Articolo metodologico

Miglioramento protocollo per immunoprecipitazione della cromatina dal Mouse del muscolo scheletrico

DOI:

10.3791/56504

⸱

6 novembre 2017

 ,  ,  , 
1Department of Functional Genomics and Cancer, Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire

In questo articolo

Sommario

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Viene presentato un nuovo protocollo per la preparazione della cromatina dal muscolo scheletrico del topo adulto adattato allo studio della regolazione genica nelle fibre muscolari di immunoprecipitazione della cromatina.

Abstract

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Descriviamo un protocollo efficiente e riproducibile per la preparazione della cromatina dal muscolo scheletrico di topo adulto, un tessuto fisicamente resistente con un alto contenuto di proteine strutturali. Muscoli degli arti sezionati da topi adulti fisicamente sono interrotte da omogeneizzazione meccanica, o una combinazione di macinazione e douncing, in un buffer ipotonico prima della fissazione della formaldeide del lysate delle cellule. I nuclei fissi sono purificati da ulteriori cicli di omogeneizzazione meccanica o douncing e filtrazioni sequenziale per rimuovere i detriti cellulari. I nuclei purificati possono essere sonicati immediatamente o in una fase successiva dopo il congelamento. La cromatina può essere sonicata in modo efficiente ed è adatto per esperimenti di immunoprecipitazione della cromatina, come illustrato dai profili ottenuto per fattori di trascrizione, la RNA polimerasi II e modificazioni istoniche covalente. L'associazione di eventi rilevati utilizzando la cromatina preparata dal presente protocollo è principalmente quelli che si svolgono nei nuclei della fibra di muscolo nonostante la presenza di cromatina da altro satellite fibra-collegato e cellule endoteliali. Questo protocollo è pertanto adattato per studiare la regolazione genica in muscolo scheletrico del topo adulto.

Introduzione

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Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) accoppiato alla reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) e sequenziamento ad alta (ChIP-seq) sono diventati i metodi di scelta per lo studio di trascrizione e regolazione epigenetica dell'espressione genica in vari tessuti e tipi di cellule1. Questa tecnica permette di genoma profilatura di modificazioni covalenti della cromatina, occupazione variante dell'istone e fattore di trascrizione associazione2,3.

Mentre l'esecuzione di ChIP da cellule coltivate è ben consolidata, ChIP da tessuti di mammiferi rimane più impegnativo. Preparazione della cromatina per ChIP prevede diversi passaggi critici che devono essere ottimizzate per ogni tipo di tessuti e cellule. Cromatina può essere preparata da lisati cellulari delle cellule coltivate o seguente purificazione dei loro nuclei. Nel caso di tessuti di mammiferi, efficiente Lisi, fissazione di formaldeide e purificazione dei nuclei sono fondamentali al fine di garantire un recupero ottimale della cromatina. Inoltre, la scelta se risolvere i nuclei prima o dopo la loro purificazione deve essere determinato sperimentalmente. Nonostante questi ostacoli, il ChIP è stato eseguito con successo da tessuti quali fegato, testicolo o cervello4,5,6. Nel caso del muscolo scheletrico, la rottura di un tessuto resistente fisicamente, che esibisce un alto contenuto di proteine strutturali e l'isolamento dei suoi nuclei è particolarmente impegnativa. Data questa specificità, protocolli ottimizzati per altri tessuti non danno risultati soddisfacenti per i muscoli scheletrici.

Qui descriviamo un protocollo per isolare la cromatina ChIP-grado da tessuto muscolare scheletrico del mouse che coinvolge fisicamente interrompendo il tessuto, fissazione di formaldeide e quindi l'isolamento dei nuclei e sonicazione. L'efficienza di questo metodo per preparare cromatina adatta per ChIP da questo tessuto è stato dimostrato eseguendo ChIP-qPCR e ChIP-seq per vari fattori di trascrizione, RNA polimerasi II e istone covalente modifiche7.

Questa nuova tecnica è molto più veloce di un protocollo precedentemente segnalati8 composto da lunghi passaggi di digestione della collagenosi durante i quali, cambiamenti nella localizzazione genomica dei fattori di trascrizione e le alterazioni nell'espressione genica possono aver luogo. La rapidità con cui i nuclei sono isolati e fissa rende particolarmente attraente per preparare della cromatina che cattura più fedelmente lo stato nativo occupazione genomico il metodo qui descritto. Inoltre, anche se hanno altri metodi per l'estrazione di isolamento o proteine della cromatina da tessuto muscolare sono stato descritto8,9,10 e utilizzato per esperimenti di ChIP-qPCR su geni selezionati, nessun ChIP-seq dati sono stati segnalati li utilizzano. Il metodo segnalato qui è adatto per la modifica di fattore e istone trascrizione ChIP-seq e quindi dovrebbe anche essere adatto per 3 / 4C o applicazioni di acquisizione di HiC cromatina conformazione.

