Un metodo semplice per preparare BSA-degli acidi grassi coniugati e illustriamo un metodo semplice per derivare macrofagi murini primari da cellule del midollo osseo. Allora dimostriamo che gli acidi grassi saturi può indurre la morte delle cellule del macrofago, e tale morte delle cellule è associato positivamente con accumulo cellulare di ceramide livelli.
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Articolo metodologico
Acidi grassi saturi indurre la morte delle cellule del macrofago Ceramide-collegato
In questo articolo
Sommario
Abstract
I macrofagi esprimono altamente epidermica dell'acido grasso-proteina e proteina-acido grasso adiposa. Essi attivamente l'assorbimento saturata e acidi grassi insaturi, che potrebbe giocare un ruolo critico nella regolazione della loro funzioni immuni. Numerosi studi hanno dimostrato che vari acidi grassi, saturi o insaturi, può possedere diversi impatti sulla crescita delle cellule e la funzione. Tuttavia, gli approcci utilizzati per la preparazione dell'acido grasso variano, che può portare a risultati non-fisiologica. Albumina, un vettore naturale per gli acidi grassi nel sangue periferico dei mammiferi, è consigliabile per la formazione di un coniugato complesso con il sale di sodio degli acidi grassi per studiare la funzione dell'acido grasso in cellule di mammifero, riducendo così al minimo la tossicità dell'acido grasso sapone. Così, un semplice, relativamente rapido riscaldamento e sonicating metodo è sviluppato e presentato qui per la formazione di coniugato acido grasso-BSA. Descriviamo un protocollo utilizzando acidi grassi saturi, soprattutto gli acidi stearico di indurre morte cellulare severa nei macrofagi derivato del midollo osseo del topo. Noi dimostrare ulteriormente che la morte cellulare indotta da acido grasso saturo è associata positivamente con ceramide cellulare accumulato livelli. Questo metodo può essere esteso per lo studio dell'impatto dell'acido grasso sulle altre cellule di mammiferi.
Introduzione
Acidi grassi svolgono un ruolo critico nel metabolismo energetico e nella sintesi dei fosfolipidi di membrana in diversi tipi di cellule. Gli acidi grassi hanno una bassa solubilità in acqua. Una preparazione adeguata degli acidi grassi è di importanza critica per studiare le funzioni biologiche degli acidi grassi nelle cellule dei mammiferi. Quando gli acidi grassi sono preparati con etanolo, molti acidi grassi può mostrare il loro effetto tossico sapone (detersivo) sulla membrana cellulare, anche a concentrazioni relativamente basse1. Come un trasportatore naturale, importante per gli acidi grassi liberi nel siero, l'albumina di siero è considerato un buon vettore per acido grasso consegna in vitro per acido grasso funzione analisi2,3,4. Tuttavia, i dettagli della preparazione del coniugato dell'acido grasso e albumina del siero non sono solitamente disponibili anche se sono stati pubblicati molti articoli di ricerca utilizzando gli acidi grassi.
I macrofagi esprimono altamente epidermica dell'acido grasso-proteina e adiposo dell'acido grasso-legante della proteina5,6,7,8. Essi attivamente l'assorbimento saturata e acidi grassi insaturi che possono regolare le loro funzioni immuni. Per studiare l'impatto degli acidi grassi sui macrofagi e altre cellule, diversi metodi di preparazione dell'acido grasso sono stati applicati1,7,9. Usando opportunamente preparato acido grasso/siero albumina coniugati per studiare l'impatto degli acidi grassi sulla funzione del macrofago è di importanza critica nell'ottenere dati biologicamente significativi. Studi sull'impatto degli acidi grassi sulla funzione del macrofago possono fornire conoscenze di base e potenziali bersagli terapeutici relativi al metabolismo dell'acido grasso nelle malattie del macrofago-coinvolti.
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Protocollo
il protocollo è stato approvato dalla istituzionale Animal Care and uso Committee (IACUC) della University of Louisville.
1. macrofagi derivati del midollo osseo di topo (BMDMs)
- Euthanize un mouse di tipo selvaggio a 8-week-old 6, sano usando CO 2. Aggiungerla a un bordo della gomma piuma e spruzzarlo con etanolo al 70%, fino a quando è bagnato. Togliere le ossa tibia/femore con pinze e le forbici. Metterli in una capsula di Petri con 5 mL 1 x tampone fosfato salino (PBS). Eseguire tutte le procedure in condizioni sterili.
