Questo manoscritto descrive un protocollo a isolare e cultura gli osteoclasti in vitro da midollo osseo di topo e di studiare il ruolo della destinazione dei mammiferi/meccanicistica della rapamicina complesso 1 nella formazione degli osteoclasti.
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Articolo metodologico
Un base di RANKL Osteoclast cultura Assay di midollo osseo del topo per studiare il ruolo di mTORC1 nella formazione degli osteoclasti
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli osteoclasti sono unico osso-resorbing cellule che si differenziano da monocito/macrofagica del midollo osseo. Una serie di malattie metaboliche dell'osso, compreso osteoporosi può provocare disfunzione degli osteoclasti. Per sviluppare obiettivi farmaceutici per la prevenzione della perdita di massa ossea patologica, si devono intendere i meccanismi da cui gli osteoclasti differenziano dai precursori. La capacità di isolare e un gran numero di osteoclasti in vitro della coltura è fondamentale al fine di determinare il ruolo di geni specifici nel corso del differenziamento degli osteoclasti. Inattivazione del mammiferi/meccanicistica bersaglio della rapamicina complesso 1 (TORC1) in osteoclasti può diminuire il numero degli osteoclasti e aumentare la massa ossea; Tuttavia, i meccanismi di fondo richiedono ulteriore studio. Nello studio presente, un protocollo basato su RANKL per isolare e cultura osteoclasti da midollo osseo di topo e di studiare l'influenza di inattivazione di mTORC1 sulla formazione degli osteoclasti è descritto. Questo protocollo ha provocato con successo un gran numero di osteoclasti giganti, in genere entro una settimana. Eliminazione di Raptor alterata formazione di osteoclasti ed ha fatto diminuire l'attività secretiva fosfatasi acida tartrato-resistente, che indica che mTORC1 è essenziale per la formazione degli osteoclasti.
Introduzione
Dell'osso è un organo mutevole ed è ristrutturato da osteoblasti e osteoclasti per tutta la vita. Gli osteoclasti sono responsabili del riassorbimento di matrice mineralizzata e osteoblasti sintetizzano e secernono nuovo osso matrici1. L'equilibrio tra la formazione dell'osso e riassorbimento dell'osso è cruciale per salute dell'osso, compreso il mantenimento di ossa massa e la risposta alla stimolazione e lesioni. Se questo equilibrio viene interrotto, può verificarsi una serie di malattie metaboliche dell'osso, compreso l'osteoporosi e le malattie parodontali. In queste malattie, perdita di massa ossea derivante da riassorbimento osteoclastic....
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Protocollo
Tutte le procedure relative agli animali sono state eseguite secondo il protocollo approvato dal pannello amministrativo, Stanford su cura degli animali di laboratorio (APLAC) e sono state approvate dal comitato di uso della Shanghai Istituto di biochimica e cellulare e cura degli animali Biologia.
1. preparazione
- Generare degli osteoclasti specifico Raptor eliminazione topi (Raptorfl/fl; Ctsk-cre, aldilà RapCtsk) dall'accoppiamento Raptorfl/fl topi con Ctsk-cre topi. Utilizzare i mouse Raptorfl/fl come controllo WT in ques....
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Risultati
Utilizzando il presente protocollo, un gran numero di osteoclasti giganti sono stato veduto il giorno 6; Se non si vedono gli osteoclasti giganti, un altro giorno di differenziazione di osteoclasto può essere necessari (Figura 1). Formazione di osteoclasti successo è stata confermata dalla trappola macchiatura (Figura 2A). Osteoclasts erano cellule giganti di vino rosso/viola con più di 3 nuclei. Più di 250 osteoclasti sono stati.......
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Discussione
Il dosaggio di osteoclastogenico è il metodo più utilizzato per isolare e cultura gli osteoclasti in vitro12,13. Mentre diversi induzioni degli osteoclasti RANKL-base sono stati descritti13,14,15, lo studio presente ha descritto un protocollo con alcune modifiche sulla base dei metodi precedenti.
Nello studio precedente, saggi erano p.......
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Dichiarazioni
Tutti gli autori dichiarano che non hanno conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il Dr. Minghan Tong e S. Kato per topi e gentilmente fornendo reagenti. Ringraziamo i membri del laboratorio Zou per utili discussioni. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni da 973 programma dal Ministero cinese della scienza e tecnologia (MOST) [2014CB964704 e 2015CB964503], programma di ricerca clinica dell'ospedale di 9 persone, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Grazie per l'aiuto della funzione di memoria per biologia cellulare e funzione di memoria per biologia chimica, CAS Center for Excellence in molecolare di Cell Science, Shanghai Institute di biochimica e biologia cellulare, Accademia cinese delle scie....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Raptorfl/fl topi | The Jackson Laboratory | 013188 | |
| Ctsk-cre un | regalo da S. Kato, Università di Tokyo, Tokyo, Giappone | ||
| α-MEM | Corning | 10-022-CVR | |
| Glutammina | Gibico | 25030081 | |
| Penicillina streptomicina | Gibico | 15140122 | |
| Siero fetale di vitello | BioInd | 04-001-1A | |
| Proteina M-CSF di topo ricombinante | R& D | Q3U4F9 | |
| Proteina RANKL ricombinante di topo | R& D | Q3TWY5 | |
| Tampone di lisi RBC | Beyotime | C3702 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | 302643 | |
| Acetone | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| Soluzione di citrato | Sigma-Aldrich | 915 | |
| Soluzione di formaldeide | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| Kit Fosfatasi Acida, Leucociti (TRAP) | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | |
| Fast Garnet GBC Soluzione base | Sigma-Aldrich | 3872 | |
| Soluzione di nitrito di sodio | Sigma-Aldrich | 914 | |
| Naftolo AS-BI Soluzione di fosfato | Sigma-Aldrich | 3871 | |
| Soluzione di acetato | Sigma-Aldrich | 3863 | |
| Soluzione di tartrato | Sigma-Aldrich | 3873 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco | Corning | 21-031-CVR | |
| Acido L-tartarico | Sigma-Aldrich | 251380 | |
| Tartrato di sodio bibasico disidratato | Sigma-Aldrich | s4797 | |
| Glycine | Shanghai Chemical Co., Ltd. | ||
| MgCl2 | Shanghai Chemical Co., Ltd. | ||
| ZnCl2 | Shanghai Chemical Co., Ltd. | ||
| NaOH | Shanghai Chemical Co., Ltd. | ||
| Substrato della fosfatasi | Sigma-Aldrich | P4744 | |
| anti-Raptor | Cell Signaling Technology | 2280 | |
| anti-P-proteina ribosomiale S6 (S235/236) | Cell Signaling Technology | 2317 | |
| proteina anti-ribosomiale S6 | Cell Signaling Technology | 2211 | |
| anti-β-actina | Santa Cruz Biotecnologia | sc-130300 | |
| 37% formaldeide | Xilong scientific | ||
| fluoruro di polivinilidene (PVDF) | Bio-Rad | ||
| Western Chemiluminescente HRP Substrato (ECL) | Millipore | 00000367MSDS | |
| IX71 | Olympus | ||
| Envision | Perkin Elmer | ||
| 0,45 mm siringa | |||
| forbice | |||
| Pinza |
Riferimenti
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Genetics<....
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Ristampe e permessi
