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Articolo metodologico

Una procedura chirurgica per l'amministrazione delle droghe all'interno dell'orecchio in un Non umano primati comune uistitì (Callithrix jacchus)

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DOI:

10.3791/56574

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27 febbraio 2018

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1Division of Regenerative Medicine, Jikei University School of Medicine, 2Department of Otorhinolaryngology, Jikei University School of Medicine, 3Department of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery, Keio University School of Medicine, 4Laboratory Animal Facilities, Jikei University School of Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Segnaliamo un metodo chirurgico per amministrare le droghe all'interno dell'orecchio di un primate non umano, il comune uistitì (Callithrix jacchus), tramite la membrana della finestra rotonda.

Abstract

Sentendo la ricerca lungo è stata facilitata dai modelli del roditore, anche se in alcune malattie, sintomi umani non possono essere ricapitolati. Il comune uistitì (Callithrix jacchus) è una scimmia di nuovo mondo piccola, facile da maneggiare che ha un'anatomia simile dell'osso temporale, compresi le catene degli ossicini dell'orecchio medio e orecchio interno agli esseri umani, inferiore rispetto a quello dei roditori. Qui, segnaliamo un approccio chirurgico riproducibile, sicuro e razionale alla nicchia cocleare finestra rotonda per la consegna di droga all'interno dell'orecchio di uistitì di comune. Abbiamo adottato tympanotomy posteriore, una procedura utilizzata clinicamente in chirurgia umana, per evitare la manipolazione della membrana timpanica che può causare la perdita della capacità uditiva conduttiva. Questa procedura chirurgica non ha condotto a qualsiasi significativa perdita di udito. Questo approccio è stato possibile grazie alla struttura grande bulla del marmoset comune, anche se il canale semicircolare laterale e la parte verticale del nervo facciale dovrebbe essere considerati con attenzione. Questo metodo chirurgico permette di eseguire la gestione sicura e precisa delle droghe senza perdita di udito, che è di grande importanza nell'ottenere pre-clinici proof of concept per ricerca traslazionale.

Introduzione

Perdita dell'udito neuro-sensoriale (SNHL) si manifesta principalmente da deficit nella coclea o danni. Le cause più comuni di SNHL includono invecchiamento (ad es. presbiacusia), difetti genetici, esposizione a rumori forti, infezione e farmaci ototossici1. L'organizzazione mondiale della sanità (OMS) stima che oltre 360 milioni di persone, che rappresentano il 5,3% della popolazione del mondo, soffrono di udito perdita2. Si stima anche che 1 in 900 a 1 in 2.500 neonati hanno moderato, severo, e ipoacusia permanente congenita profonda e circa uno in tre adulti oltre 65 anni hanno un certo grado di perdita di udito3. Tuttavia, non c'è nessun efficace trattamento clinico di perdita dell'udito per questi pazienti.

Ricerca di udienza lungo è stato eseguito utilizzando roditore o modelli di cavia, e molti approcci, quali la terapia genica e la terapia rigenerativa, sono stati suggeriti come un nuovo trattamento per la perdita dell'udito. Tuttavia, c'è una grande differenza tra gli esseri umani e roditori in termini di sistema uditivo, ed è molto difficile da tradurre modelli animali per applicazioni sull'uomo. Il comune uistitì (c. jacchus), una scimmia del nuovo mondo che proviene dal Rio delle Amazzoni, è diventato un modello attraente primate non umano per vari studi di ricerca di base per diversi motivi. In primo luogo, la sua anatomia e la fisiologia sono più simili a quelli degli esseri umani piuttosto che roditori. In secondo luogo, le informazioni biologiche di base riguardo a questa specie, tra cui malattie, reti neurali, il comportamento e il genoma, sono ben caratterizzate. Elaborazione uditiva e vocale, la codifica corticale di periodicità, la rappresentazione del passo e le interazioni uditivo-vocale di uistitì comuni sono stati anche segnalati4,5,6,7 , 8 , 9 , 10. in recenti studi istologici, i ricercatori hanno identificato i modelli di espressione distintiva di 20 geni sordità e scambiatori di anioni nella coclea di uistitì di comune e ha scoperto che cinque geni causativi di sordità progressiva e tre scambiatori di anioni, avuto modelli di espressione diversi da quelli di roditori11,12. Questi profili ci portano a credere che il marmoset comune è un potente strumento per la ricerca di udienza.

