Articolo metodologico

Frazionamento subcellulare per l'attivazione di ERK previo trattamento di Peptide derivato mitocondriale

DOI:

10.3791/56496

⸱

25 settembre 2017

 ,  ,  , 
1Leonard Davis School of Gerontology, University of Southern California

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive come stimolare le cellule con peptidi derivati mitocondriale e valutare la cascata di segnalazione e localizzazione di fosfo-proteine.

Abstract

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Peptidi mitocondriale-derivati (MDPs) sono una nuova classe di peptidi che sono codificati da piccolo open reading frame all'interno di altri noti geni del genoma mitocondriale. MDPs hanno un'ampia varietà di effetti biologici quali proteggere i neuroni dall'apoptosi, migliorare gli indicatori metabolici e proteggere le cellule da chemioterapia. Humanin era la MDP prima di essere scoperto ed è il peptide più studiato tra la famiglia MDP. I recettori di membrana e vie di segnalazione a valle di humanin sono state caratterizzate con attenzione. MDPs aggiuntive quali MOTS-c e SHLP1-6 sono stati scoperti più di recente e i meccanismi di segnalazione devono ancora essere delucidato. Qui descriviamo un metodo di coltura basata di cella per determinare la funzione di questi peptidi. In particolare, tecniche di frazionamento cellulare in combinazione con macchiarsi occidentale consentono la determinazione quantitativa dell'attivazione e spostamento della molecola di segnalazione importante. Mentre ci sono altri metodi di frazionamento cellulare, quello qui descritto è un metodo facile e semplice. Questi metodi possono essere utilizzati più ulteriormente per delucidare il meccanismo di azione di questi peptidi e altri agenti terapeutici.

Introduzione

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Gli studi emergenti indicano che peptidi mitocondriali-derivati (MDPs) svolgono i ruoli importanti nel metabolismo e nella citoprotezione1,2,3. Capire la via di trasduzione del segnale in presenza di MDPs ci dà comprensione nel meccanismo da cui MDPs modulano varie funzioni. Il primo MDP identificati, humanin, ha dimostrato di aumentare la chinasi segnale-regolata extracellulare 1/2 (ERK1/2) fosforilazione attraverso suo recettore vincolante4,5. Tuttavia, l'effetto a valle dell'attivazione di ERK1/2 è ancora aggiunto.

La cascata di ERK1/2 serve come un mediatore essenziale in una varietà di processi cellulari compreso proliferazione, migrazione cellulare, il metabolismo cellulare, sopravvivenza ed apoptosi6,7,8. Ad per orchestrare tutti questi processi cellulari distinti, l'attività e la localizzazione subcellulare di ERK1/2 sono strettamente regolate da fosfatasi e impalcatura proteine9,10. Oltre a modificazione post-traduzionale, la dinamica di marcia di ERK1/2 inoltre regola la sua segnalazione funzione, attività e specificità11,12. ERK1/2 è localizzato principalmente nel citosol13. Un insieme delle proteine di ancoraggio e impalcatura aiutano a trattenere ERK1/2 in elementi del citoscheletro, sulla superficie degli organelli, o diffusa nel citoplasma13. Stimolazione, ERK1/2 è fosforilato e viene dissociato dalle sue proteine di ancoraggio, che permette la traslocazione di ERK1/2 ad altri compartimenti subcellulari, tra cui il nucleo, mitocondri, Golgi e lisosomi14, 15 , 16.

Anche se humanin è noto per attivare la via di segnalazione di ERK1/2, l'attivazione di ERK1/2 è osservata solo nei lisati cellulari totali. Come descritto in precedenza, poiché la localizzazione subcellulare di ERK1/2 svolge un ruolo cruciale nel suo effetto a valle, l'analisi della localizzazione subcellulare e i livelli totali di fosforilata ERK1/2 è necessario fornire una comprensione globale di attivazione di ERK1/2 indotta da humanin e l'attivazione di obiettivi a valle.

Per comprendere gli organelli bersaglio di attivazione di ERK1/2, è stato effettuato il frazionamento subcellulare seguito mediante western blotting per fosforilata ERK1/2. Questo metodo può essere facilmente implementato come sfrutta i reagenti e la normale attrezzatura da laboratorio. I compartimenti subcellulari isolati sono di elevata purezza, permettendo i risultati semplicemente essere interpretati. Immunostaining di ERK1/2 può produrre risultati simili. Tuttavia, alcuni compartimenti subcellulari sono relativamente difficili da visualizzare e richiedono metodi di fissazione e permeabilizzazione speciali. ERK1/2 livelli variano in compartimenti subcellulari, e questa variazione potrebbe causare falsi positivi e falsi negativi segnali quando guardando lisati di cellule intere. Pertanto, un immunoblot utilizzando compartimenti subcellulari isolati ci dà una migliore comprensione della localizzazione di ERK1/2.

