Articolo metodologico

Un metodo semplice ed efficace per stabilire NK e linee a cellula T da pazienti con infezione attiva cronica del Virus di Epstein - Barr

DOI:

10.3791/56515

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30 marzo 2018

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1Genetic Resources Center, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, 2MOE Key Laboratory of Major Diseases in Children, National Key Discipline of Pediatrics, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Beijing Key Laboratory of Pediatric Respiratory Infection Diseases, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, 3State Key Laboratory of Molecular Developmental Biology, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences

In questo articolo

Sommario

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Un metodo semplice per ottenere cloni delle cellule T e NK dai pazienti CAEBV è stato sviluppato con alta efficienza, una piccola quantità di sangue periferico e una basso-dose del-2.

Abstract

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Un numero di metodi è state descritto per stabilire linee di cellule NK/T da pazienti con sindrome di linfoma o lymphoproliferative. Questi metodi impiegati le cellule di alimentatore, le cellule NK o T purificate per quanto 10 ml di sangue o un'alto-dose del-2. Questo studio presenta un nuovo metodo con una strategia semplice e potente per stabilire linee delle cellule T e NK, coltivando il periferico del sangue cellule mononucleari (PBMC) con l'aggiunta del-2 di umana ricombinante (rhIL-2) e utilizza più di 2 mL di sangue intero. Le cellule possono proliferare rapidamente in due settimane ed essere mantenute per più di 3 mesi. Con questo metodo, 7 linee NK o cellula T sono state stabilite con un alto tasso di successo. Questo metodo è semplice, affidabile e applicabile alla creazione di linee cellulari da più casi di linfoma a cellule NK/T o CAEBV.

Introduzione

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Virus di Epstein - Barr (EBV) è onnipresente e infetta non solo le cellule di B, ma anche T e cellule natural killer (NK), che provoca una serie di malattie linfoproliferative EBV-associati NK/T (LPD) e linfoma/leucemia, quali hemophagocytic EBV-associati lymphohistiocytosis, Idroa vacciniforme-come linfoma, extranodal linfoma a cellule NK/T, tipo nasale e NK aggressivo delle cellule di leucemia1,2,3. Tra questi è attivo EBV (SCAEBV) la malattia cronica severa, che è incidente principalmente in Asia orientale, e che è ora considerato un LPD causati dall'espansione clonale di EBV-infettate T o NK cellule4,5,6, 7, ma senza l'immunodeficenza apparente presenti nella mononucleosi contagiosa (IM)-come i sintomi compreso febbre, epatosplenomegalia, linfoadenopatia e disfunzione del fegato con insistenza o periodica, nonché alto EBV-DNA carico nella sangue periferico8,9. Pazienti con CAEBV hanno una prognosi difficile10,11e la relativa patogenesi e il ruolo dell'EBV è poco chiaro. Pertanto, le linee derivate da malattie linfoproliferative EBV-associati NK/T cellulari e linfomi sono molto utili come modelli cellulari per chiarire il meccanismo di EBV indotta da proliferazione NK o cellula T e la sua relazione con alta incidenza di leucemia o linfoma.

Ad oggi, parecchie linee cellulari sono state stabilite con diverse tecniche12,13,14,15,16. Una linea di cellule NK umana, NK-YS, è stata fondata da leucemia/linfoma a cellule NK, di co-coltura con una linea di cellule stromali di topo come alimentatore e in presenza di rhIL-2 ad una concentrazione di 20U per mL15. Kai3 era un'altra linea di cellule NK stabilita da pazienti con un'allergia grave zanzara o SCAEBV con linea cellulare autologo linfoblastoidi (LCL), cellule di B trasformate da EBV, come le cellule di alimentatore e aggiunta di rhIL-2 a 100U/mL16. SNK6 e SNT8 sono stati derivati da tessuti tumorali di pazienti di linfoma a cellule NK/T nasali con l'aggiunta della alto-dose di rhIL-2 (700U/mL)12. Con tecnica simile, la cella di SNK-1 era da pazienti CAEBV, coltivati da PBMC rimuovendo le cellule di T e aggiungendo 700U/mL rhIL-213,17. SNT13 e SNT15 sono stati stabiliti tramite la rimozione di CD4 + e CD8 + cellule18. Finora, altre linee cellulari delle cellule T e NK dai pazienti EBV-NK/T LPD sono stati sviluppati con questo metodo19.