Gli attributi più marcati di uistitì di comune come un animale da laboratorio sono come segue:

  • Maneggevolezza con una piccola dimensione corporea rispetto ad alcune specie del vecchio mondo scimmie: uistitì adulti pesano 300-400 g e sono circa 60 cm di altezza, che è simile ai ratti.
  • Primate altamente riproduttiva: uistitì raggiungono la maturità sessuale ad un'età di 18 mesi e sono in grado di sopportare due volte all'anno e producono prole di 4 a 6 ogni anno.
  • Modificazioni genetiche sono disponibili: Sasaki E et al. è riuscito a creare transgenici13 e knock-out14 primati utilizzando Uistitì di modificazioni genetiche implicate nei disturbi neurologiciad es., morbo di Parkinson di ( malattia e malattia di Alzheimer).
  • Entrambe le cellule staminali embrionali (ES) e pluripotenti indotte (iPS) staminali sono stati stabiliti15,16. Anche se è piuttosto difficile mantenere lo stesso numero di uistitì rispetto ai roditori, la disponibilità di cellule staminali o cellule iPS fornisce saggi in vitro che ridurranno il numero di saggi in vivo necessaria.

Per facilitare la ricerca traslazionale di meglio nel campo della sordità e della sua terapia potenziale, abbiamo stabilito un protocollo di studio di imaging utilizzando CT e MRI, anestesia generale e test dell'udito utilizzando risposte uditive del tronco cerebrale (ABR). Questi sistemi sperimentali possono fornirci le migliori opportunità di ottenere la prova pre-clinico di studi concettuali che sono essenziali per colmare i divari tra gli studi del roditore e studi clinici. Qui, segnaliamo un metodo chirurgico per amministrare le droghe all'interno dell'orecchio dell'uistitì comune attraverso la membrana della finestra rotonda. Per ottenere una visione chiara intorno la finestra rotonda, senza manipolare la membrana timpanica che potrebbe causare una perdita della capacità uditiva conduttiva, è utile all'approccio da cavità mastoid. Clinicamente, questo approccio, definito come "posteriore tympanotomy" è ben consolidata e solitamente utilizzato per la chirurgia coclea impianto e cholesteatoma. Noi crediamo che tympanotomy posteriore ci permette di effettuare la gestione accurata delle droghe senza indurre la perdita della capacità uditiva.

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Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state effettuate presso l'Università di Jikei, Tokyo Giappone. Movimentazione degli animali e procedure sperimentali sono state approvate dal comitato di utilizzare della Jikei University e The Animal Care istituzionali (approvazione no: 26-060) ed eseguite in conformità con le linee guida istituzionali per l'uso degli animali da laboratorio presso il Jikei Università, che sono d'accordo con le linee guida per la corretta condotta di animale esperimenti dal Consiglio scienza del Giappone (2006). Cura degli animali è stata condotta in conformità con le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (Istituto del laboratorio animale risorse, 1996).

1. operatoria

  1. Prendere un'esplorazione cranica di tomografia computerizzata (TC) di animali (Uistiti comune) al fine di facilitare l'identificazione delle singole strutture anatomiche almeno un mese prima dell'intervento chirurgico.
  2. Eseguire un esame audiometrico almeno un mese prima dell'intervento chirurgico.
    Nota: Qui, abbiamo usato l'ABR per valutare lo stato dell'udito. Brevemente, un elettrodo positivo per via sottocutanea è stata posta al vertice e un elettrodo di riferimento negativo alla base dorsale all'orecchio stimolato. L'elettrodo di massa è stato disposto per via sottocutanea nella parte dorsale del collo. 17 , 18 ABRs sono stati evocati con raffica di tono (tono 1,0 ms durata con aumento di 0,1 ms burst e tempo di caduta). Il livello sonoro è stato poi ridotto in passi di 10 dB dalla sua massima ampiezza. A ogni livello sonoro, 512 risposte erano media (con stimolo polarità alternate). Soglia ABR è stato definito come il più basso livello di pressione sonora (SPL) in cui qualsiasi onda potrebbe essere rilevato.

2. anestesia

  1. Animali veloci dalla notte prima dell'intervento chirurgico in anestesia generale.
  2. Amministrare la 4% isoflurane e aria ambiente al 5-6 mL/min con maschera-a-faccia ventilazione oppure in una camera di induzione per induzione lenta (Figura 1A). Confermare che l'animale non risponde agli stimoli dolorosi, come il pizzico di punta.
  3. Anesthestize marmoset comune con iniezione intramuscolare (nel muscolo femorale) di una combinazione di medetomidina (0,04 mg/kg), midazolam (0,4 mg/kg) e butorfanolo (0,4 mg/kg).
  4. Iniettare per via sottocutanea ampicillina (0,08 mg/g) 30 min o più prima dell'incisione della pelle come un antibiotico preoperatorio.
  5. Posizionare l'uistitì in posizione supina con la testa verso l'alto ed estendere la testa e il collo. Difficoltà la mascella superiore al tavolo con un filo di nylon e tirare la linguetta per ottenere una buona vista, oppure utilizzare un laringoscopio per visualizzare l'epiglottide e l'entrata della laringe in alternativa (Figura 1B).
  6. Inserire un tubo endotracheale lungo la superficie laringea dell'epiglottide.
    Nota: È possibile utilizzare un catetere endovenoso di calibro 16, o 6-francese calibro tubo di alimentazione, come un tubo endotracheale (Figura 1).
  7. Verifica la EtCO2 dal tubo endotracheale al fine di confermare che è stato correttamente inserito nella trachea. Dopo aver posizionato il tubo e movimento respiratorio di gas è stato controllato, fissare il tubo endotracheale al viso di uistitì con nastro adesivo.
  8. Mantenere l'anestesia tra 1-3% Isoflurane durante l'operazione.
  9. Monitorare la SpO2, EtCO2, temperatura corporea e temperatura rettale durante le operazioni. Eseguire tutte le procedure su una stuoia di riscaldamento per evitare una diminuzione della temperatura corporea.

3. la preparazione

  1. Preparare l'uistitì in posizione supina e inclinare la testa a un angolo di 30-45 gradi al lato inoperante (Figura 2A).
  2. Radere la regione post-auricolare dal lato attivo.
  3. Disinfettare l'area chirurgica con alcool e povidone iodio, sia nella regione del alberino-auricolare e canale uditivo esterno.
  4. Mettere un foglio di telo chirurgico con un foro rotondo sulla uistitì (Figura 2B).

4. interventi chirurgici

  1. Iniettare 1% di lidocaina cloridrato (con epinefrina 1: 100.000, 0.1-0.2 mL) per via sottocutanea nel sito di incisione della pelle. Fare un'incisione nella pelle postauricular con una lama di forma circolare n ° 15.
  2. Per emostasi, applicare pressione sulla zona sanguinante utilizzando una garza imbevuta di epinefrina 1:5,000 diluito. Cauterizzazione bipolare è anche efficace (Figura 2).
  3. Aprire i tessuti molli della regione alberino-auricolare quindi quella cartilagine auricolare (c) e muscolo post-auricolare (m) può essere riconosciuto. Esporre l'osso del canale uditivo esterno che deve essere visibile nel profondo la cartilagine (Figura 3A).
  4. Per confermare la profondità della membrana timpanica, esporre la parte ossea del cerchio timpanico che può essere riconosciuto come l'aderenza della pelle e dell'osso nella parte più profonda del canale posteriore dell'orecchio.
    Nota: Questo passaggio permette di riconoscere quanto è profonda la parte laterale della cavità dell'orecchio medio è (Figura 3A).
  5. Sbucciare i muscoli alberino-auricolari (muscolo sternocleidomastoideo, muscolo di splenio della testa e del ventre posteriore del muscolo digastrico) verso l'aspetto caudale, separato dall'osso temporale. Quindi esporre la superficie laterale dell'osso temporale (asterisco nella Figura 3B).
  6. Fare un foro di circa 5 mm dietro il canale uditivo esterno con un fu seppellito nel diamante di 1,0 mm (Figura 3). Utilizzare una velocità di punta di 1.000-8.000 giri/min a seconda del sito di perforazione.
    Nota: Una velocità lenta è adeguata per la delicata manipolazione vicino il canale semicircolare o del nervo facciale. Goccia a goccia la soluzione fisiologica nel sito correttamente per evitare la lesione termica di perforazione.
  7. Allargare il foro di perforazione e confermare la posizione del canale semicircolare orizzontale (HSC), che sporge verso la cavità mastoid (Figura 3D).
  8. Confermare la posizione del nervo facciale cui parte verticale viene eseguito anteriore di HSC. Forare e rimuovere tutti i setti di osso, se presenti, per ottenere una visione chiara dell'incavo facciale, che si trova al centro dell'area triangolare tra il nervo facciale e la corda del timpano.
  9. Fate un piccolo foro di perforazione tra la parte verticale del nervo facciale e il timpanico rim (asterisco nella Figura 4A) con una fresa diamantata di diametro 0,6 mm a 1.000 giri/min.
  10. Spostare la fresa parallela alla parete posteriore del canale per evitare danni al nervo facciale, che può essere visto come una linea rosa attraverso l'osso assottigliata. Fermare la trivella immediatamente prima che il nervo è esposto come una struttura di linea bianca (Figura 4B).
  11. Garantire che la nicchia della finestra rotonda possa essere visualizzata attraverso il foro (Figura 4). Quindi, amministrare farmaci nella nicchia con un ago calibro 25 o più sottile. Al fine di conservare i farmaci nella nicchia della finestra rotonda, posizionare una soluzione viscosa sulla nicchia (Figura 4).
  12. Dopo aver confermato che l'emostasi è saldamente controllata, chiudere gli strati (strato epidermico e dermico strato) con semplice sutura interrotto utilizzando thread assorbente 6-0.
  13. Difficoltà garza sulla ferita chirurgica e apporre un bendaggio.

5. postoperatoria

  1. