Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento del mouse intero, intatto ghiandole mammarie per studiare l'espressione di matrice extracellulare (ECM) e morfologia duttale. Mouse #4 ghiandole addominali sono state estratte da topi femmine nullipare 8-10 settimane vecchio, fissato in formalina neutra tamponata, sezionato e macchiato usando immunohistochemistry per proteine ECM.
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Articolo metodologico
Isolamento delle ghiandole mammarie Mouse intatto, intero per l'analisi di espressione di matrice extracellulare e la morfologia della ghiandola
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'obiettivo di questa procedura era raccogliere le ghiandole mammarie addominale #4 da topi femmine nullipare al fine di valutare l'espressione di ECM e architettura duttale. Qui, una piccola tasca sotto la pelle è stata creata utilizzando forbici Mayo, permettendo la separazione delle ghiandole all'interno del tessuto sottocutaneo dal peritoneum sottostante. Visualizzazione delle ghiandole è stata aiutata dall'uso di 3.5 micro lenti di ingrandimento chirurgiche x-R. Il cuoio è stato invertito e frenate permettendo identificazione delle pastiglie grasse mammarie intatte. Ciascuna delle ghiandole addominali #4 senza mezzi termini è stato dissecato facendo scorrere la lama del bisturi lateralmente tra lo strato sottocutaneo e le ghiandole. Immediatamente dopo il raccolto, ghiandole sono state collocate in 10% formalina neutra tamponata per l'elaborazione successiva del tessuto. L'asportazione di intera ghiandola è vantaggioso perché principalmente Elimina il rischio di escludere importanti tutto il tessuto interazioni tra cellule epiteliali duttali e altre popolazioni cellulari microambientali che potrebbero essere perso in una biopsia parziale. Uno svantaggio della metodologia è l'uso delle sezioni di serie dai tessuti fissi che limita l'analisi dell'espressione di morfogenesi e proteica ductal per luoghi discreti all'interno della ghiandola. Come tale, cambiamenti nell'espressione della proteina e architettura duttale in 3 dimensioni (3D) non è facilmente ottenibile. Nel complesso, la tecnica è applicabile agli studi che richiedono tutto intatti murini ghiandole mammarie per le indagini a valle quali inerente allo sviluppo del cancro ductal di morfogenesi o al seno.
Introduzione
Cancro al seno è caratterizzato da un notevole grado di fibrosi del tessuto1,2,3,4. Indicato come ECM, questa entità non cellulare è trovata in vari gradi in tutti i tessuti e principalmente è costituita da un complesso reticolo di collageni fibrillari e non fibrillare, elastina e glicoproteine oltre a varie molecole di segnalazione che sono sequestrato in questa matrice. Condizioni omeostatiche, la deposizione e la degradazione dell'ECM è strettamente controllato. 5 durante il tumorigenesis mammario, l'equilibrio della deposizione di ECM e degradazione viene interrotto. Come tale, i tumori del seno sono stati segnalati per esprimere proteine ECM abbondanti come il collagene, fibronectina e tenascin-C tra gli altri. 6 l'espressione anormale di queste proteine oltre ai modelli di maggiore di reticolazione della matrice è stato documentato per promuovere seno tumore progressione, metastasi e terapia resistenza1,3, 4,7,8,9.
Per valutare la composizione di ECM e morfologia duttale, isolamento delle ghiandole mammarie intatti è stato effettuato. Qui, abbiamo usato donna nullipari topi carenti per caveolin-1, una proteina integrale di membrana che è stata collegata a un aggressivo al seno tumore firma10,11,12e controllo donna nullipara B6 topi. Istologica di lavorazione e colorazione di questi tessuti consentito l'identificazione di parecchie proteine ECM insieme a caratterizzazione della morfologia duttale.
Nel complesso, l'isolamento delle ghiandole mammarie interi, intatti offre ai ricercatori l'opportunità di studiare i cambiamenti morfologici o cellulare di tutto il tessuto che si verificano in risposta a fattori esogeni o endogeni. Svantaggi della tecnica sono associati con analisi delle sezioni del tessuto di 2 dimensioni (2D) al contrario di una prospettiva 3D, che produrrebbe un'immagine più completa della complessa morfologia dell'albero duttale. Data la complessità delle interazioni cellula-cellula e cellula-ECM che si svolgono nella ghiandola mammaria, l'isolamento delle ghiandole interi, intatti è vantaggioso per analizzare in modo efficiente ductal morfologia ed espressione della proteina in varie regioni di mammario murino della ghiandola.
