Method Article

Un protocollo per Decellularizing Mouse coclee per l'ingegneria dei tessuti dell'orecchio interno

DOI:

10.3791/56523

⸱

January 1st, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology, University of Kansas Medical Center, 2Stephenson School of Biomedical Engineering, University of Oklahoma, 3Department of Plastic Surgery, University of Kansas Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'obiettivo del presente protocollo è di dimostrare un metodo efficace per decellularize e decalcificare coclee del mouse per l'utilizzo come scaffold per applicazioni di ingegneria dei tessuti.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nei mammiferi, le cellule ciliate che mechanosensory che facilitano la mancanza dell'udito la capacità di rigenerare, che ha limitato i trattamenti per la perdita dell'udito. Attuali strategie di medicina rigenerativa sono concentrati sul trapianto di cellule staminali o la manipolazione genetica delle cellule di supporto nell'orecchio interno per incoraggiare la sostituzione delle cellule danneggiate di staminali per correggere la perdita della capacità uditiva circostanti. Ancora, la matrice extracellulare (ECM) può svolgere un ruolo vitale nell'induzione e mantenimento della funzione delle cellule ciliate e non è stato ben studiata. Utilizzando il cocleare ECM come impalcatura per crescere le cellule staminali adulte possono fornire intuizioni uniche come la composizione e l'architettura dell'ambiente extracellulare aiuta le cellule nel sostenere la funzione uditiva. Qui presentiamo un metodo per isolare e decellularizing coclee da topi da utilizzare come scaffold accettando irrorato le cellule staminali adulte. Nel protocollo attuale, coclee sono isolate da topi eutanasizzati, decellularized e decalcificati. In seguito, cellule di gelatina di Wharton umana (hWJCs) che sono state isolate da cordone ombelicale sono state irrorate con attenzione in ogni coclea. Le coclee sono stati usati come bioreattori, e le cellule sono state coltivate per 30 giorni prima in fase di elaborazione per l'analisi. Coclee decellularizzati mantenuto strutture extracellulari identificabili, ma non hanno rivelato la presenza di cellule o notevoli frammenti di DNA. Cellule irrorate nella coclea invasero la maggior parte dell'interno ed esterno della coclea ed è cresciuta senza incidenti nel corso di una durata di 30 giorni. Così, il metodo corrente può essere utilizzato per studiare come cocleare ECM colpisce cellule sviluppo e comportamento.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La coclea è una struttura a spirale intricato trovata nell'osso temporale. Esso è composto da un labirinto osseo esterno e un labirinto membranoso concentrici, interno1. Il labirinto membranoso è costituito da tre spazi fluidi: vestibuli di scala, Scala media e tympani di Scala1. I mezzi di scala ospita l'epitelio sensoriale, che è composto da una moltitudine di tipi di cellule, ma le cellule ciliate sensoriali (HC), che trasducono energia meccanica in onde sonore in impulsi nervosi2, sono di particolare interesse. L'esposizione al trauma acustico3,4,5, farmaco6, malattia7,8e9 di invecchiamento può provocare di alterata funzione uditiva tramite morte HC. Perdita di capelli cellulare nei mammiferi è permanente, a differenza di aviaria HCs, che può rigenerare dopo lesioni10.

Una varietà di sforzi di ricerca contemporanea hanno cercato di ripristinare perso HCs, anche se gli approcci sperimentali specifici variano. Manipolazione dell'espressione genica in epitelio sensoriale e l'impianto di cellule staminali differenziate all'esterno del corpo sono approcci dominanti nel campo, anche se i metodi di induzione che cercano di differenziare le cellule staminali in organoids cocleari sono stati ha tentato di11,12,13. Ciascuno di questi approcci sia reliant direttamente su cellule staminali, o i segnali dello sviluppo utilizzati dalle cellule staminali; Tuttavia, un secondo ha condiviso, e potenzialmente critici, elemento è l'ECM della coclea stessa14,15.

