Articolo metodologico

DNA che macchia il metodo basato su Formazan precipitazione indotta dall'esposizione alla luce blu

DOI:

10.3791/56528

⸱

28 gennaio 2018

 ,  , 
1Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Chile

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo metodo permette la colorazione selettiva e quantificazione del DNA in gel immergendo il gel in un SYBR Green mi / Nitro blu di tetrazolio soluzione e poi esporla alla luce solare o una fonte di luce blu. Questo produce un precipitato visibile e quasi non richiede un equipaggiamento, che lo rende ideale per uso sul campo.

Abstract

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Metodi di colorazione del DNA sono molto importanti per la ricerca biomedica. Abbiamo progettato un metodo semplice che permette la visualizzazione di DNA ad occhio nudo dalla formazione di un precipitato colorato. Funziona immergendo l'acrilamide o gel dell'agarosi del DNA in una soluzione di 1 x (equivalente a 2,0 µM) SYBR Green ho (SG ho) e 0,20 mM blu nitro tetrazolium che produce un viola precipitare di formazan quando esposto alla luce solare o in particolare la luce blu. Inoltre, DNA test di recupero sono state effettuate utilizzando un plasmide ampicillina resistente in un gel di agarosio colorati con il nostro metodo. Un maggior numero di colonie è stato ottenuto con il nostro metodo che con tradizionale che macchia usando SG I con illuminazione ultravioletta. Il metodo descritto è veloce, specifici e non tossico per la rilevazione del DNA, permettendo la visualizzazione di biomolecole ad "occhio nudo" senza un transilluminatore ed è poco costoso e adatto per uso sul campo. Per questi motivi, il nostro nuovo DNA che macchia il metodo ha potenziali benefici all'industria e ricerca.

Introduzione

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Con gli avanzamenti nella biochimica e biologia molecolare, gli studi che coinvolgono il DNA hanno richiesto le tecniche migliori per analizzare il DNA. Il primo metodo per la colorazione del DNA era macchiatura d'argento, che è molto sensibile ma manca selettività e non consente il recupero del campione. In seguito, lo sviluppo di macchiatura del DNA fluorescente permesso la quantificazione selettiva del DNA con la possibilità di recupero del campione. Uno dei primi coloranti fluorescenti utilizzati per la quantificazione del DNA era etidio bromuro1, che è mutageno2. Tuttavia, ora ci sono migliorate le tinture fluorescenti che sono più sicuri e più sensibili, come GelRed e SYBR Green ho (SG ho)3; ma tutti questi coloranti fluorescenti richiedono l'uso di un transilluminatore (UV) ultravioletto o fluorimetro.

Ci sono altre tecniche per visibilmente la colorazione del DNA, come il blu di metilene4 e viola di cristallo5,6,7,8,9, ma tutti questi soffre di ridotta sensibilità e selettività. I sali di tetrazolio sono composti organici suscettibile di riduzione e quando questo accade formano un insolubile e colorata formazan precipitare10,11. Recentemente, alcuni sali di tetrazolio bivalente hanno dimostrati di legarsi al DNA a causa della loro positiva tetrazolium anelli12.

In una recente pubblicazione13, è stata proposta una nuova tecnica visibile di macchia e quantificare il DNA in gel di poliacrilammide, mediante la riduzione di un sale di tetrazolio bivalente chiamato nitro blu di tetrazolio (NBT) e tinture fluorescenti come il bromuro di etidio, GelRed, SYBR Green io e SYBR Gold. Questa reazione ha lavorato in presenza di luce blu o luce del sole e ha permesso il recupero di campione con una migliore qualità rispetto all'uso di SG I con un transilluminatore UV. L'obiettivo di questa carta è di fornire un protocollo dettagliato della tecnica colorazione utilizzando tetrazolium sali.

