Recentemente abbiamo mappato le posizioni spaziali (3D) tridimensionale delle vie di trasporto per varie proteine dispostamento all'interno ciliari in cellule vive. Qui questo dettagli di carta la messa a punto sperimentale, il processo di campioni biologici e l'analisi dei dati per la fluorescenza 3D Super-resolution imaging approccio appena applicati in live ciliari.
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Articolo metodologico
Applicazione di microscopia di velocità ad alta velocità super-risoluzione in Live cilio primario
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il cilio primario è una protrusione microtubule-basato sulla superficie di molte cellule eucariotiche e contiene un unico complemento delle proteine tale funzione criticamente nella motilità cellulare e di segnalazione. Poiché le ciglia sono incapaci di sintetizzare le proprie proteine, quasi 200 unici ciliare proteine devono essere oggetto di traffico tra il citosol e ciglia primarie. Tuttavia, è ancora una sfida tecnica per mappare le tridimensionale (3D) posizioni delle vie di trasporto per queste proteine in vivo ciliari a causa delle limitazioni attualmente esistenti tecniche. Per vincere la sfida, recentemente abbiamo sviluppato e impiegato una microscopia ad alta super-risoluzione 3D virtuale ad alta velocità, definita microscopia Sub-diffrazione (velocità) singolo punto bordo-eccitazione, per determinare la posizione spaziale 3D delle vie di trasporto per entrambi citosolici e proteine di membrana in ciglia primarie di cellule vive. In questo articolo, ci dimostrerà la configurazione dettagliata di microscopia di velocità, la preparazione delle cellule che esprimono proteine ciliari fluorescenza-proteina-identificate, l'inseguimento in tempo reale di singola molecola di singole proteine in vivo Cilio e il raggiungimento di densità di probabilità spaziale 3D mappe delle vie di trasporto per le proteine ciliari.
Introduzione
Quanto affermato da Ernst Abbe nel 1873, la risoluzione di microscopia chiara convenzionale è stata creduta di essere limitato a circa 200 nm a causa della diffrazione della luce dall' obiettivo1,2. Attualmente, le tecniche di microscopia di Super-risoluzione rompono questa limitazione e permettono di catturare immagini dinamiche con risoluzione sub-diffrazione (< 200 nm). Le tecniche rientrano generalmente in due grandi categorie: stimolato gli approcci di microscopia basata di svuotamento (STED) emissione, che generano volume di illuminazione di Sub-diffrazione dovuto la risposta ottica non lineare di fluoro....
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Protocollo
1. NIH 3T3-preparazione delle cellule per microscopia di velocità da stock
- 1,5 settimane in anticipo l'esperimento, recuperare una coltura fresca delle cellule NIH 3T3 da uno stock congelato scongelamento a 37 ° C e trasferendo le cellule di un matraccio di cultura cellulare2 25 cm con 3 mL dell'Aquila per volta di Dulbecco Medium (DMEM) addizionata di 110 mg/mL piruvato di sodio, la glutamina 2mm, 10% siero bovino fetale e 1% di penicillina/streptomicina.
- Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore di 5% CO2 .
- Dividere le celle al confluency di 80%, circa ogni due giorni, almeno tre volte prima di giorno speriment....
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Risultati
Questa sezione illustra i dati ottenuti dall'esecuzione di microscopia di velocità presso la TZ delle ciglia primarie per studiare il percorso di trasporto di SSTR3 collegato da un linker esterno di nm ~ 15 a Alexa647 (Figura 3A). Esso ha il duplice scopo di verificare l'algoritmo di trasformazione 3D. Alexa647 dovrebbe solo etichetta la superficie esterna del cilio primario e di conseguenza, la via di trasporto 3D dovrebbe rivelare una via d.......
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Discussione
Questo protocollo descrive l'applicazione di microscopia di velocità per il cilio primario, un organello di segnalazione cellulare che è altamente affidamento sul trasporto efficiente della proteina. Microscopia di velocità in grado di fornire alta risoluzione posizioni (< 10 nm) per molecole fluorescente etichettati come passano attraverso l'illuminazione di singolo punto centrato su TZ. In precedenza è stato applicato per studiare la proteina traffico attraverso il NPC6,
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Ringraziamo il dottor Kristen Verhey (University of Michigan, Ann Arbor) e Dr. Gregory Pazour (Università del Massachusetts Medical School) per la fornitura di alcuni plasmidi. Il progetto è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institutes of Health (NIH GM097037, GM116204 e GM122552 a WY).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 25 cm2 piastra per coltura tissutale | Corning | VV-01936-00 | |
| Penicillina/streptomicina | ThermoFisher | 15140122 | |
| Siero fetale bovino | ThermoFisher | 10438018 | |
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | |
| OPTIMEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| Tripsina | ThermoFisher | 25300054 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Sigma-Aldrich | P3813-1PAK | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 | |
| Piatto con fondo in vetro da 35 mm | MatTek | P35GCOL-0-14-C | |
| AlexaFluor 647-streptavidina coniugata | ThermoFisher | S21374 | |
| Biotina | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| 633 nm Laser He-Ne | Melles Griot | 25-LHP-928-249 | |
| 561 nm laser a stato solido | Coherent | OBIS 561-50 LS | |
| 488 nm | 1185053 | ||
| Microscopio a fluorescenza invertita | Olympus | IX81 | |
| 1.4-NA 100× obiettivo apocromatico a immersione in olio | Olympus | UPLSAPO 100&volte; | |
| Fotocamera con dispositivo accoppiato di carica con guadagno di moltiplicazione su chip | Roper Scientific | Cascade 128+ | |
| Filtro dicroico | Semrock | Di01- R405/488/561/635-25x36 | |
| Filtro di emissione | Semrock | NF01-405/488/561/635-25X5.0 | |
| Slidebook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | software di microscopia digitale |
Riferimenti
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).
- Leung, B. O., Chou, K. C. Review of super-resolution fluorescence microscopy for biology. Appl Spectrosc. 65, 967-980 (2011).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O.,....
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Ristampe e permessi