L'ECM non solo fornisce supporto fisico per cellule e tessuti, che comprende una superficie di adesione delle cellule, proliferazione, sopravvivenza e migrazione, ma svolge anche il ruolo critico nello sviluppo di HCs e la spirale del ganglio15,16 ,17. Naturalmente che si verificano ECM fornisce segnali induttivi che possono guidare la determinazione del fenotipo cellulare e/o di adesione, proliferazione e sopravvivenza cellulare18. Di conseguenza, l'uso di decellularizzazione coclea in combinazione con hWJCs coltivate offrono un'occasione unica per esplorare il ruolo della rigenerazione ECM e HC. HWJCs sono un tipo di cellula prontamente disponibili, non controverso isolato dal cordone ombelicale umani che si comportano come cellule staminali mesenchimali19. HWJCs hanno dimostrato la capacità di differenziarsi verso il basso delle cellule neurosensoriali lignaggi20,21. Così, l'attuale protocollo dettagli l'isolamento, decellularizzazione e perfusione delle coclee da carcasse del mouse C57BL con hWJCs per l'ingegneria dei tessuti dell'orecchio interno.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutte le procedure, tra cui l'eutanasia degli animali, sono state condotte secondo il protocollo approvato del istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) (Coppa #2014-2234) presso l'University of Kansas Medical Center (KUMC).

Nota: HWJCs sono state isolate da cordone ombelicale umani che sono stati donati dai pazienti che ha fornito il consenso informato e gli esemplari sono stati utilizzati secondo i protocolli approvati dal comitato di soggetti umani di Università del Kansas (KU-IRB #15402).