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Protocollo

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1. preparazione ed esecuzione del Gel

  1. Preparare il non-denaturante 12% gel di poliacrilammide gel utilizzando la ricetta di elettroforesi del Gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) Trovati a Sambrook e Russell14 ma utilizzando acqua invece di SDS.
    1. Per preparare 5 mL di gel di risoluzione, utilizzare 1,7 mL di acqua distillata, 2 mL di acrilammide/bis acrilammide (30/0,8% w/v), 1,3 mL di 1,5 M Tris-HCl pH 8,8, 0,05 mL di 10% ammonio persolfato e 0,002 mL di TEMED.
    2. Per preparare 2 mL di gel d'impilamento utilizzare 1,5 mL di acqua, 0,33 mL di acrilammide/bis acrilammide (30/0,8% w/v), 0,25 mL 1 M Tris pH 6.8, 0,02 mL 10% di persolfato di ammonio e 0,002 mL di TEMED. Le dimensioni del gel sono cm 7,3 x 8,2 x 0,075 cm (l x w x d).
      Nota: Utilizzare un pettine di ben 15 di 0,75 mm di spessore per la migliore sensibilità.
  2. Aggiungere la quantità appropriata di 6x loading buffer e campione di DNA in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL (ad es. uso 1 µ l di tampone di caricamento x 6 a 5 µ l di campione di DNA).
  3. Posto il gel nella camera di elettroforesi verticale.
    1. Riempire la camera con 750 mL di 1 x TAE buffer per eseguire 2 gel. Per preparare 1 L di 50 x TAE, utilizzare 442 g di Tris base, 57,1 mL di acido acetico glaciale e 100 mL di 0,5 M EDTA, pH 8. Aggiungere acqua distillata fino ad un volume finale di 1 L.
    2. Caricare i campioni nel gel. Esegua il gel a 100 V per 2 h.
  4. In alternativa, preparare un gel di agarosio x TAE 1 utilizzando la ricetta che trovata Sambrook14.
    1. Aggiungere 300 mL di 1 x TAE alla camera di elettroforesi orizzontale. Esegua il gel per 45 min a 100 V.

2. NBT-SG ho colorazione (Figura 1).

  1. Gel di acrilamide che macchia.
    1. Preparare le soluzioni: 0,1% p/v NBT e 1.2 x SG mi.
      Nota: È possibile utilizzare il bromuro di etidio, GelRed e oro SYBR anziché SG ho, ma ho avuto la migliore performance di SG.
    2. Versare 16,75 mL di 1.2 x SYBR ho verde soluzione in un recipiente di dimensioni adeguate.
      Nota: Abbiamo usato il coperchio di una scatola di punta della pipetta come un contenitore, e questi volumi sono calcolati per coprire il gel utilizzando questo contenitore; le sue dimensioni sono cm 11,6 x 7,6 x 2,6 cm (l x w x d).
    3. Posto il gel nella soluzione. Aggiungere 3,25 mL di soluzione NBT 0,1% p/v di dare 0,2 mM NBT e 1x (equivalente a 2,0 µM) SG ho concentrazioni finali.
    4. Sigillare il contenitore con pellicola di plastica e avvolgere completamente il contenitore con carta stagnola per bloccare qualsiasi luce ambiente.
      Nota: La pellicola di plastica è utilizzata per evitare schizzi e per evitare la reazione dell'estruso in alluminio con la soluzione colorante.
    5. Agitare per 25 minuti su agitatore orbitale a 60 giri/min.
    6. Rimuovere il coperchio di plastica e alluminio. Esporre alla luce solare per 90 min massimo. Controllare ogni 5 minuti finché non viene visualizzata la banda di interesse.
    7. Per utilizzare la luce blu, preparare un protoboard con 3 diodi emettitori di luce (LED) e posizionare i LED circa 5 mm dalla superficie del gel (controllare la macchiatura continuamente, come il tempo necessario dipenderà l'intensità della sorgente luminosa LED).
  2. Macchiatura del Gel dell'agarosi.
    1. Dopo preparazione e l'esecuzione di un 1% di agarosio gel come descritto nelle sezioni 1.4 (le dimensioni sono 1 x 6,2 cm x 7 cm; l x l x p), seguire la stessa procedura come in 2.1 con queste modifiche:
    2. Versare 41,9 mL di 1.2 x SG ho soluzione nel coperchio di una casella di punta della pipetta; le sue dimensioni sono cm 11,6 x 7,6 x 2,6 cm (l x w x d). Aggiungere 8,1 mL di soluzione 0,1% NBT.
    3. Sigillare il contenitore con pellicola di plastica e poi avvolgere completamente il contenitore con carta stagnola per bloccare qualsiasi luce ambiente.
    4. Agitare per 1 h su agitatore orbitale a 60 giri/min.