- Tagliato aperto a entrambe le estremità della tibia/femore con una forbice in un cappuccio sterili per coltura. Sciacquare l'osso con un ago da 25 G con PBS + 2% siero bovino fetale (FBS) in una provetta da 15 mL.
- Centrifugare le cellule del midollo osseo a 500 x g, 4 ° C per 5 min.
- Risospendere il pellet cellulare in tampone di lisi delle cellule di anima rosse 1ml a lisare globuli rossi (RBC) per meno di 1 min. Diluire immediatamente con 9 mL di PBS 1X. Centrifugare nuovamente come descritto al punto 1.3. Decantare i surnatanti.
- Risospendere il pellet cellulare in 10 mL di PBS 1X, filtrare la sospensione cellulare attraverso una rete di nylon sterile 40 μm in un'altra provetta da 15 mL per rimuovere detriti cellulari/gruppi. Centrifugare nuovamente come in 1.3. Decantare i surnatanti.
- Risospendere il pellet cellulare in 15 mL Roswell Park Memorial Institute medie (RPMI) 1640 con 5% FBS e 10 μg/mL Gentamicina, piastra che le cellule in un piatto di coltura del tessuto-100mm a 37 o C incubatore per 60 min. Roteare delicatamente il piatto, togliere il galleggiante cellule e contarli.
- Piastra 6 x 10 6 cellule in un piatto di 100 mm con differenziazione media (RPMI 1640 con 5% di FBS e gentamicina 10 μg/mL, mescolato con media condizionati 30% L929 10) del macrofago di 12 mL con 10 dei macrofagi di topo ricombinante ng/mL fattore distimolazione (M-CSF) per 2 giorni.
- Dopo la coltura per 2 giorni in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2, nutrire ogni piatto con del macrofago fresco 6ml differenziazione media con 10 ng/mL M-CSF.
- Il giorno 5, prendere 8 mL di vecchi media fuori senza disturbare le celle e aggiungere del macrofago fresco 10ml differenziazione media con 10 ng/mL M-CSF.
- Il giorno 7, raccogliere i macrofagi derivate da midollo osseo (BMDMs) utilizzando un sollevatore cellulare.
Nota: Macrofagi allegati possono essere dissociati con 5 mL 1 mM EDTA in PBS 1X per 5/10 minuti dopo la rimozione delle cellule di galleggiante e lavare la piastra due volte con 5 mL di PBS 1X. Centrifugare le cellule come descritto al punto 1.3., li risospendere in fresco del macrofago differenziazione media e li contano con un emocitometro.- Conferma la BMDMs ' fenotipo da citometria a flusso come descritto 5. Preparare il mouse derivato macrofagi in una certa concentrazione per i seguenti studi.
2. BSA-grassi acido coniugato preparazione
- preparare 2 mM BSA in PBS sterile. Ad esempio, pesare 6,65 g BSA, aggiungere 30 mL di PBS 1X per sciogliere, quindi aggiungere ulteriori PBS fino a 50 mL, ridimensionamento componenti per fare 2 mM BSA in PBS 1X.
- Sale di sodio individuale di 5 mM di preparare degli acidi grassi in 2 mM BSA. Riscaldare a 37 ° C o superiore, se necessario e Sonicare la miscela di 2 mM BSA e sale di sodio degli acidi grassi, fino ad ottenuta una soluzione chiara.
Nota: Rispetto agli acidi grassi insaturi, acidi grassi saturi bisogno di una temperatura più alta e più tempo di sonicazione per dissoluzione. - Filtro la soluzione di grasso-acido-BSA attraverso un 0.22 μm filtro, aliquota in sterile microcentrifuga da 1,5 mL tubes e conservarli a 4 ° C per uso a breve termine o a-20 ° C per la conservazione a lungo termine. Nessuna precipitazione deve essere osservata dopo conservazione a 4 ° C in frigorifero.
3. Saturi acidi grassi inducono delle cellule morte del Mouse del midollo osseo macrofagi derivati
- piastra BMDMs in una piastra di coltura del tessuto 24 pozzetti con 0,4 x 10 6/ml in macrofago differenziazione media.
- Trattare le cellule con la 0.4 mM acido palmitico e acido stearico per 16-24 h in un incubatore a 37 ° C con 5% CO 2. Utilizzare BSA come controllo negativo.
- Raccogliere le cellule con un sollevatore di cella dopo trattamento e selezione verso il basso le cellule a 500 x g, 4 ° C per 5 min.
