Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento del mouse intero, intatto ghiandole mammarie per studiare l'espressione di matrice extracellulare (ECM) e morfologia duttale. Mouse #4 ghiandole addominali sono state estratte da topi femmine nullipare 8-10 settimane vecchio, fissato in formalina neutra tamponata, sezionato e macchiato usando immunohistochemistry per proteine ECM.
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Articolo metodologico
Isolamento delle ghiandole mammarie Mouse intatto, intero per l'analisi di espressione di matrice extracellulare e la morfologia della ghiandola
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'obiettivo di questa procedura era raccogliere le ghiandole mammarie addominale #4 da topi femmine nullipare al fine di valutare l'espressione di ECM e architettura duttale. Qui, una piccola tasca sotto la pelle è stata creata utilizzando forbici Mayo, permettendo la separazione delle ghiandole all'interno del tessuto sottocutaneo dal peritoneum sottostante. Visualizzazione delle ghiandole è stata aiutata dall'uso di 3.5 micro lenti di ingrandimento chirurgiche x-R. Il cuoio è stato invertito e frenate permettendo identificazione delle pastiglie grasse mammarie intatte. Ciascuna delle ghiandole addominali #4 senza mezzi termini è stato dissecato facendo scorrere la lama del bisturi lateralmente tra lo strato sottocutaneo e le ghiandole. Immediatamente dopo il raccolto, ghiandole sono state collocate in 10% formalina neutra tamponata per l'elaborazione successiva del tessuto. L'asportazione di intera ghiandola è vantaggioso perché principalmente Elimina il rischio di escludere importanti tutto il tessuto interazioni tra cellule epiteliali duttali e altre popolazioni cellulari microambientali che potrebbero essere perso in una biopsia parziale. Uno svantaggio della metodologia è l'uso delle sezioni di serie dai tessuti fissi che limita l'analisi dell'espressione di morfogenesi e proteica ductal per luoghi discreti all'interno della ghiandola. Come tale, cambiamenti nell'espressione della proteina e architettura duttale in 3 dimensioni (3D) non è facilmente ottenibile. Nel complesso, la tecnica è applicabile agli studi che richiedono tutto intatti murini ghiandole mammarie per le indagini a valle quali inerente allo sviluppo del cancro ductal di morfogenesi o al seno.
Introduzione
Cancro al seno è caratterizzato da un notevole grado di fibrosi del tessuto1,2,3,4. Indicato come ECM, questa entità non cellulare è trovata in vari gradi in tutti i tessuti e principalmente è costituita da un complesso reticolo di collageni fibrillari e non fibrillare, elastina e glicoproteine oltre a varie molecole di segnalazione che sono sequestrato in questa matrice. Condizioni omeostatiche, la deposizione e la degradazione dell'ECM è strettamente controllato. 5 durante il tumorigenesis mammario, l'equilibrio del....
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Protocollo
procedure che coinvolgono animali soggetti in questo protocollo sono stata esaminate e approvate dal comitato di uso del Philadelphia College di medicina osteopatica e istituzionali Animal Care e tutte le tecniche sono state condotte sotto rigoroso linee guida etiche.
1. esempio approvvigionamento e trattamento
- selezionare appropriato soggetto animale e posto in una camera di CO 2. Per questo esperimento, utilizzare 8-10 settimane vecchio donna nullipara B6. CG-Cav1tmMIs/J e C57BI/6J.
- Disabilita il flusso del gas a 30-40%. Una volta che l'animale è visibilmente incosciente dopo circa 2 min, aprire la valvola....
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Risultati
I topi femminili hanno 5 paia di ghiandole mammarie. In particolare, c'è una coppia di ghiandole cervicali (#1), due paia di ghiandole toraciche (#2 e #3), una coppia di ghiandole addominali (#4) e 1 paio di ghiandole inguinali (#5) (Figura 1A). Qui, abbiamo isolato le ghiandole #4 come sono facilmente identificabili. In alcune circostanze, sia #4 e #5 ghiandole sono state isolate insieme come distinzione tra i due era difficile. Per isolare .......
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Discussione
Nel libro, abbiamo descritto una tecnica per isolare le ghiandole mammarie del mouse intatto per le analisi istologiche a valle di espressione di ECM e morfologia duttale. Per quanto riguarda l'analisi della morfologia duttale, questa metodologia consente l'indagine rapida dell'architettura duttale basata al largo di sezioni istologiche macchiate. Altri metodi di analisi ductal si basano sulle iniezioni di coloranti per consentire la visualizzazione dell'albero duttale, metodi che possono essere tecnicamente impegnativo .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desidera ringraziare aprile Wiles e Dr. Roger Broderson per assistenza con l'autopsia degli animali e l'isolamento della ghiandola, rispettivamente. Finanziamenti per quest'opera è stato sostenuto dai centri di Philadelphia College of Osteopathic Medicine per malattie croniche di invecchiamento.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Microscopio ottico | Olympus | BX43 | |
| Fotocamera per microscopio | Olympus | DP73 | |
| Software di analisi delle immagini | Olympus | cellSens Software | |
| NIH | ImageJ | ||
| 3.5x-R Micro lenti chirurgiche | Rose Micro Solutions | Ingrandimento a preferenza del ricercatore | |
| Mayo Forbici | Medline | DYND04035 | |
| Rack per colorazione | Fisher Scientific | 121 | |
| Piatto per colorazione | Fisher Scientific | 112 | |
| Barattoli Coplin | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Vetrini coprioggetti | in vetro Fisher Scientific | 12-550-15 | Dimensioni appropriate per il tessuto |
| IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+) | Dako | K400611-2 | |
| Picrosirius Red Kit | Abcam | AB150681 | |
| Eosin Y, alcolico | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| Harris Hematoxylin | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Siero d'asino | EMD Millipore | S30 | |
| 10% Formalina tamponata neutra | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Xileni, grado reagente | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| etanolo, 200 proof | Sigma-Aldrich | 792780 | adatto per biologia molecolare |
| Soluzione salina tamponata con fosfato, 1x | Gibco | 10010023 | |
| citrato di sodio | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Carbonato di calcio | Sigma-Aldrich | 202932 | |
| permanente Mezzo di montaggio | Dako | S1964 | |
| Eukitt's Mezzo di montaggio | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| Anticorpo fibronectina | Abcam | AB23750 | |
| Anticorpo Tenascin-C | Abcam | AB108930 | |
| Alpha Smooth Muscle Actin Anticorpo | Abcam | AB124964 | |
| Dako Envision Dual Link System HRP | Dako | K4065 |
Riferimenti
- Gao-Feng Xiong, R. X. Function of cancer cell-derived extracellular matrix in tumor progression. J Cancer Metastasis Treat. 2, 357-364 (2016).
- Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13 (6), 227(2011).
- Provenzano, P. P., ....
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Ristampe e permessi