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Protocollo
procedure che coinvolgono animali soggetti in questo protocollo sono stata esaminate e approvate dal comitato di uso del Philadelphia College di medicina osteopatica e istituzionali Animal Care e tutte le tecniche sono state condotte sotto rigoroso linee guida etiche.
1. esempio approvvigionamento e trattamento
- selezionare appropriato soggetto animale e posto in una camera di CO 2. Per questo esperimento, utilizzare 8-10 settimane vecchio donna nullipara B6. CG-Cav1tmMIs/J e C57BI/6J.
- Disabilita il flusso del gas a 30-40%. Una volta che l'animale è visibilmente incosciente dopo circa 2 min, aprire la valvola del gas a piena pressione per un minimo di 5 ulteriori
Nota: Confermare la morte degli animali osservando i segni visibili di respirazione (es. movimento del torace) per un periodo di 10 min dopo cessazione della CO 2 consegna. Se l'animale è ancora vivo, può essere inserito nel vano di CO 2. Dislocazione cervicale può anche essere utilizzata anche se non è raccomandato in quanto sangue può accumularsi intorno alle ghiandole mammarie interferire con i risultati e dissezione. - a seguito di sacrificio, perno carcassa in posizione supina e saturare con etanolo al 70%.
- Pizzicare la pelle appena sopra il pube usando il forcipe e nick con piccole forbici chirurgiche. Ruotando le forbici, tagliare la pelle lungo la linea mediana ventrale spostamento caudale alla cranica.
- Con grandi forbici o una pinza emostatica, senza mezzi termini sezionare la fascia sottocutanea bilateralmente, prestando attenzione a non per perforare il peritoneo. Tagliare lungo i margini orizzontali ad entrambe le estremità distale dell'incisione.
- Pin pelle lembi aprire e spruzzare di nuovo con etanolo al 70%.
Nota: Sebbene migliore distinzione visiva tra la ghiandola e il tessuto sottocutaneo circostante è consentito l'uso di etanolo al 70%, prestare attenzione per evitare la disidratazione del tessuto a seguito di utilizzo di questa soluzione. Per evitare l'essiccazione, è necessario rimuovere la ghiandola in un lasso di tempo non deve superare i 4 min. Come alternativa all'etanolo al 70%, lo sperimentatore può anche sostituire un buffer isolato generale, ad esempio di PBS 1X, per evitare il disseccamento del tessuto. - Individuazione ghiandole mammarie di interesse, far scorrere una lama per bisturi #4 lungo la parte interna delle alette pelt, taglio la ghiandola mammaria ed adiposo cutaneo associato gratuito dal derma.
Nota: micro chirurgici Occhialini 3.5 x può essere di aiuto in più facile visualizzazione delle ghiandole. - Immergere immediatamente appena isolata ghiandola nella provetta contenente il volume di soluzione 10:1-tessuto di 10% formalina neutra tamponata per 24-48 h.
Nota: A seconda dell'intenzione di studio, molti fissativi alternativi possono essere utilizzati come paraformaldeide, etanolo per studi di genomici e commercialmente disponibile RNA preservando buffer. - Seguire protocolli istituzionali per inclusione in paraffina, invio di campioni a un fornitore per l'elaborazione, l'incorporamento e affettare/scivolo montaggio. Sezione di tessuti a 5 µm.
Nota: A causa di eccesso adiposa ghiandola circostante, provare a rimuovere 100-200 µm del tessuto prima di sezionamento e macchiatura.
2. Colorazione del tessuto
- Immunohistochemistry
- diapositive posto per essere colorato sul blocco termico impostato a 58 ˚ c per 1 h sciogliere la paraffina.
Attenzione: Paraffina, cera di fusione può essere eseguito fuori diapositiva. Monitorare attentamente o collocare tampone imbevuto sotto slide per catturare cera ballottaggio.
Nota: Questo passaggio non è essenziale e può essere ignorato. Se i risultati non sono come previsto, l'aggiunta di questo passo indietro può migliorare i risultati. - Incubare diapositive in una diapositiva di vaso contenente 100% xilene per 30 min garantendo la completa immersione. Ripetere un' volta.
Nota: A questo punto, ispezione visiva deve essere eseguita per garantire che le sezioni di tessuto sono prive di tessuto adiposo e paraffina. Se il tessuto adiposo supplementare o cera è evidente, la diapositiva deve essere immersi nuovamente in xilene. Prestare attenzione per ridurre al minimo l'esposizione aggiunto a xilene come questo può causare il restringimento del tessuto. - Tessuti di reidratare in un barattolo di diapositiva contenente etanolo al 100% per un minimo di 10 ripetono un' volta.