1. osso temporale raccolto e coclea isolamento

  1. Decapita un mouse in modo appropriato eutanasizzato, 15-settimana-vecchio di taglio tra il cranio e la prima vertebra cervicale con un paio di forbici chirurgiche, quindi spruzzare giù la testa con etanolo al 70% per disinfettare (Figura 1A).
  2. Bisecare il cranio in un piano sagittale utilizzando lo stesso paio di forbici chirurgiche (Figura 1B- C, le linee tratteggiate).
  3. Rimuovere il tessuto di cervello dal cranio usando un paio di pinze (Figura 1, punta di freccia).
  4. Identificare l'osso temporale attraverso la presenza di uditivo e le radici del nervo vestibolare (Figura 1E-F, punte di freccia) all'interno del cranio e il condotto uditivo dall'esterno (Figura 1F, freccia). Accuratamente tagliato attraverso il cranio per isolare l'osso temporale dal resto del cranio (Figura 1).
    Nota: In alcuni casi, è possibile fare leva delicatamente le ossa circostanti del cranio dall'osso temporale senza la necessità di taglio.
  5. Inserire il forcipe fine nell'apertura del condotto uditivo circa 5 mm (Figura 1 H), in modo che le punte non si rischiano di perforare della coclea. Delicatamente, rompere l'osso della bulla (Figura 1 H, top rosso zona ombreggiata) così fratture (lineaFigura 1I, rosso punteggiato).
    Nota: Se necessario, un microscopio di dissezione può essere di aiuto in questo processo per assicurare un posizionamento preciso e manipolazione degli strumenti.
  6. Utilizzando una pinzetta, leva via il resto della bulla dall'osso temporale, esponendo il labirinto ossuto della coclea (Figura 1J, staffe rossi).
  7. Inserire una capsula di Petri sufficientemente grande da contenere l'osso temporale (ad esempio, 30 mm o maggiore) sotto la dissezione di campo di ambito e riempirlo con abbastanza Phosphate Buffered Saline (PBS) per coprire l'osso temporale (ad esempio, 0,5-1 mL).
  8. Immergere l'osso temporale con la bulla rimossa in PBS con le finestre ovale e rotonde della coclea rivolto verso l'alto.
    Nota: La rimozione del sistema vestibolare dalla coclea non è necessario, come il sistema vestibolare serve anche come un handle per il maneggiamento e orientando le caratteristiche della coclea (Figura 1I e Figura 2B).
  9. Utilizzando un ultra-sottile paio di pinze, rimuovere l'arteria stapediali, che passa attraverso lo stapes.
  10. Inserire una punta delle pinze ultra fine attraverso l'arco dello stapes dove l'arteria è attraversato e sollevare delicatamente lo stapes. Stapes disarticolate dovrebbe sollevare fuori la finestra ovale.
  11. Utilizzando una punta delle pinze ultra-sottile, l'ovale di puntura e finestre rotonde.
  12. Utilizzando un PBS 1X preriempita 28,5-manometro con tubo (diametro interno 0,28 mm, diametro esterno 0,61 mm) fissato, posizionare il tubo sopra la finestra ovale (Figura 2A -B).
    Nota: L'apertura del tubo può essere manipolato con forcipe ultra-fine, contribuendo a garantire un posizionamento preciso.
    1. Utilizzare una siringa fresco e tubi per ogni coclea.
  13. Irrorare di 2 mL di 10% antibiotico antimicotico (anti-anti) e 10% penicillina-streptomicina (penna-strep) in PBS tramite coclea oltre 5 min per rimuovere perilymph. Che irrora troppo veloce con troppa pressione danneggia le strutture fini all'interno della coclea.
    Nota: Guida manualmente la siringa a mano per irrorare il fluido attraverso la coclea è efficace, anche se una pompa di perfusione potrebbe essere utilizzata come alternativa.
    1. Se manualmente che irrora, usare un paio di belle, dichiusura forcipe per stabilizzare la coclea (Figura 2A) durante l'aspersione afferrando la parte vestibolare dell'osso temporale.
      Nota: Anche se non richiesto, questo lascia entrambe le mani libere maneggiare gli strumenti; una mano può guidare la siringa (Figura 2A) mentre l'altro può posizionare il tubo in modo appropriato (Figura 2B).
    2. Da questo punto in avanti, prendersi cura per evitare di esporre la coclea inutilmente all'aria. L'introduzione di bolle d'aria negli spazi fluidi bloccherà la circolazione dei fluidi, e ulteriore essiccazione danneggia le strutture fini all'interno della coclea.
  14. Rimuovere ed eliminare eventuali rimanenti frammenti di ossa e dei tessuti dei muscolo utilizzando una pinzetta.
  15. Se necessario, è possibile memorizzare isolati coclee a 4 ° C in anti-anti 10% e 10% soluzione di penna-strep in PBS per fino a sette giorni con cambi regolari di soluzione antibiotica ogni 48 h.