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Protocollo

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topi sono stati mantenuti in conformità con le linee guida istituzionali per quanto riguarda la cura e l'uso degli animali da laboratorio e conformemente alle linee guida nazionali di cura degli animali (Commissione europea direttiva 86/609/CEE; Decreto francese n. 87-848). Tutte le procedure sono state approvate dal comitato etico nazionale francese.

1. isolamento del tessuto muscolare

  1. sacrificio un adulto 6 a 8-settimana-vecchio mouse da dislocazione cervicale. Sterlise l'arto sciacquandolo con etanolo al 70% e sezionare i muscoli dell'arto (Gastrocnemius, Tibialis Anterior, quadricipiti) utilizzando forbici punta fine e forcipe.
    Nota: Un mouse dovrebbe produrre circa 500 mg di tessuto.
  2. Tritare i muscoli in una provetta da 2 mL contenente 1 mL di tampone ipotonico ghiacciata ad una preparazione omogenea di piccoli (< 2-3 mm 3) pezzi utilizzando bene le forbici e lasciare il tubo agitazione su un agitatore di panca superiore a 4 ° C per 5-10 min

2. Lisi del tessuto

Nota: fare riferimento alla tabella 1 per tutti i buffer composizioni.

  1. Trasferire l'omogeneizzato in una provetta di turno-fondo 14 mL e risospendere in 5 mL di tampone ipotonico freddo (inibitore della proteasi EDTA-free cocktail e PMSF).
    1. Homogenise tessuto muscolare macinate utilizzando un lisata sciolto (20-30 colpi entro 3 min) o un omogeneizzatore meccanica del tessuto per 15-30 s in tubi di turno-fondo 14 mL.
      Nota: L'efficienza di lisi può essere valutato in questa fase da microscopia chiara, e se necessario, possono essere eseguite ulteriori disagi.
  2. Trasferire l'omogeneizzato per provette da 15 mL e riempire il volume a 10 mL utilizzando buffer ipotonico freddo. Difficoltà l'omogeneizzato come descritto di seguito prima di procedere con il prossima mouse.

3. Fissazione

  1. aggiungere formaldeide all'1% di concentrazione finale e agitare per 10 min a temperatura ambiente.
  2. Aggiungere glicina ad una concentrazione finale di 0,125 M in ogni tubo per fermare la fissazione e agitare per 5-10 min a temperatura ambiente.

4. Preparazione di nuclei

Nota: fare riferimento alla tabella 1 per tutti i buffer composizioni.

  1. Homogenise la fissa lisato utilizzando un lisata sciolto (5-10 colpi).
    1. Trasferimento a un tubo da 15 mL e centrifugare a 1.000 x g per 5 min a 4 ° C per ottenere nuclei e detriti cellulari.
  2. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in fresco 5 mL di tampone ipotonico. Filtrare il lisato attraverso un colino di cella di 70 µm in una provetta da 50 mL. Filtrare nuovamente il filtrato attraverso un colino di cella di 40 µm.
  3. Trasferire il filtrato in una provetta da 15 mL e centrifugare a 1.000 x g per 5 minuti a 4 ° C per ottenere la pallina nucleare.
    Nota: In questa fase, i nuclei possono essere immediatamente sonicati o snap congelato come un pellet asciutto in azoto liquido e conservato a -80 ° C.

5. Sonicazione

  1. valutare il volume del pellet nucleare (circa 50 µ l per meccanici e lisata omogeneizzazione) e risospendere esso in tampone di sonicazione fino a 3 o 4 volte di volume nucleare ricco e trattare con ultrasuoni per 10-15 min a 4 ° C, utilizzando un sonicatore .
    Nota: La cromatina può essere analizzata immediatamente come descritto di seguito (6) o congelata e conservata a -80 ° C.

6. Valutare la dimensione del frammento di cromatina dopo sonicazione

Nota: fare riferimento alla tabella 1 per tutti i buffer composizioni.