Gli svantaggi dei metodi esistenti di cui sopra comprendono l'impiego di cellule di alimentatore, il requisito di un alto-dose del-2, l'utilizzazione di quanto 10 mL di sangue intero o la purificazione delle cellule di NK/T, che è molto impegnativo in clinica a causa la necessità di verificare quali tipi di cella che EBV latente infetta prima di iniziare a cultura. Come CAEBV si verifica principalmente nei bambini in Asia, 10 mL di sangue non è facile acquisire in tutte le regioni. In questo studio, abbiamo sviluppato un nuovo metodo semplice con un alto tasso di successo per stabilire linee NK e/o cellula T coltivando PBMC dai pazienti CAEBV utilizzando una basso-dose di rhIL2 e un volume di 2 mL di sangue intero senza cellule di alimentatore. I risultati di questo metodo hanno dimostrato la sua elevata efficienza e risparmio di tempo.

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Protocollo

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Questo studio è stato approvato dal comitato etico del Istituto di genetica e biologia dello sviluppo, Accademia cinese delle scienze, e il protocollo segue le linee guida istituzionali per benessere umano.

Nota: Vedere la Figura 1 per una schematica del flusso di lavoro.

1. isolamento di PBMC dai pazienti CAEBV

  1. Purificare il primario PBMC da 2 mL di sangue intero di pazienti CAEBV di sfumatura (ad es., Ficoll-placca) centrifugazione seguendo le istruzioni del produttore. In alternativa, scongelare PBMC crioconservati da azoto liquido con medium RPMI 1640.
  2. Aggiungere 2 µ l di trypan blu (0,4%) alla sospensione di cellule di µ l 18, attendere per 3 min a macchiare le cellule, trasferire la sospensione per la contropiastra di cella e misurare la concentrazione delle cellule e la redditività con un contatore di cellule automatizzato.
  3. Preparare la sospensione cellulare ad una densità di 2-3 × 106 cellule/mL completati con terreno di coltura RPMI 1640 completo contenente 20% di siero umano (calore inattivato a 56 ° C), 2 mM L-Glutammina e gli antibiotici (100 µ g/mL di streptomicina, 100 U/mL di penicillina). Semi di 1 mL di sospensione PBMC per pozzetto in piastre per colture cellulari a 24 pozzetti.
  4. Aggiungere 150 U rhIL-2 per pozzetto.
  5. Posizionare le piastre di coltura in un 5% CO2 incubatore a 37 ° C.
  6. Il giorno 2, osservare la morfologia delle cellule al microscopio (ingrandimento X 200); le cellule sono in buone condizioni quando sono luminose e rotondo.

2. espansione delle cellule e le cellule vitali di numerazione

  1. Osservare la morfologia delle cellule al microscopio (ingrandimento X 200) e controllare la condizione della crescita delle cellule numerando le celle prima di cambiare mezzo: aggiungere 2 µ l di trypan blu (0,4%) alla sospensione di cellule di µ l 18 e calcolare la concentrazione delle cellule (Vedi 1.2, Figura 2).
  2. Scartare 500 µ l del mezzo in una piastra a 24 pozzetti e aggiungere 500 µ l fresco completo colturale. Aggiungere 150U rhIL-2 per pozzetto.
  3. Modificare il mezzo due volte a settimana come descritto al punto 2.2.
  4. Disegnare la curva di crescita delle cellule (Figura 3).
  5. Quando la concentrazione delle cellule vitali supera 5 × 106/mL, dividere le celle in nuovi pozzi ad una concentrazione di 1-2 × 106 cellule/mL in ciascun pozzetto. Questo processo richiede 2-4 settimane.

3. cellula Phenotyping tramite flusso Cytometry

  1. Quando le cellule sono espansi, raccogliere 1 × 106 cellule per determinare i fenotipi delle linee cellulari. Centrifugare le cellule a 240 x g per 5 min a temperatura ambiente (cellule NK/T precipiterà nella parte inferiore del tubo).
  2. Eliminare il supernatante, lavare la precipitazione con l'aggiunta di 7 mL di PBS. Centrifugare per 5 min 240 x g a temperatura ambiente. Ripetere una volta.
  3. Aggiungere 200 µ l di siero umano in ogni provetta, mescolare bene e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
  4. Centrifugare le cellule a 240 x g per 5 min a temperatura ambiente. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in 1 × 106/ml con PBSA fredda (PBS+0.2%BSA). Dividere le celle in 5 provette, ogni provetta contenente 2 × 105 celle.
  5. Centrifugare le cellule a 240 x g per 5 min a 4 ° C. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule con buffer di PBSA o PBSA contenente 10 µ l PE (o PE-Cy7) e 10 µ l FITC etichettato anticorpi per macchiare i recettori delle cellule T o NK sul ghiaccio come indicato dalla Figura 4. Cellule sospese con buffer di PBSA sono utilizzate come controllo negativo.
  6. Incubare le cellule con anticorpi per 20-30 min su ghiaccio al buio.
  7. Lavare le cellule due volte con PBSA freddo, risospendere le cellule con 300 µ l PBSA freddo.
  8. Analizzare il fenotipo delle cellule con un citometro a flusso.
    1. Impostare il citometro a flusso nella condizione di "Creare il foglio di lavoro". Impostare il modello sperimentale con una trama di puntino che visualizza forward scatter (FSC) contro dispersione laterale (SSC).
    2. Caricare il tubo di controllo di isotipo per ottimizzare le tensioni FSC e SSC e ottimizzare il valore di soglia FSC per eliminare i detriti senza interferire con la popolazione delle cellule di interesse. Elimina tutti i parametri tranne FSC, SSC, FITC, PE e PE-Cy7.
    3. Eseguire la compensazione utilizzando il controllo di isotipo e un singolo controllo positivo in ogni gruppo di analisi di 2 colori.
    4. Caricare i campioni e creare HLA-DR VS CD19, puntino VS CD4 CD8, CD16 VS CD56 e CD3 VS CD16 diagrammi che mostrano diversa popolazione di cellule.
      Nota: PBMC sono stati utilizzati per eseguire la compensazione utilizzando il controllo negativo/isotipo e il singolo controllo positivo. 2-colore immunofluorescenza con citometro a flusso è stato utilizzato ordinariamente per analizzare l'espressione di marcatori di superficie. Le dotazioni comprendono i seguenti anticorpi: anti-HLA-DR, anti-CD4, anti-CD16 coniugato con isotiocianato di fluorescina (FITC), anti-CD8, anti-CD56, CD3 coniugato con ficoeritrina (PE) e anti-CD19 coniugato con PE-Cy7.

4. espansione e crioconservazione delle cellule di NK/T

  1. Modificare il mezzo quando viene completata l'analisi del fenotipo delle cellule. Rimuovere la metà del surnatante delicatamente ed evitare di toccare le cellule nella parte inferiore della piastra. Aggiungere lo stesso volume di fresco mezzo di coltura contenente 300 U/mL rhIL-2 per le piastre di cella.
  2. Modificare la metà del mezzo ogni 3 giorni (come 2.2) fino a quando la cella cluster sono chiaramente visibili al microscopio (Figura 2). In genere, questo processo richiede 2-3 settimane.
  3. Trasferire le cellule da 24 pozzetti per matracci di cultura T25 dopo la miscelazione di diversi pozzetti della stessa stirpe. Doppio del volume di terreno di coltura come si diventa giallo fino a quando il volume del mezzo si espande a 10-15 mL. Aggiungere rhIL-2 con la concentrazione di 150 U/mL.
  4. Modificare media 24 h prima del congelamento dopo 2-3 settimane di crescita, quando la cella di massa può essere osservato ad occhio nudo. Misurare la concentrazione di cellule con un contatore di cellule.
  5. Centrifugare la sospensione cellulare per 5 min a 240 x g e risospendere il pellet cellulare ad una densità di 5-10 x 106 cellule/mL con la soluzione di riserva congelata contenente siero bovino fetale di 90% e 10% dimetilsulfossido (DMSO). Congelare a un tasso di 1 ° C / min a-80 ° C e poi trasferire direttamente in azoto liquido.

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Risultati

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Dopo 3 giorni cultura durante l'istituzione di linee cellulari, le cellule polimorfiche cominciano ad apparire (Figura 2). Dopo 7 giorni, le cellule crescono rapidamente, come il numero e la vitalità delle cellule sono aumentati ad un ritmo elevato (Figura 3). Piccoli grappoli di cellule sono chiaramente visibili dopo 10-14 giorni in crescita, quando la concentrazione di cellule può superare i 3-6 × 106. In questo peri...

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Discussione

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In questo protocollo, è stata sviluppata una nuova tecnica per l'istituzione di linee di cellule NK/T dal sangue intero dei pazienti CAEBV. Confrontato con i metodi esistenti, il principale vantaggio di questo metodo è la sua semplicità e la sua esigenza di solo un piccolo volume di sangue, mentre esibisce un alto tasso di successo e buone condizioni di attuabilità delle cellule. Inoltre, linee di cellule NK/T possono essere stabilite coltivando PBMC senza determinare i tipi di cellule EBV latente infettati in anticipo, ...

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Dichiarazioni

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D.Z., X.Z. e X.C. sono co-inventori su domande di brevetto che copre potenziali utilizzi di questo metodo per stabilire linee di cellule NK/T e le linee cellulari stabilite in questo studio in. D.Z., X.Z. e X.C. non dichiarare concorrenti interessi finanziari in questo lavoro. Gli autori restanti dichiarano che non hanno nessun concorrenti interessi finanziari.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato da progetti chiave dell'Accademia cinese delle scienze (KFZD-SW-205), strategico biologico risorse tecnologia sistema di supporto dell'Accademia cinese delle scienze (CZBZX-1 e ZSSB-004) e da sovvenzioni dalla National Science Foundation of China ( 81401640) e fondo di scienze naturali (14ZR1434800) di Shanghai.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Hu HLA-DR FITCBDanticorpo per FACS
Hu CD4 FITCBD555346anticorpo per FACS
Hu/NHP CD8 PEBD557086 anticorpo per FACS
Hu CD3 PEBD555340anticorpo per FACS
Hu CD16 FITC 3G8BD555406anticorpo per FACS
Hu/NHP CD56 PE MY31BDanticorpo 556647per FACS
hu/CD19 PE-Cy7BD560728anticorpo per FACS
umano IL-2Roche11147528001
siero umanoMRCCCC118-125
incubatore a CO2SANYO
CentrifugaTechcompCT6TMicroscopio per centrifugazione
OLYMPUS CKX53CKX53
Contatore di cellule automatizzatoCountstarIC 1000Per il conteggio delle cellule
cluster di colture cellulari a 24 pozzettiCorning Incorporated3524Piastre in polistirene
25cm2 Pallone per colture cellulariNest707001Polistirene
FBSGibco10270Componente del mezzo cellulare
RPMI Medium 1640life22400089Per il terreno cellulare
L-GlutamminaAmresco374Componente del terreno cellulare
100 x streptomicina penicillina soluzione BioRoYeeBRY-2309BioRoYeeBRY-2309Componente del terreno cellulare
Ficoll paque plusGE Healthcare17-1440-03Per l'isolamento in vitro del linfocita
DMSOSigmaD2650Per il congelamento delle cellule
citometro a flussoBDBD FACSAria II
soft wareBDBD FACSDiva soft wareAnalisi FACS
560944

Riferimenti

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