La versatilità del metodo consente modifiche del protocollo per studiare gli effetti di altri stimolanti tra cui altri MDPs o la traslocazione di altre molecole di segnalazione come STAT3. Recentemente scoperti piccoli peptidi simil-humanin (SHLPs) sono codificati dalla regione di rRNA 16S dove humanin viene codificato, e hanno proprietà simili ma distinti rispetto a HN17. Ad esempio, SHLP2 e SHLP3 attiva ERK1/2 dopo 8 h sebbene humanin attiva ERK1/2 entro 5 min Examining localizzazione subcellulare di ERK1/2 in risposta a diversi peptidi ci darà una migliore comprensione della biologia di questi peptidi. La prova emergente ha mostrato che la localizzazione subcellulare delle molecole di segnalazione svolge un ruolo cruciale nei loro effetti a valle. Per esempio, STAT3, tradizionalmente, è noto per essere localizzato principalmente nel citosol nelle cellule a riposo, e quindi trasloca nel nucleo per attivare l'espressione genica in risposta a citochine18. STAT3 inoltre trasloca ai mitocondri e regola il ciclo del TCA e ATP produzione19. Per quanto riguarda il regolamento di autofagia, diversa localizzazione subcellulare di STAT3 modula l'autofagia in vari modi20. Ad esempio, STAT3 nucleare trascrizionalmente regola geni autophagy-relative e agisce come un modulatore di autofagia. STAT3 citoplasmatica inibisce costitutivamente l'autofagia interagendo con l'autofagia molecole di segnalazione. STAT3 mitocondriale inibisce e impedisce mitophagy sopprimendo l'autofagia indotto da stress ossidativo. Pertanto, questo metodo di isolamento compartimento subcellulare è cruciale per comprendere il ruolo di altre molecole di segnalazione, nonché il ERK1/2.

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Protocollo

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1. peptide trattamento alle cellule

  1. piastra 2 milioni di SH-SY5Y o cellule HEK293 (2 x 10 6) in 10 cm piatto e coltivano per 2 giorni
  2. (opzionale) il prossimo giorno, lavare le cellule con Dulbecco privo di siero ' s Modified Eagle media Medium (DMEM) una volta e incubare con siero DMEM gratuito durante la notte se il trattamento deve essere fatto in media liberi del siero.
  3. Il giorno 3, sciogliere S14G-humanin peptidi in 0,2 µm filtrata, acqua distillata e rinvenire come soluzione di riserva di 1mM.
    Nota: I peptidi devono essere disciolto in solvente appropriato, che può essere determinato dalle caratteristiche di sequenza del peptide (ad es., carica complessiva) e può essere fornito dal produttore se i peptidi sono disponibili in commercio. Ad esempio, S14G-humanin, SHLP2 e SHLP6 e MOTS-c si dissolvono in acqua. Aliquotare i peptidi in un volume adeguato (ad es., 50 µ l) per evitare di congelare e scongelare i cicli. Una volta scongelato, non utilizzarli ancora.
  4. Aliquota il siero pre-riscaldato-contenente o media del siero-liberi in un conico da 50 mL tubo e aggiungere la soluzione di riserva 1 mM temperatura ambiente per trasformarlo in una concentrazione di lavoro (ad esempio, 1 µM, 10 µM).
  5. Sostituire il supporto con 6 mL di soluzione del peptide da passo 1.4. Incubare le cellule per la giusta quantità di tempo.
    Nota: Scegliere il tempo di incubazione a seconda della condizione che attiva ERK.