2. coclea elaborazione

  1. Decellularizzazione
    1. Per ogni coclea, riempire una fiala di scintillazione di vetro da 20 mL con un 1% sodio dodecil solfato soluzione (SDS) in acqua deionizzata (DI), che viene utilizzato per decellularize la coclea.
    2. Tagliare la punta fuori di una pipetta di plastica 7-mL trasferimento utilizzando una lama di rasoio in modo che l'apertura è abbastanza grande per una coclea di passare attraverso.
    3. Usando la pipetta, delicatamente redigere la coclea nella pipetta modo passa solo il bordo di taglio di pochi millimetri.
    4. Espellere la coclea nella fiala di scintillazione riempito di soluzione di 1% SDS.
    5. Circolare 2 mL di SDS 1% in acqua deionizzata (DI) attraverso la coclea nella fiala di scintillazione utilizzando una pipetta di trasferimento.
    6. Collocare il flaconcino di scintillazione in un rotatore e lasciare riposare il flaconcino scintillazione ruotare a 10 giri per 72 h a temperatura ambiente.
      1. Cambiare 1% SDS soluzione ogni 24 ore, per un periodo di 72 h. Fare attenzione quando si cambia SDS per non esporre mai la coclea all'aria.
    7. Lavare la coclea tre volte per 30 minuti ciascuno, con dell'acqua distillata.
Eseguire i lavaggi del flaconcino di scintillazione stesso utilizzato per le spese di SDS; in questa fase, la coclea è decellularized.
  • Decalcificazione
    1. Rimuovere l'acqua residua DI dal flaconcino di scintillazione, lasciando appena sufficiente per mantenere la coclea sommersa.
    2. Per iniziare la decalcificazione, aggiungere 5 mL di 10% acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (0,02 M) in acqua distillata nel flaconcino di scintillazione contenente la coclea.
    3. Circolare 2 mL di EDTA 10% DI acqua attraverso la coclea nella fiala di scintillazione utilizzando una pipetta di trasferimento.
    4. Collocare il flaconcino di scintillazione indietro nel rotatore e lasciare riposare il flaconcino scintillazione ruotare a 10 giri per 72 h a temperatura ambiente. Cambiare la soluzione di EDTA 10% ogni 24 ore, per un periodo di 72 ore. Fare attenzione quando si cambia soluzioni in modo che la coclea non è esposto all'aria.
    5. Sciacquare la coclea 3 volte per 2 h ciascuna con PBS 1X; in questa fase, la coclea è decalcificata.
  • Deposito
    1. Memorizzare le coclee per fino a 72 h in un'anti-anti, 10% penna-strep soluzione al 10% in PBS a 4 ° C.
      Nota: Più lunghi periodi di stoccaggio possono essere possibili con cambi regolari di soluzione antibiotica; Tuttavia, stoccaggio prolungato di coclee trasformati non è stato convalidato in questo protocollo.

    • 3. appalti pubblici e l'espansione di hWJCs

    1. Isolare il hWJCs secondo protocolli precedentemente pubblicati22. Brevemente, segmento cordoni ombelicali in sezioni di 3 cm.
    2. Attentamente fare un'incisione superficiale con un bisturi longitudinalmente su ciascun segmento di cavo ombelicale per srotolare ed esporre gelatina di Wharton del cordone ombelicale. Utilizzare pinze per rimuovere i vasi sanguigni.
    3. Lavare cordone ombelicale segmenti due volte con abbastanza PBS (ad es., 40 mL in una capsula di Petri di 60 mm) per immergere il tessuto. Tritare finemente i segmenti di tessuto con un bisturi. Digerire il tessuto in un 100mm Petri con 50 mL di mezzo di digestione (collagenasi tipo 2 0,2%, 1% penicillina-streptomicina, in basso-glucosio Medium (DMEM dell'Aquila per volta di Dulbecco)).
    4. Posto del tessuto nella digestione medio su agitatore orbitale a 50 rpm durante la notte in un 5% CO2, incubatore 37 ° C. Il giorno seguente, diluire mezzo di digestione con un rapporto di 01:16 in 2% antibiotico antimicotico in PBS e pellet di cellule mediante centrifugazione a 500 x g a temperatura ambiente (~ 27 ° C) per 10 min. Discard surnatante.
    5. Risospendere il pellet in Mesenchymal Stem Cell crescita medio (MSCGM) e ricombinare le cellule. Piastra le cellule ad una densità di 7 x 103 cellule/cm2 nella coltura del tessuto trattate boccette di T-75. HWJCs in MSCGM della cultura ed espandere al passaggio 5 per esperimenti.
      Nota: HWJCs può essere sub-coltivate in T-palloni più grandi (ad es., T-150, T-300) quando passaggio per aumentare la resa di hWJCs per gli esperimenti.

    4. infusione di hWJCs in Decellularized coclee

    1. Preparare decellularizzati coclee
      1. Utilizzando una tecnica asettica, lavare coclee stored in PBS 1X tre volte per 30 minuti ciascuno.
      2. Coclee di trasferimento in pozzetti separati di una piastra a 24 pozzetti e aggiungere 1 mL di 37 ° C pre-riscaldati MSCGM.
      3. Incubare le coclee in un 5% CO2, incubatrice di coltura cellulare di 37 ° C per un minimo di 1 h prima dell'infusione delle cellule.
    2. Dissociare hWJCs e risospendere
      1. HWJCs di lavaggio con 37 ° C pre-riscaldati 1X PBS due volte.
      2. Aggiungere sufficiente 37 ° C pre-riscaldati tripsina con EDTA 0,5% per coprire la superficie del vaso di cella.
      3. Incubare hWJCs per fino a 5 min in un 5% CO2, incubatrice di coltura cellulare di 37 ° C.
        1. Verificare che il 90% delle cellule staccato dalla superficie di coltura delle cellule visualizzando le cellule al microscopio invertito.
          Nota: Le cellule che si muovono quando la nave di cultura delicatamente è sfruttata, staccato. Le cellule che rimangono fisse, non siano staccate.
        2. Picchiettare delicatamente i lati del pallone per sloggiare ulteriormente cellule allegate.
      4. Utilizzando una tecnica asettica, hWJCs trasferimento dal recipiente di coltura in una provetta conica da 50 mL contenente un volume equivalente di MSCGM al volume di tripsina utilizzato per dissociare le cellule.
      5. A pellet il hWJCs mediante centrifugazione a 500 x g a temperatura ambiente (~ 27 ° C) per 5 min.
      6. Aspirare il supernatante e risospendere hWJCs in MSCGM ad una concentrazione di 500.000 cellule/mL.
    3. Irrorare le coclee
      1. Coclee di trasferimento ad una nuova piastra 24 pozzetti usando una pipetta di trasferimento.
      2. Aggiungere una goccia di MSCGM per ogni coclea per impedire qualsiasi coclea asciugarsi.
      3. Delicatamente e orientare la coclea utilizzando forcipe ultra-fine, in modo che le finestre ovali e rotonde sono rivolto verso l'alto.
        Nota: La estrema attenzione direttamente ogni coclea come la coclea è danneggiata facilmente.
      4. Usando una siringa sterile 28,5-calibro insulina con tubi collegati, redigere 0,2 mL risospese hWJCs (100.000 cellule).
      5. Con una pinzetta sterilizzata, posizionate tubi finestra ovale.
      6. Delicatamente e lentamente irrorare la coclea con 0,2 mL di sedimento hWJCs utilizzando una siringa da insulina 28,5-manometro collegata al tubo in polietilene (diametro esterno: 0,61 mm, diametro interno: 0,28 mm) sopra circa 5 min.
      7. Dopo aspersione, aggiungere 0,8 mL di 37 ° C pre-riscaldati MSCGM al bene contenente la coclea per portare il volume totale nel pozzo a 1 mL.
      8. Ripetere i passaggi 4.3.3-4.3.7 per ogni coclea, usando una siringa fresca e tubi ogni volta.
      9. Posto irrorati coclee in un cambiamento supporti tre volte alla settimana, incubatrice di coltura cellulare di 37 ° C e 5% CO2.

    5. conservazione e raccolto coclea

    Nota: Coclee possono essere coltivate e raccolgono in qualsiasi momento post-l'aspersione fino a 30 giorni.

    1. Per conservare le coclee, difficoltà in paraformaldeide al 4% in PBS 1X durante la notte a 4 ° C su una piattaforma a dondolo.
    2. Dopo la fissazione, lavare coclee con PBS 1X tre volte per 5 minuti ciascuno.
    3. Gradualmente disidratare coclea con etanolo e chiaro con un solvente idrocarburo alifatico prima di incorporare in paraffina.
    4. Sezione campioni ad uno spessore di 10 µm utilizzando un microtomo e montare su vetrini.
      Nota: I campioni sono pronti per l'istologico o immunohistochemical elaborazione utilizzando protocolli standard.

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Results

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Utilizzando i metodi presentati qui, successo decellularizzazione di coclee è stata valutata esaminando la presenza o l'assenza di DNA attraverso 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) colorazione. Coclee sono stati considerati pienamente decellularizzati se il DNA non è stato identificato all'interno della coclea decellularizzata. Una coclea nativa da un esperimento precedente che non subissero decellularizzati o decalcificazione è stata utilizzata come controllo positivo per illustrare l...

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Abbiamo dimostrato con successo che le cellule cocleari native possono essere rimosso dalla coclea tramite un processo di decellularizzazione, che consente l'utilizzo della coclea come un'impalcatura di tessuto intricato, tridimensionale. Santi et al. 15 ha sviluppato il metodo iniziale per coclee decellularizing e hanno valutato esattamente i volumi di molte strutture cocleari attraverso con l'aiuto del foglio leggero microscopia23. Questi primi lavori servito com...

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Disclosures

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Gli autori non hanno nulla a rivelare.

    Acknowledgements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    L'attuale progetto è stato finanziato dalla prova dell'Università del Kansas di fondo di concetto. Vorremmo ringraziare il personale infermieristico a KUMC (Kansas City, KS) per aiutarci a ottenere cordoni ombelicali umani e David Jorgensen per assistere con culture di coclee.

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    Allegra X-14R CentrifugaBeckman-CoulterB08861
    Tubi semirigidi intramediciBecton Dickinson427401
    New Brunswick Innova 2000 Shaler orbitaleEppendorfM1190-0002
    Forbici chirurgicheStrumenti per la scienza fine14060-10
    Pinze finiStrumenti per la scienza11370-40
    Pinze ultrafiniStrumenti per la scienza fine18155-13
    Provette coniche da 50 mlFisher Scientific12565271
    Piastra di PetriFisher Scientificinsulina FB087579B
    U-100Fisher Scientific14-829-1B
    Fiala a scintillazioneFisher Scientific03-341-73
    RotatoreFisher Scientific88-861-049
    Pipetta di trasferimentoFisher Scientific22-170-404
    Lama di rasoioFisher Scientific12-640
    Antibiotico-AntimicoticoFisher Scientific15-240-062
    Penicillina-StreptomicinaFisher Scientific15-140-122
    Piastraa 24 pozzettiFisher Scientific07-200-84
    Vetrini per microscopio in vetro SuperFrost PLUSFisher Scientific12-550-15
    Pipetta di trasferimentoFisher Scientific22-170-404
    ProLong Gold Antifade Mountant con DAPIFisher ScientificP36935
    Clear-Rite 3Fisher Scientific22-046341
    Thermo Scientific Forma Serie II 3110 CO2 IncubatoreFisher Scientific13-998-078
    Terreno di crescita delle cellule staminali mesenchimali LonzaPT-3001
    Tripsina-EDTALonzaCC-3232
    TPP T-75 Pallone di colturaMidSciTP90076
    TPP T-150 Fiaschetta di colturaMidSciTP90151
    Pallone di coltura TPP T-300Microscopio per
    Nikon InstrumentsSMZ800
    Microscopio invertito Nikon Eclipse Ts2R-FL NikonInstrumentsMFA51010
    NuAire Classe II, tipo A2 Cabina di biosicurezzaNuAireNU-425-600
    1X PBSSigma-AldrichP5368-10PAK
    Soluzione SDS 1%Sigma-Aldrich436143-100G
    10% EDTASigma-AldrichE9884-100G
    Siringa da dissezione TP90301 MidSci

    References

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60 (5-6), 397-422 (2003).
    2. LeMasurier, M., Gillespie, P. G. Hair-Cell Mechanotransduction and Cochlear Amplification. Neuron. 48 (3), 403-415 (2005).
    3. Neal, C., et al. Hair cell counts in a rat model of sound damage: Effects of tissue preparation & identification of regions of hair cell loss. Hear Res. 328, 120-132 (2015).
    4. Ivory, R., Kane, R., Diaz, R. C. Noise-induced hearing loss: a recreational noise perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 394-398 (2014).
    5. Stucken, E. Z., Hong, R. S. Noise-induced hearing loss: an occupational medicine perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 388-393 (2014).
    6. Dille, M. F., et al. Tinnitus onset rates from chemotherapeutic agents and ototoxic antibiotics: results of a large prospective study. J Am Acad Audiol. 21 (6), 409-417 (2010).
    7. Sajjadi, H., Paparella, M. M. Meniere's disease. Lancet. 372 (9636), 406-414 (2008).
    8. House, J. W., Brackmann, D. E. Tinnitus: surgical treatment. Ciba Found Symp. 85, 204-216 (1981).
    9. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
    10. Ryals, B. M., et al. Avian species differences in susceptibility to noise exposure. Hear Res. 131 (1-2), 71-88 (1999).
    11. Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. 500 (7461), 217-221 (2013).
    12. Sekiya, T., et al. Cell transplantation to the auditory nerve and cochlear duct. Exp Neurol. 198 (1), 12-24 (2006).
    13. Shi, F., Edge, A. S. Prospects for replacement of auditory neurons by stem cells. Hear Res. 297, 106-112 (2013).
    14. Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H. Exploiting decellularized cochleae as scaffolds for inner ear tissue engineering. Stem Cell Res Ther. 8, (2017).
    15. Santi, P. A., Johnson, S. B. Decellularized ear tissues as scaffolds for stem cell differentiation. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (1), 3-15 (2013).
    16. Davies, D., Holley, M. C. Differential expression of alpha 3 and alpha 6 integrins in the developing mouse inner ear. J Comp Neurol. 445 (2), 122-132 (2002).
    17. Gerchman, E., Hilfer, S. R., Brown, J. W. Involvement of extracellular matrix in the formation of the inner ear. Dev Dyn. 202 (4), 421-432 (1995).
    18. Goodyear, R. J., Richardson, G. P. Extracellular matrices associated with the apical surfaces of sensory epithelia in the inner ear: molecular and structural diversity. J Neurobiol. 53 (2), 212-227 (2002).
    19. Mellott, A. J., et al. Improving Viability and Transfection Efficiency with Human Umbilical Cord Wharton's Jelly Cells Through Use of a ROCK Inhibitor. Cell Reprogram. , (2014).
    20. Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Moore, D. S., Detamore, M. S. Fluorescent Photo-conversion: A second chance to label unique cells. Cell Mol Bioeng. 8 (1), 187-196 (2015).
    21. Mitchell, K. E., et al. Matrix cells from Wharton's jelly form neurons and glia. Stem Cells. 21 (1), 50-60 (2003).
    22. Mellott, A. J., et al. Nonviral Reprogramming of Human Wharton's Jelly Cells Reveals Differences Between ATOH1 Homologues. Tissue Eng Part A. 21 (11-12), 1795-1809 (2015).
    23. Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea. J Histochem Cytochem. 61 (5), 382-395 (2013).
    24. Nonoyama, H., et al. Investigation of the ototoxicity of gadoteridol (ProHance) and gadodiamide (Omniscan) in mice. Acta Otolaryngol. 136 (11), 1091-1096 (2016).
    25. Dai, C., et al. Rhesus Cochlear and Vestibular Functions Are Preserved After Inner Ear Injection of Saline Volume Sufficient for Gene Therapy Delivery. J Assoc Res Otolaryngol. , (2017).
    26. Sutherland, A. J., Converse, G. L., Hopkins, R. A., Detamore, M. S. The bioactivity of cartilage extracellular matrix in articular cartilage regeneration. Adv Healthc Mater. 4 (1), 29-39 (2015).

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Tags

    Mouse Cochlea DecellularizationInner Ear Tissue EngineeringCochlear ECM ScaffoldDecalcification ProtocolHuman Wharton s Jelly CellsTemporal Bone IsolationExtracellular Matrix AnalysisCell Perfusion TechniqueOrgan of Corti PreservationTissue Engineering Scaffold

    Related Articles