Elenco della tossina della pertosse | Biological Laboratories, Inc., CA, USA | #181 | |
| 0.1 M topo fosfato tamponato salino (MT-PBS) | avrà il proprio protocollo. | ||
| Isoflurane | Pharmachem, QLD, Australia | Laboratories avrà il proprio protocollo per la somministrazione. | |
| P0180– 199 peptide | Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN | P0180– 199, sequenza S– S– K– R– G– R– Domande e risposte T– P– V– L– Y– A– M– L– D– H– S– R– S | |
| Mycobacterium tuberculosis (ceppo H37RA) | Difco, MI, USA | #231141 | |
| adiuvante completo di Freund (FCA) | Difco, MI, USA | #263910 | |
| 16% Paraformaldeide (PFA) | Servizi di microscopia elettronica | #15710 | Diluire al 4% PFA il giorno della raccolta dei tessuti. |
| 25% glutaraldheyde | ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia# | 11-30-8 | Diluire al 2,5% di glutaraldeide il giorno della fissazione. |
| Sodio azide | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SL189 | Crea il 10% (p/v) di stock in 0,1 milioni di MT-PBS. Utilizzare allo 0,03% (v/v). |
| Saccarosio | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SA030 | Utilizzare al 30% (p/v). |
| Temperatura di taglio ottimale (OCT) medio | Sakura Finetek, CA, USA | #4583 | |
| Siero d'asino normale | Merck Millipore, MA, USA | #S30-100 | Utilizzare come diluente anticorpale al 10% (v/v) o altra concentrazione determinata dal proprio laboratorio. |
| Triton-X 100 | Sigma Aldrich, MI, USA | #90o2-31-1 | Uso in diluente anticorpale allo 0,3% (v/v) o altra concentrazione determinata dal proprio laboratorio. |
| proteina precursore dell'amiloide di coniglio (APP) | Invitrogen (Life Technologies), CA, USA | S12700 | Utilizzato in 1:400 o titolato nel proprio laboratorio. |
| proteina-1 associata alla anti-contactina di coniglio (Caspr) | Dono del Prof. Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israele | Utilizzato a 1:500 o titolato nel proprio laboratorio. | |
| Appropriati Alexa Fluor coniugati anticorpi secondari | Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA | Vari | usi a 1:200 o titolare nel proprio laboratorio. La scelta della specie in cui è stato allevato l'anticorpo e di Alexa Fluor è a discrezione di ciascun laboratorio. |
| Soluzione di montaggio acquosa | Dako (Agilent), CA, USA | Ogni laboratorio avrà le proprie preferenze. | |
| Name | Azienda | Numero catalogo | Comments |
| Equipment | |||
| 0.5 mL siringa con aghi da 301/2 g | BD | #326105 | |
| aghi da 23 g | BD | #305143 | |
| Tampone | Qualsiasi tampone di inchiostro rosso o colorante alimentare rosso può essere utilizzato per segnare le zampe degli animali. | ||
| Apparato DigiGate (include tapis roulant) | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Sistema di imaging DigiGate | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Cronometro | È possibile utilizzare qualsiasi timer. | ||
| DigiGait 8 Software | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Microscopio da dissezione | Zeiss | È possibile utilizzare qualsiasi microscopio da dissezione appropriato. | |
| Vetrini caricati | Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd | SF41296SP | |
| Cyrostat | Leica | È possibile utilizzare qualsiasi cirostato adatto. | |
| Attrezzature per la perfusione e strumenti | I laboratori avranno i propri protoctoli di perfusione. | ||
| umificata opaca | possono produrne una propria utilizzando un contenitore di plastica opaca. | ||
| PAP pene | GeneTex (USA) | La matita di cera o la tensione superficiale possono anche essere utilizzate per creare un pozzo intorno alla sezione del tessuto. | |
| Microscopio confocale | Zeis LSM780 | È possibile utilizzare qualsiasi microscopio confocale con linee laser appropriate. | |
| FIJI/Image J | Istituti Nazionali di Sanità | Disponibile dal www.fiji.sc |
Riferimenti
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- Ruiz, E., Ramalle-Gomara, E., Quinones, C., Martinez-Ochoa, E. Trends in Guillain-Barre syndrome mortality in Spain from 1999 to 2013. Int J Neurosci. 126 (11), 985-988 (2016).
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