3. analisi dei dati.

  1. NBT-SG Ho curve di calibrazione.
    1. Ottenere immagini con gel di scansione a 1200 dpi.
    2. Aprire il software per analisi di immagine. Raddrizzare le immagini utilizzando un editor di immagini. Eseguire una densitometria di immagine.
    3. Calcolare l'area sotto la curva. Preparare un grafico del segnale/segnaleMax contro concentrazione di DNA.

4. DNA recupero.

  1. Preparare un gel di agarosio 1% in 1 x TAE usando la ricetta trovato in Sambrook14.
  2. Aggiungere 300 mL di 1 x TAE alla camera di elettroforesi orizzontale. Caricare 4 µ l di 100 ng / µ l pDJ10015 plasmide e DNA ladder seguendo lo schema dato in Figura 2. Esegua il gel per 1 h a 100 V.
  3. Contrassegnare e pesano due provette microcentrifuga di 2 mL.
  4. Tagliare il gel nel mezzo al fine di avere due metà identiche. Ognuno dovrebbe contenere la scala e il plasmide di esempio per confrontare le diverse tecniche di colorazione. Una rappresentazione schematica è nella Figura 2.
  5. Macchia una metà con NBT-SG ho come al punto 2.
    1. Tagliare la banda di plasmide usando un bisturi pulito. Salvare il pezzo di gel in una provetta e pesare.
  6. Macchia l'altra parte del gel con SG I con 50 mL di 1 x SG ho soluzione e agitare lentamente (60 giri) il gel per 1 h nel buio.
    1. Posizionare il gel su un transilluminatore ed esporre per 2 min taglio fuori della band di plasmide usando un bisturi pulito.
    2. Salvare il pezzo di gel nell'altro tubo e pesare.
      Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui mantenendo le provette a-20 ° C.
  7. Effettuare il plasmide estrazione utilizzando un kit di estrazione del gel commerciale.

5. plasmide normalizzazione.

  1. In una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL, aggiungere 10 µ l di Estratto del plasmide e 60 µ l di tipo I acqua. Mix e trasferire a una cuvette di quarzo 60 µ l o utilizzare 2 µ l direttamente in un Nanodrop.
  2. Misurare gli spettri di assorbimento tra 230 a 320 nm. Calcolare la concentrazione di plasmide del campione utilizzando la seguente formula:
    figure-protocol-1
    dove D è il fattore di diluizione applicato (in questo caso è 70/10), Ax è assorbimento a x nm e 50 è il fattore di conversione a µ g/mL per dsDNA.
  3. Diluire i campioni a 9.1 ng / µ l.
  4. Trasformare cellule competenti di Escherichia coli (Escherichia coli) (per esempio oro XL10) seguendo la procedura trasformazione di Inoue16 utilizzando 5 µ l di campione diluito.
  5. Contare il numero di colonie sui piatti Petri e notare la diluizione. Calcolare l'unità di formatura Colonia (CFU) con la seguente formula17:
    figure-protocol-2
    dove D è il fattore di diluizione applicato dalla coltura iniziale.
  6. Eseguire un test t spaiato.

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Risultati

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Un precipitato di formazan viola appare in cui si trova il DNA (verificato da spettrometria di massa13). Nell'esperimento, una scaletta del DNA è stata caricata per fare una curva di calibrazione (Figura 3). Il protocollo funziona per gel di acrilammide sia dell'agarosi, ma ha un'intensità più bassa e richiede più tempo in agarosio. Tuttavia, l'uso del gel dell'agarosi permette il recupero del campione utilizzando un kit disponibile in...

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Discussione

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Un sensibile e romanzo DNA che macchia il metodo basato su riduzione di NBT e l'uso di SG mi è stato presentato in questo articolo. Il passaggio fondamentale in questo protocollo è il tempo di incubazione del gel in NBT-SG ho soluzione e la concentrazione di NBT. Il tempo di colorazione per i gel dell'agarosi è più per i gel di acrilammide a causa del maggiore spessore del gel dell'agarosi. Questo metodo non funziona bene in presenza di SDS come NBT precipita a contatto con esso. Se il gel ottiene uno sfondo viola, sugge...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato da Fondo Nacional de Desarrollo y Científico Tecnológico (Fondecyt), Cile, progetto 11130263 (in senso orario), progetto CONICYT + NERC + Programa de Colaboración Internacional PCI-PII20150073 (in senso orario) e U-inicia dal de Vicerrectoría Investigación Universidad de Chile (in senso orario).

