Articolo metodologico

Siero e Plasma copia numero rilevazione mediante PCR in tempo reale

DOI:

10.3791/56502

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15 dicembre 2017

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1Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS

In questo articolo

Sommario

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Questo manoscritto descrive l'analisi di variazione numero copia eseguita nel siero o plasma del DNA usando metodo PCR in tempo reale. Questo metodo è adatto per la stima della resistenza ai farmaci nei pazienti con cancro della prostata resistente alla castrazione, ma potrebbe essere istruttivo anche per altre malattie.

Abstract

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DNA libero delle cellule di plasma e del siero (cfDNA) è stato indicato come fonte informativa, non-invasivo di biomarcatori per la diagnosi di cancro, la prognosi, il monitoraggio e la previsione della resistenza al trattamento. Partendo dall'ipotesi che ottenere il numero di copia del gene androgeno recettore (AR) (CN) è un evento frequente nel carcinoma della prostata resistenza di castrazione metastatico (mCRPC), ci proponiamo di analizzare questo evento in cfDNA come potenziali biomarker predittivo.

Abbiamo valutato CN AR in cfDNA utilizzando diversi 2 Real-Time PCR e 2 geni di riferimento (RNaseP e fa1). Quantità di DNA di 60 ng è stato utilizzato per ciascuna combinazione di test. AR Guadagno CN è stata confermata usando PCR digitale come un metodo più accurato. Analisi della variazione di CN sono già stato dimostrato di essere ben informato per la stima della resistenza al trattamento nella cornice di mCRPC, ma potrebbe essere utile anche per altri scopi in contesti diversi pazienti. Analisi CN il cfDNA ha diversi vantaggi: è non invasivo, rapido e facile da eseguire, e si inizia da un piccolo volume di materiale siero o plasma.

Introduzione

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Del DNA cellulare gratis (cfDNA) nel sangue di circolazione ha dimostrato di essere un'ottima fonte di biomarcatori per la diagnosi di cancro, la prognosi, il monitoraggio e la previsione del trattamento resistenza1,2. Molti studi hanno dimostrato una buona concordanza tra alterazioni del DNA (mutazioni, variazioni del numeri di copie, modificazioni epigenetiche nei tessuti) e quelli che si trovano nel corrispondente al plasma campioni1, confermando che circolanti del DNA del tumore (ctDNA) è informativo per tumore primario e metastatico del tessuto alterazioni3.....

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Protocollo

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Il protocollo comprende l'isolamento di DNA da campioni di siero o plasma per eseguire Real-Time PCR per l'analisi di numero di copia. Estrazione del DNA, controllo della quantità del DNA (spettrofotometro) e Real-Time PCR per obiettivi specifici sono stati effettuati. In Figura 1, sono riportate una sintesi delle procedure e linea del tempo.

Il protocollo segue le linee guida del Comitato di etica umana ricerca IRST.

1. il siero raccolta ed elaborazione

  1. Raccogliere circa 5 mL di sangue intero in una provetta siero senza anticoagulante per ottenere siero. Mantenere le pro....

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Risultati

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CfDNA totale concentrazione era quantificabile mediante spettrofotometria per tutti i campioni analizzati, mostrando una mediana di 6.12 ng / µ l (gamma: 2.00-23,71 ng / µ l) per i campioni di siero e una mediana di 3,21 ng / µ l (gamma: 2.31-8,49 ng / µ l) per campioni di plasma. Abbiamo analizzato un totale di 115 campioni mediante esperimenti di PCR in tempo reale.

Sensibilità del test è stata valutata utilizzando il DNA nel .......

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Discussione

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AR Analisi CN nel campione di siero e plasma rappresenta un nuovo approccio non invasivo per la stratificazione dei pazienti di carcinoma della prostata resistente alla castrazione (CRPC). Recentemente è stato dimostrato che il CN di AR è in grado di prevedere i risultati nei pazienti CRPC trattati con abiraterone ed enzalutamide, prima e dopo la chemioterapia7,8,9,10.

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Dichiarazioni

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Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Chiara Molinari e Filippo Martignano per supporto nell'analisi dei dati.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
BD Vacutainer Provette per sieroBecton Dickinson367814provetta per siero
BD Vacutainer EDTA ProvetteBecton Dickinson366643provetta per sangue intero per plasma
Etanolo assolutoVWRl'utente potrebbe utilizzare anche altre aziende
TaqMan Copy Number assayThermo Fisher Scientific4400291Saggi pre-progettati e convalidati con colorante FAM. Abbiamo utilizzato il seguente test: AR_assay1: hs04107225 e AR_assay2: hs04511283
TaqMan Copy Number assay (modificato)Thermo Fisher Scientific4467084Test pre-progettato modificato con VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn
TaqMan Copy Number Reference Assay, umano, RNase PThermo Fisher Scientific4403326
TaqMan Universal PCR Master MixThermo Fisher Scientific4326708Master mix per PCR in tempo reale
QIAamp DNA Mini kit (50)Kit di estrazione del DNAQiagen51304
Piastre a 96 pozzetti MicroAmpPiastre N8010560 Thermo Fisher Scientificper PCR in tempo reale
Spettrofotometro NanoDrop 1000Thermo Fisher Scientific:l'utente potrebbe utilizzare anche altri metodi spettrofotometrici per quantificare il
DNA 7500 Sistema PCR in tempo reale veloceBiosistema applicato:l'utente può utilizzare anche altri strumenti in tempo reale
CopyCaller Software,Biosistema applicatoper l'analisi del numero di copie
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Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Salvi, S., et al. Cell-free DNA as a diagnostic marker for cancer: current insights. Onco Targets Ther. 9, 6549-6559 (2016).
  2. Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer. Clin. Chem. 61 (1), 112-123 (2015).

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Siero PlasmaDNA cell freeRecettore degli androgeniNumero di copie genichePCR digitaleCancro alla prostataAnalisi dei biomarcatoriProcessazione di campioni di sangue

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