  1. a de-reticolare, prendere 30 µ l di cromatina in una provetta da 1,5 mL e aggiungere 20 µ l 5m NaCl. Completano il volume a 500 µ l e incubare a 65 ° C durante la notte.
    1. Il giorno successivo, eseguire un trattamento con proteinasi K di 1 µ l (20 mg/mL di brodo), 10 µ l 2 M Tris pH 6,8 e 10 µ l di EDTA 0.5 M per 1 h a estrazione di eseguire un fenolo-cloroformio/cloroformio 42 ° C. e precipitare il DNA con 1 volume di sodio acetato e (3 M) e 2 volumi di etanolo al 100% per una h a-80 ° C, o a -20 ° C.
  2. Pellet il DNA mediante centrifugazione a 13.500 x g per 15 min. decantare il supernatante e lavare la pallina accuratamente con etanolo 70% freddo e centrifugare nuovamente per 5 min, decantare il supernatante e asciugare all'aria il pellet.
  3. Risospendere il pellet in volume originale (30 µ l) di buffer di TE. Misurare la concentrazione di DNA allo spettrofotometro di assorbanza a 260 nm/280 nm. Pipettare 500-1.000 ng di DNA con una scaletta di formato di DNA su corsie separate di un gel di agarosio 1.5% ed eseguire l'elettroforesi per valutare la dimensione del frammento della cromatina.
    Nota: Dimensione del frammento deve essere compresa tra 200-500 paia di basi e non ci dovrebbe essere nessun frammento rilevabile ad alto peso molecolare corrispondente a non o mal-frammentato DNA. Se necessario, la soluzione della cromatina (passo 5) può essere ri-sonicata per un tempo più lungo e quindi analizzata nuovamente come descritto sopra, fino ad ottenuta la dimensione ottimale.

7. Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP)

Nota: fare riferimento alla tabella 1 per tutti i buffer composizioni.

  1. Perle di sepharose blocco della proteina G di aliquotare 1 mL del liquame 50% in etanolo. Pellet i branelli mediante centrifugazione a 400 x g per 1 min in un benchtop centrifugare e lavare con 1 mL di TE buffer centrifuga a 400 x g e ripetere il wash.
    1. Dopo la seconda centrifugazione, risospendere in 1 mL di tampone di diluizione di ChIP con 25 µ l di BSA (stock 20 mg/mL) e 20 µ l lievito tRNA (stock 10 mg/mL). Bloccare le perline per almeno 2 h prima dell'uso di rotazione (40-60 giri/min) a 4 ° C.
    2. Diluire 50 µ g di cromatina (passo 5) 8-10 volte con tampone di diluizione dei ChIP. Aggiungere 50 µ l di liquami tallone bloccato e incubare per 2 h rotante (40-60 rpm) a 4 ° C. centrifuga a 400 x g a 4 ° C per ottenere pre-sgomberata cromatina e trasferirlo in una nuova provetta.
  2. Per immunoprecipitazione, aggiungere la quantità appropriata di anticorpo primario (ad es., 1-2 µ g / 10 µ g di cromatina) e incubare per una notte con rotazione a 4 ° C.
    Nota: La quantità ottimale di anticorpo può essere raccomandata dal fornitore o può essere determinata empiricamente eseguendo ChIP-qPCR con diverse quantità di anticorpo fino ad arricchimento ottima è osservare. Anche proteine G sepharose può essere sostituita da proteina A sepharose a seconda del sottotipo di anticorpo usato.
  3. Aggiungere le perline bloccate il giorno successivo e incubare per 1 h con rotazione (40-60 giri/min) a 4 ° C. centrifuga a 400 x g per 20-30 s a pellet le perline, rimuovere il supernatante e avviare il ChIP lava.
  4. ChIP lavaggi: eseguire i seguenti lavaggi con i buffer: una volta con tampone salino di basso e poi due volte con tampone salino elevato, due volte con tampone di LiCl e infine due volte con il tampone TE.
    1. Eseguire ogni lavaggio per 10 min con rotazione (40-60 giri/min) a 4 ° C e pellet le perline tra ogni lavaggio mediante centrifugazione a 400 x g per 20-30 secondi in una centrifuga da banco.
  5. Per eluizione, rimuovere l'ultimo lavaggio e risospendere le perle in 250 µ l di tampone di eluizione (preparata) per 15 min a temperatura ambiente agitando.
  6. Centrifuga a 400 x g e raccogliere l'eluato in una nuova provetta. Eseguire questo passaggio due volte e quindi de-crosslink l'eluato durante la notte con 20 µ l NaCl 5 M e 1 µ l della RNasi A (10 mg/mL), trattare con proteinasi K e cloroformio/del fenolo-cloroformio extragire come nel passaggio 6.
  7. Risospendere in 50 µ l di buffer di TE e utilizzare le aliquote per ChIP-qPCR secondo protocolli standard 15 per controllare la qualità del ChIP.