2. Frazionamento subcellulare di citoplasma e nucleo

  1. lavare le cellule due volte con 10 mL di PBS ghiacciata, raschiare le cellule fuori la piastra in 5 mL di PBS ghiacciata e trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL.
  2. Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 min a 4 ° C.
  3. Aspirare il PBS e risospendere il pellet in 200 µ l di tampone di frazionamento ghiacciata, (pH di 10 mM HEPES = 7.6, 3 mM MgCl 2, 10mm KCl, 5% (v/v) glicerolo, 1% tensioattivi non ionici (C 13 H 22 O (C 2 H 4 O) n), inibitori delle proteasi/fosfatasi).
    Nota: Per mantenere le proteine nel loro stato di fosforilazione, l'inibitore della fosfatasi come bene come proteasi inibitore deve essere appena aggiunto e campioni devono essere tenuti sul ghiaccio a tutti i tempi. Ripetendo il blocco e thaw cicli di campioni devono essere evitati. Aliquotare campioni in piccola quantità (ad es. 50 μg) prima del loro congelamento a -80 ° C.
  4. Incubare risospeso in ghiaccio per 15 minuti e poi Centrifugare a 250 x g per 5 min a 4 ° C.
  5. Raccogliere il surnatante come la frazione citoplasmatica e tenere il pellet per frazione nucleare.
  6. Centrifugare il surnatante per rimuovere i detriti cellulari e altri contaminanti a 18.000 x g per 10 min a 4 ° C e poi trasferire il surnatante in un nuovo tubo del microcentrifuge. Questa è la frazione di citosol.
  7. Risospendere il pellet in tampone ghiacciata di 200 μL (10 mM a pH HEPES = 7.6, 1.5 mM MgCl 2, 420 mM NaCl, 25% (v/v) glicerolo, 0,2 mM EDTA, inibitori delle proteasi/fosfatasi) e centrifugare a 250 x g per 5 min a 4 ° C
  8. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in tampone di estrazione ghiacciata, nucleare 100 μL (pH di 20 mM HEPES = 7.6, 1.5 mM MgCl 2, 420 mM NaCl, 25% (v/v) glicerolo, 0,2 mM EDTA, inibitori delle proteasi/fosfatasi) e Sonicare 10 volte (5 s, 10 s sconto 30% amp.) il ghiaccio
  9. Centrifugare a 18.000 x g per 10 min a 4 ° C.
  10. Trasferire il surnatante ad un nuovo tubo del microcentrifuge. Si tratta di frazione nucleare.
  11. Quantificare la quantità di proteina usando un'analisi BCA

3. frazione mitocondriale grezza

  1. lavare le cellule in ogni piatto di 10 cm con 10 mL di PBS freddo, aggiungere 5 mL di PBS ghiacciata e staccare le celle utilizzando un raschietto cell.
    Nota: Utilizzare tre piatti di 10cm di cellule per ottenere una buona resa dei mitocondri per Western Blotting.
  2. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL e combinare tutto da tre piatti di 10cm in una provetta conica da 15 ml.
  3. Centrifugare le cellule a 600 x g per 10 min a 4 ° C.
  4. Aspirare il PBS e risospendere il pellet in 1 mL di buffer di isolamento mitocondri ghiacciata (10 mM Tris-MOPS, 1 mM EGTA/Tris, 200 mM di saccarosio, regolare a pH = 7,4).
  5. Omogeneizzare le cellule con 25 colpi di un omogeneizzatore 2 mL con il pestello rivestito politetrafluoroetilene su Ice.
    Nota: Questo passaggio è fondamentale per mantenere l'integrità mitocondriale e massimizzare la resa della frazione mitocondriale. Il numero dei tratti deve essere ottimizzato per ogni tipo di cellula. Preraffreddare l'omogeneizzatore prima di iniziare la procedura.
  6. Trasferire l'omogeneizzato a un tubo del microcentrifuge ed e centrifugare a 600 x g per 10 min a 4 ° C per rimuovere i nuclei ed ininterrotte cellule.
  7. Raccogliere il surnatante, trasferirlo in un nuovo tubo del microcentrifuge e centrifugare a 7.000 x g per 10 min a 4 ° C.
    Nota: Il pellet è allentato, raccogliere il surnatante con cura e cercare di non disturbare il pellet.
  8. Rimuovere il supernatante, risospendere il pellet con 200 μL di tampone di isolamento mitocondri ghiacciata e trasferire la soluzione in un nuovo tubo del microcentrifuge. Centrifugare la provetta a 7.000 x g per 10 min a 4 ° C.
  9. Ripetere il punto 3.8 a lavare la pallina. Non è necessario trasferire il surnatante in un nuovo tubo del microcentrifuge in questo passaggio.
  10. Rimuovere il supernatante dal pellet lavato e risospendere il pellet contenente i mitocondri con 50 μL di tampone RIPA.
  11. Incubare la sospensione in ghiaccio per 10 min.
  12. Centrifugare la sospensione a 16.000 x g per 15 min a 4 ° C.
  13. Trasferire il surnatante ad un nuovo tubo del microcentrifuge. Questa è la frazione mitocondriale.
  14. Quantificare la quantità di proteina usando un'analisi BCA.