- Macchia le cellule con Annessina V-Alexa 488 e 7-aminoactinomycin D (7-AAD) in 100 μL Annessina V associazione buffer per 15 min a temperatura ambiente.
- Diluire il campione con 200 µ l di tampone di annessina-associazione, mescolare delicatamente, quindi mantenere i campioni sul ghiaccio dopo il periodo di incubazione.
- Analizzare le cellule marcate più presto di flusso cytometry 5. Annessina V-Alexa 488 viene rilevato nel canale di FITC e 7-AAD è rilevato nel canale PerCP/PerCP-Cy 5.5.
4. Colorazione di Ceramide intracellulare
- dopo trattamento dell'acido grasso, raccogliere le celle come descritto al punto 3.3. Quindi fissare le cellule in paraformaldeide al 4% per 30 min.
- Lavare il campione con 1 mL di PBS 1X, spin giù come passaggio al punto 3.3 e decantare il supernatante.
- Macchia le cellule con l'anticorpo primario anti-ceramide (diluizione 1: 200) in 100 μL 1x permeabilizzazione di tampone per 30 min.
- Lavaggio e spin giù le cellule come al punto 4.2.
- Macchia le cellule con l'anticorpo secondario (diluizione 1: 500) di IgM anti-topo in 100 μL 1x permeabilizzazione di tampone per 30 min.
- Lavaggio e spin giù le cellule come al punto 4.2. Aggiungere 250 μL 1X PBS e analizzare le cellule marcate di flusso cytometry 5.
Nota: Vedere la lista di reagente dettagliate nella tabella di apparecchiature e reagenti.
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Risultati
L'obesità aumenta le concentrazioni di acidi grassi liberi nel siero. Come fagociti professionali, macrofagi prendono attivamente gli acidi grassi per mantenere l'omeostasi host. Durante questi processi, Overload lipidi possono indurre la morte delle cellule del macrofago. A tal fine, abbiamo coltivato BMDMs in vitro con obesi livelli di acidi grassi dietetici e morte delle cellule del macrofago misurato usando flusso cytometric macchiatura. Rispetto al controllo di BSA, acidi gr...
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Discussione
La corretta preparazione della soluzione di acido grasso è di importanza critica per studiare la funzione biologica degli acidi grassi. La neutralizzazione degli acidi grassi aumenta la relativa solubilità in soluzione acquosa. Tuttavia, sali di sodio degli acidi grassi, soprattutto acidi grassi saturi, sono ancora di bassa solubilità in acqua o PBS, come abbiamo osservato. Un metodo consiste nell'utilizzare etanolo al 95-100% per aiutare a sciogliere l'acido grasso1. Utilizzando questo metodo, ma...
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interessi finanziari.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto parzialmente dai fondi di Start-up Università di Louisville e National Cancer Institute (Bethesda, MD) concede R01CA177679, R01CA180986.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Bagno ad ultrasuoni CPX | Bransonic | Modello 2800 | |
| Palmitato di sodio (PA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1109 | M.W. 278 |
| Stearato di sodio (SA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1111 | M.W. 306 |
| Albumina sierica bovina (BSA), priva di acidi grassi | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Fattore stimolante le colonie di macrofagi di topo (mM-CSF) | Tecnologia di segnalazione cellulare, Inc. | 5228 | |
| RPMI 1640 | VWR International | 71002-878 | |
| Annexin V, Alexa Fluor 488 coniugato | Fisher Scientific | A13201 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Anticorpo monoclonale anti-ceramide (IgM di topo) | Sigma | C8104-50TST | Clone: MID 15B4 |
| Goat Anti-Mouse IgM Antibody, & micro; catena, FITC coniugato | Sigma | AP128F | |
| Tampone di fissazione | Biolegend | 420801 | |
| Tampone di permeabilizzazione | Ebioscience | 4307693 | |
| Tampone per lisi dei globuli rossi | Sigma | 11814389001 | |
| Annanina V Cuscinetto di legame | BD Biosciences | 556454 | |
| cellule L929 | ATCC | CCL-1 | |
| Corning Sollevatore cellulare | Fisher Scientific | 07-200-364 | |
| Nota: M.W. sta per peso molecolare. |
Riferimenti
- Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774). Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).
- Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis. J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).
- Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity. Shock. , (2017).
- Vusse, G. J. Albumin as fatty acid transporter. Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).
- Zhang, Y., et al. Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production. J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).
- Zhang, Y., et al. Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet. Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).
- Wen, H., et al. Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling. Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).
- Zhang, Y., et al. Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages. Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).
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- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. , (2008).
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Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