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Risultati

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Per isolare i nuclei, abbiamo effettuato omogeneizzazione meccanica del tessuto del muscolo dissecato e macinate per s o 15 o 45, a 18.000 e 22.000 giri/min (Vedi Tabella materiali). In tutte le condizioni, i nuclei hanno potevano essere separati dai detriti dei tessuti, ma la resa è stata ottima usando la velocità più bassa (Figura 1A-B). I nuclei potrebbero anche essere preparati da douncing per 3-5 min (

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Discussione

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Qui descriviamo un romanzo protocollo per la preparazione della cromatina da muscoli scheletrici topo adulto e dimostrano che la cromatina è adatta per gli esperimenti di ChIP che rilevano associazione di fattore di trascrizione e modificazioni istoniche covalente nei nuclei della fibra di muscolo. Questo protocollo prevede diversi passaggi critici. Il primo è la rottura del tessuto che possa essere eseguita mediante lisata o tosatura meccanica. Cesoia meccanica è più veloce e più riproducibile e pertanto è il metodo di ...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Ringraziamenti

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Ringraziamo tutto il personale della struttura di sequenziamento di IGBMC elevato throughput, un membro del Consorzio "Francia Génomique" (ANR10-INBS-09-08) e tutti i servizi generali di IGBMC in particolare il personale della struttura animale IGBMC. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal CNRS, INSERM, l'AFM, la Ligue Nationale contre le Cancer, i francesi dichiarano fondo attraverso l'ANR nell'ambito del programma d'Avenir Investissements etichettati ANR-10-IDEX-0002-02, Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 e il ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto. Santiago è stata sostenuta dal Ligue Nationale contre le Cancer, ANR-AR2GR-16-CE11-009-01 e V.U dal Ministère de l'enseignement et de la Recherche. ID è un 'équipe labellisée' della Ligue Nationale contre le Cancer.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
T 25 digitale ULTRA-TURRAXT 18 ULTRA-TURRAX0009022800
PMSFSIGMA-ALDRICH CHIMIE SARLP7626-25G
Inibitore della proteasi Cocktail-EDTA FreeRoche Diagnostics11873580001
Proteina G Perle di sefarosioSIGMA-ALDRICH CHIMIEP-3296
Proteinasi KSIGMA-ALDRICH CHIMIEP-2308
Filtri cellulari 70umCorning BV431751
Filtri cellulari 40umCorning BV352340
Formaldeide Grado EMEuromedex15710-S
Rnase AFischer Scientific 12091039
Fenolo:Cloroformio:Alcool isoamilico 25:24:1SIGMA-ALDRICH CHIMIEP3803
BSASIGMA-ALDRICH CHIMIEB4287-25G
lievito tRNASIGMA-ALDRICH CHIMIER5636
Glicogeno BluAMIBIONAM9516
Pol II ChIP AnticorpoSanta CruzSC-9001
H3K27ac ChIP AnticorpoActive Motif39133
Tead4 ChIP AnticorpoAviva Systems Biology(ARP38276_P050)
IGEPALSIGMA-ALDRICH CHIMIEI-3021
E220 Ultrasuoni focalizzatiCovaris E220
NomeAziendaNumero di catalogoComments
Articoli aggiuntivi
Forbici
Loose Dounce
Tubi Falcon da 15 ml e 50 ml
fondo tondo da 14 ml
Tubi Eppendorf
m e 40 μ filtri cellulari m (Corning)
Tubi ada 1,5 ml e 2 ml

Riferimenti

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  1. Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
  2. Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
  3. Wade, J. T. Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq. Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).
  4. Alpern, D., et al. TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation. Elife. 3, e03613(2014).
  5. Martianov, I., et al. Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells. BMC Genomics. 11, 530(2010).
  6. Achour, M., et al. Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington's disease mice. Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).
  7. Joshi, S., et al. TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo. PLoS Genet. 13 (2), e1006600(2017).
  8. Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. Myogenesis: Methods and protocols. DiMario, J. 798, Springer Science+Business Media LLC. 517-531 (2012).
  9. Dimauro, I., Pearson, T., Caporossi, D., Jackson, M. J. A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue. BMC Res Notes. 5, 513(2012).
  10. Thomas, J. L., et al. PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression. Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).
  11. Kuo, T., et al. Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).
  12. Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
  13. Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation. Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).
  14. Cowling, B. S., et al. Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy. J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).
  15. Thermo Fisher Scientific. ChIP Analysis. , Available from: https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html (2017).

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Chromatin PreparationMechanical HomogenizationFormaldehyde FixationNuclei PurificationSonication ProtocolDNA ExtractionChIP SequencingTranscription Factor Binding

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