- Mossa diapositive a un barattolo di diapositiva contenente etanolo al 95% per un minimo di 10 ripetono un' volta.
- Spostare le diapositive a una diapositiva vaso contenente 75% di etanolo per 5 min
- Spostare le diapositive a un diapositiva barattolo contenente 50% di etanolo per 5 min.
- Bollire la soluzione di citrato di sodio di 10 mM (pH 6.0) in un piatto caldo o un forno a microonde e versare nella vaschetta di Coplin.
Attenzione: Soluzione durante il riscaldamento di monitorare attentamente e prestare attenzione per evitare l'ebollizione sopra. Contenitore sarà molto calda. Utilizzare la protezione per evitare scottature. - Lentamente posto diapositive in Coplin jar, garantendo la completa immersione e incubare a 100 ° C per 10 minuti recuperare gli epitopi. Rimuovere e asciugare accuratamente diapositive.
- Disegnare una barriera intorno sul tessuto con un pennarello idrofobo. Aggiungere sufficiente blocco degli enzimi endogeni (perossido di idrogeno e sodio azide, disponibile in commercio) per ricoprire il tessuto e incubare per 10 min.
- Diapositive di sommergere in 1 fosfato x tampone salino (PBS) per 10 min.
- Aggiungere abbastanza siero di asino di 10% in PBS 1X per ricoprire il tessuto e incubare per 1 h a temperatura ambiente in una camera umidificata.
Nota: L'esperimento può essere sospeso qui memorizzando i vetrini nella camera umidificata a 4 ° C durante la notte. Mentre asino siero è stato trovato per produrre risultati ottimali di colorazione, lo sperimentatore può voler testare diversi sieri come albumina di siero bovino (BSA), siero di capra o di siero equino per determinare un risultato ottimale. Se usando BSA, lo sperimentatore deve preparare questo fresco prima dell'uso. - Decantare in eccesso blocker da diapositive e aggiungere anticorpo primario correttamente diluito in 1% siero direttamente a diapositive assicurando che il tessuto sia coperto uniformemente nella soluzione. Incubare per 30 min a temperatura ambiente in una camera umidificata.
Nota: Questo passaggio può essere continuato per periodi di tempo più lunghi con camera umida conservata a 4 ° C. Assicurati di inserire diapositive di adeguato controllo negativo (ad esempio una diapositiva con nessun anticorpo primario, noto tessuto antigene-negativi, ecc.) in questa fase. - Accuratamente lavare i vetrini da che scorre circa 1 mL di diH 2 O del tessuto ed incubare 1 cambio di 1X PBS per 5 min.
- Decantare l'eccesso di PBS e aggiungere abbastanza etichetta di perossidasi di rafano per ricoprire il tessuto ed incubare per 30 min in una camera umidificata.
Nota: In questa fase, l'investigatore può voler procedere alla colorazione utilizzando anticorpi secondari coniugati fluorescente fluorescente. Se questo è desiderato, i prossimi passi descritti dovrebbero essere modificati di conseguenza. - Accuratamente lavare i vetrini da che scorre circa 1 mL di diH 2 O del tessuto ed incubare 1 cambio di 1X PBS per 5 min.
- Fare diaminobenzidina (DAB) plus soluzione cromogena secondo il rapporto consigliato del produttore e mescolare Vortex.
Nota: Molti kit già pronti sono disponibili in commercio oltre a quello utilizzato in questo protocollo. - Eccesso di decantare buffer da diapositive e aggiungere 2-3 gocce (10-50 µ l) di cromogeno macchia direttamente ai tessuti e Incubare per 5 minuti in camera umida. Lavare accuratamente le diapositive da che scorre circa 1 mL diH 2 O del tessuto.
Attenzione: Il cromogeno DAB è altamente tossico. Evitare il contatto diretto della macchia con pelle e raccogliere il flusso fuori in rifiuti pericolosi.
- diapositive posto per essere colorato sul blocco termico impostato a 58 ˚ c per 1 h sciogliere la paraffina.
- Ematossilina ed eosina (H & E)
- dopo il risciacquo finale dopo incubazione di cromogeno, immergere diapositive in ematossilina di Harris per diapositive di risciacquo 2-2.5 min delicatamente sotto l'acqua corrente per un minimo di 1-2
Nota: fare attenzione a evitare il getto diretto di acqua sui tessuti. - Submerge diapositive per 2-3 e in soluzione di differenziazione (0,25 mL di acido cloridrico in 100 mL di etanolo al 70%). Sciacquare i vetrini delicatamente sotto l'acqua corrente per circa 1-2 min
- Immergere diapositive in agente blu (4,5 mg di carbonato di calcio in 100 mL acqua di rubinetto, pH regolato a 9,4) per 60 s. diapositive di risciacquo in etanolo al 95% per 30 s.
- Diapositive di sommergere in alcolica eosina Y per 2-3 min.
- Disidratare tessuto in 2 cambi di etanolo al 95% per 1 min ogni.
- Tessuto di disidratare in 1 cambiare di etanolo al 100% per 1 min.
- Asciugare accuratamente le diapositive con un panno privo di lanugine. Applicare 1 goccia (circa 100-200 µ l) di sintetico, non acquoso, media per far scorrere e coprire con vetrino coprioggetto di montaggio a base di resine.
Nota: Se è stato scelto un diverso metodo di colorazione, un supporto di montaggio può essere richiesto. Per esempio, se il ricercatore ha scelto un anticorpo secondario coniugato fluorescente, un montaggio acquoso sarebbe più ideale. - Vetrini impostare una notte a temperatura ambiente.
- dopo il risciacquo finale dopo incubazione di cromogeno, immergere diapositive in ematossilina di Harris per diapositive di risciacquo 2-2.5 min delicatamente sotto l'acqua corrente per un minimo di 1-2
- Percentuale rosso (PSR) colorazione
- scegliere diapositive da essere macchiato e seguire il protocollo di esame immuno-istochimico tramite il passaggio 6 (ammollo 50% etanolo).
- Diapositive di immergere nel PSR macchia per 1 h.
- Immergere i vetrini in 0,5% di acido acetico per 1-2 s, due volte a differenziare macchia.
- Disidratare tessuti in 2 cambi di etanolo al 95% per 1 min ogni.
- Tessuti di disidratare in 1 cambiare di etanolo al 100% per 1 min.
- Cancellare diapositive immergendo brevemente in xilene 100% per circa 3-4 s.
- Asciugare accuratamente le diapositive con un panno privo di lanugine. Applicare 1 goccia (circa 100-200 µ l) di sintetico, non acquoso, media per far scorrere e coprire con vetrino coprioggetto di montaggio a base di resine.
3. Analisi di esempio
- Ductal analisi
- selezionare vetrini colorati per α-SMA. Utilizzando un microscopio ottico dotato di un obiettivo telecamera montata, raccogliere immagini rappresentative a 20 ingrandimenti.
- Using ImageJ (NIH), distinguere e contare condotti in ogni immagine. Questi possono essere enumerati manualmente o uno può assegnare un punteggio numerico a condotti singoli. Per assegnare un punteggio numerico, aprire ImageJ e selezionare plug-in. Successivamente selezionare Analyze e scegliere contatore di cellule dal menu a discesa. Fare clic su Inizializza quindi evidenziare tipo 1 per iniziare etichettatura condotti. Al termine, selezionare risultati per visualizzare il conteggio ductal.
Nota: fare attenzione a verificare che siano strutture ductal e non vascolare. - In ' misura impostare ' opzioni, verifica ' perimetrale ' e ' zona ".
- Con lo strumento poligono a mano libera, tracciare una linea intorno ogni condotto presso il vano myoepithelial (visibilità aiutata dalla macchia del α-SMA). Selezionare ' misura ' e registrare il perimetro e area.
- Nuovamente utilizzando lo strumento poligono a mano libera, disegnare una linea lungo il lato apicale dell'epitelio duttale all'interno del lume. Selezionare ' misura ' e registrare il perimetro e area.
- Sottrarre il perimetro del vano luminal dal perimetro del vano myoepithelial al fine di ottenere la circonferenza dell'epitelio duttale. Sottrarre l'area del vano luminal dall'area del vano myoepithelial per ottenere l'area dell'epitelio duttale.
- Analisi Immunohistochemistry
- caricare immagini di campo chiaro un software analitici, quali ImageJ o FIJI Suite.
Nota: Questo protocollo vengono delineati i passaggi per la macchiatura analisi usando ImageJ e il plugin Toolbox IHC. - Aprire la Toolbox di IHC dal menu Plugin. Nella " Seleziona modello " casella combinata che si apre, selezionare macchia appropriato (cioè H-DAB, PSR, ecc.). Selezionare il " colore " opzione per isolare la macchia. Verrà aperta una finestra risultato.
Nota: Questo metodo è appropriato se una proteina di interesse è situata negli spazi extracellulari o citosolici, o è associata alla membrana plasmatica. Se la proteina di interesse è nucleare, selezionando " Nuclei " verrà richiesto il plugin per analizzare l'immagine per nuclei positivamente macchiati. - Utilizzare il Color Chooser Slide per garantire il corretto isolamento della macchia senza sfondo inclusione o esclusione eccessiva macchia.
Nota: Se la modalità automatica è in grado di rilevare la macchia o non si traduca in immagini accettabili, disegnare un quadrato regione di interesse (ROI) sopra un identificati macchiato regione. Nella finestra di IHC casella degli strumenti, selezionare " ferroviaria " per dirigere il plugin alla destinazione appropriata. - Convertire l'immagine a 16 bit. Vai alla immagine → tipo → 16bit.
- Soglia l'immagine. Vai alla immagine → regolare → Auto soglia.
- Impostare la scala di misurazione immagine tracciando una linea ROI direttamente sopra la barra della scala nell'immagine assegnando la lunghezza. Per impostare la barra della scala, vai su Analyze → Imposta scala. Immettere il numero di pixel per unità di lunghezza (per esempio 120 pixel per 50 µm) desiderata.
- Misurare l'area risultante e valore grigio medio. Vai alla Analyze → impostare misure e raccogliere la misurazione cliccando Analyze → misura.
- caricare immagini di campo chiaro un software analitici, quali ImageJ o FIJI Suite.
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Risultati
I topi femminili hanno 5 paia di ghiandole mammarie. In particolare, c'è una coppia di ghiandole cervicali (#1), due paia di ghiandole toraciche (#2 e #3), una coppia di ghiandole addominali (#4) e 1 paio di ghiandole inguinali (#5) (Figura 1A). Qui, abbiamo isolato le ghiandole #4 come sono facilmente identificabili. In alcune circostanze, sia #4 e #5 ghiandole sono state isolate insieme come distinzione tra i due era difficile. Per isolare ...
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Discussione
Nel libro, abbiamo descritto una tecnica per isolare le ghiandole mammarie del mouse intatto per le analisi istologiche a valle di espressione di ECM e morfologia duttale. Per quanto riguarda l'analisi della morfologia duttale, questa metodologia consente l'indagine rapida dell'architettura duttale basata al largo di sezioni istologiche macchiate. Altri metodi di analisi ductal si basano sulle iniezioni di coloranti per consentire la visualizzazione dell'albero duttale, metodi che possono essere tecnicamente impegnativo ...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desidera ringraziare aprile Wiles e Dr. Roger Broderson per assistenza con l'autopsia degli animali e l'isolamento della ghiandola, rispettivamente. Finanziamenti per quest'opera è stato sostenuto dai centri di Philadelphia College of Osteopathic Medicine per malattie croniche di invecchiamento.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Microscopio ottico | Olympus | BX43 | |
| Fotocamera per microscopio | Olympus | DP73 | |
| Software di analisi delle immagini | Olympus | cellSens Software | |
| NIH | ImageJ | ||
| 3.5x-R Micro lenti chirurgiche | Rose Micro Solutions | Ingrandimento a preferenza del ricercatore | |
| Mayo Forbici | Medline | DYND04035 | |
| Rack per colorazione | Fisher Scientific | 121 | |
| Piatto per colorazione | Fisher Scientific | 112 | |
| Barattoli Coplin | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Vetrini coprioggetti | in vetro Fisher Scientific | 12-550-15 | Dimensioni appropriate per il tessuto |
| IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+) | Dako | K400611-2 | |
| Picrosirius Red Kit | Abcam | AB150681 | |
| Eosin Y, alcolico | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| Harris Hematoxylin | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Siero d'asino | EMD Millipore | S30 | |
| 10% Formalina tamponata neutra | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Xileni, grado reagente | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| etanolo, 200 proof | Sigma-Aldrich | 792780 | adatto per biologia molecolare |
| Soluzione salina tamponata con fosfato, 1x | Gibco | 10010023 | |
| citrato di sodio | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Carbonato di calcio | Sigma-Aldrich | 202932 | |
| permanente Mezzo di montaggio | Dako | S1964 | |
| Eukitt's Mezzo di montaggio | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| Anticorpo fibronectina | Abcam | AB23750 | |
| Anticorpo Tenascin-C | Abcam | AB108930 | |
| Alpha Smooth Muscle Actin Anticorpo | Abcam | AB124964 | |
| Dako Envision Dual Link System HRP | Dako | K4065 |
Riferimenti
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