4. Western Blotting per fosfo-specifici proteine

  1. eseguire un'elettroforesi del gel di SDS-poliacrilammide (8-16% preconfezionati gel) e la proteina di trasferimento di una membrana PVDF 4.
  2. Incubare la membrana con 5% BSA in TBST (0,1% polisorbato 20) per 30 min a temperatura ambiente per bloccare i siti di legame non specifico background.
    Nota: Per il rilevamento di proteina fosforilata, bloccare la membrana con BSA non latte. Il latte contiene caseina, una fosfoproteina abbondante, che si traduce in alto segnale aspecifico.
  3. Incubare la membrana con l'anticorpo primario (anti-fosfo-ERK1/2) a 4 ° C durante la notte.
  4. Il giorno successivo, lavare la membrana con TBST (0,1% polisorbato 20) tre volte per 5 min a temperatura ambiente.
  5. Incubare la membrana con anticorpo secondario (anti-coniglio HRP) per 1 h a temperatura ambiente.
  6. Lavare la membrana con TBST (0,1% polisorbato 20) tre volte per 5 min a temperatura ambiente.
  7. Incubare la membrana con soluzione di ECL e la membrana nell'analizzatore dell'immagine di immagine.
  8. Striscia la membrana con stripping buffer per 15 min a temperatura ambiente e lavare la membrana con TBST tre volte per 5 min.
  9. Ripetere i punti da 4.2 a 4.7 usando l'anticorpo di anti-totale ERK1/2.
  10. Per verificare la purezza di ogni frazione, eseguire SDS-PAGE ed eseguire immunoblots utilizzando anticorpi che riconoscono i marcatori per ogni vano (ad es., Liuzzi B1 per nucleo, GAPDH per cytosol e TOM20 per i mitocondri).

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Risultati

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Utilizzando la procedura qui presentata, abbiamo trattato le cellule HEK293 e SH-SY5Y con 1 μM e 100 μM S14G-humanin, un potente humanin analogico21, rispettivamente, a completare la media per i periodi di tempo indicato (Figura 1A e Figura 1 B). abbiamo poi esaminato la forma totale e fosforilata di ERK1/2 al Thr202/Tyr204 da estratti di proteina to...

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Discussione

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Qui, abbiamo dimostrato che humanin peptide-ha mediato l'attivazione di ERK1/2 si verifica a due diversi tipi di cellule, e la localizzazione subcellulare di attivazione di ERK1/2 può essere diversa a seconda delle condizioni (ad es., dose di peptide, punto del tempo e delle cellule tipo). È stato dimostrato che humanin segnali attraverso due diversi recettori22,23, che possono spiegare le differenze nella segnalazione tra le due linee cellulari come pur...

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Dichiarazioni

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Pinchas Cohen è un azionista e consulente per Kelvin CohBar, Inc., lo Yen ha servito come un consulente per CohBar, Inc.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato da un Ellison/AFAR Postdoctoral Fellowship nel programma di ricerca di invecchiamento di SJK, e un premio della Fondazione Glenn e NIH concede a PC (1P01AG034906, 1R01GM 090311, 1R01ES 020812). Tutti gli autori compaiono nel film.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
p44/42 MAPK (ERK1/2)Segnalazione cellulare9102Diluizione 1:1.000
fosfo-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204)Segnalazione cellulare4370Diluizione 1:1.000
Lamina B1Segnalazione cellulare12586Marcatore nucleare, Diluizione 1:1.000
GAPDHSegnalazione cellulare5174Marcatore citoplasmatico, Diluizione 1:2.000
Tom20Santa cruzSC-17764Marcatore mitocondri, Diluizione 1:2.000
coniugato anti-Coniglio-HRPSegnalazione cellulare7074Diluizione 1:30.000
RIPA Lisi ed estrazione TamponeThermoFisher SCIENTIFIC89900
Piatto di coltura da 100 mmThermoFisher SCIENTIFIC 12556002
Peptide HNGGenescript
25mm filtro per silingaThermoFisher SCIENTIFIC09-719A
HEPESSigmaH3375
MgCl2SigmaM8266
KClSigmaP9333
GlycerolSigmaG9012
Triton X-100ThermoFisher SCIENTIFICBP151-100
EDTASigma3609
MOPSSigmaM1254
EGTASigmaE3889
SaccarosioSigmaS7903
Tris-baseThermoFisher SCIENTIFICBP152-1
HCLSigmaH1758
PBSLonza17-512F
Raschietto cellulareFALCON353085
Halt™ Cocktail di inibitori della proteasi e della fosfatasi (100X)ThermoFisher SCIENTIFIC78440
Thomas Pestle Tissue Grinder Assemblaggi con pestelli lisciThomas Scientific3432S90
Tween-20ThermoFisher SCIENTIFICBP337-500
BSAThermoFisher SCIENTIFICBP1600-100
8-16% Mini-PROTEAN TGX Gel proteici prefabbricatiBIO RAD4561104
Trans-Blot Turbo TransferSystem BIO RAD1704150
Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer KitBIO RAD1704272
Clarity Western ECL Blotting SubstratiBIO RAD1705060
Restore Western Blot Stripping BufferThermoFisher SCIENTIFIC21059
Aquila modificata di Dulbecco MediaThermoFisher SCIENTIFIC11965-092
Sonicatore, Meda: FB120ThermoFisher SCIENTIFIC695320-07-12
Mini Trans-Blot Module BIO RAD 1658030

Riferimenti

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Peptidi di derivazione mitocondrialeWestern blottingColtura cellulareFrazione citoplasmaticaFrazione nucleareIsolamento mitocondrialeTrattamento con HumaninFosforilazione di ERK

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