Grazie a Tatiana Naranjo-Palma per l'aiuto nella fase iniziale di questo progetto, Dr. Jorge Babul e Diego Quiroga-Roger per utile discussione, Robert Lesch per rivedere il manoscritto e la Dirección de extensión de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas da Universidad de Chile. Grazie anche alla Marcelo Pérez per il video editing e Neil Stevens per la correzione del testo ed Errol Watson per fornire la voce fuori campo.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagente Nitro blue tetrazoliumGold Biotechnology298-83-9utilizzato nella colorazione
Reagente SYBR Green I 10000XThermo-FisherS7563utilizzato nella colorazione
Kit di estrazione del gelQIAGEN28704utilizzato per estrarre il plasmide dal gel nel test di integrità
Scala del DNAThermo-FisherSM 1331utilizzato per realizzare curve di calibrazione e come riferimento per tagliare la banda nel saggio di integrità
Agar AgarMerckutilizzato per realizzare piastre di coltura LB-ampicillina 
cloruro di sodioMerck1064045000utilizzato per realizzare piastre di coltura LB-ampicillina 
estratto di lievitoBecton, Dickinson and Company212750utilizzato per realizzare piastre di coltura LB-ampicillina 
peptoneMerck72161000utilizzato per realizzare piastre di coltura LB-ampicillina 
TEMEDAMRESCO761utilizzato per produrre gel di poliacrilammide
persolfato di ammonioCalbiochem2310utilizzato per produrre gel di poliacrilammide
acrilammideinvitrogen15512-023utilizzato per produrre gel di poliacrilammide
bisacrilammideSIGMA146072utilizzato per produrre gel di poliacrilammide
Tris-baseMerck1083821000utilizzato per produrre tampone TAE e tampone tris-HCl in gel di poliacrilammide non denaturante
EDTAJ.T. Baker8993-01utilizzato per produrre tampone TAE
Acido aceticoMerck1.000.632.500utilizzato per produrre tampone TAE
agarosioMerck16802utilizzato per produrre spettrofotometro tampone TAE
Tecaninfinite 200 proutilizzato per quantificare il plasmide
del DNAunità di purificazione dell'acquaMerckElix 100utilizzata per produrre acqua di tipo 1 (ASTM) utilizzata in spettrofotometria e diluizioni del DNA\
acquadistillata-utilizzatain gel, terreno di coltura, colorazioni e soluzioni generali
HClJ.T. Baker9535-03utilizzata per produrre tampone tris-HCl in gel di poliacrilammide non denaturante
6X colorante per il caricamento del DNAThermo-FisherR0610
SP-021dell'elettronicadel LED blu da 5 mmutilizzata nel
supportodel prototipo del saggio di integrità KANDHKH102 
Batteria da 9 VDuracell-utilizzatoper alimentare la
camera di elettroforesi orizzontaleBiorad1704486EDUutilizzato per produrre ed eseguire il gel di agarosio nel
kit di elettroforesi verticaleBiorad1658002EDUutilizzato per eseguire gel di poliacrilammide nelle curve di calibrazione
alimentazioneBiorad1645050 Utilizzato per alimentare l'elettroforesi
Sorgente luminosa SP-021 e nel circuito della sorgente luminosa del LED del test di integrità

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. LePecq, J. B., Paoletti, C. A fluorescent complex between ethidium bromide and nucleic acids: physical-chemical characterization. J. Mol. Biol. 27 (1), 87-106 (1967).
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  4. Flores, N., Valle, F., Bolivar, F., Merino, E. Recovery of DNA from agarose gels stained with methylene blue. Biotechniques. 13 (2), 203-205 (1992).
  5. Yang, Y. I., Jung, D. W., Bai, D. G., Yoo, G. S., Choi, J. K. Counterion-dye staining method for DNA in agarose gels using crystal violet and methyl orange. Electrophoresis. 22 (5), 855-859 (2001).
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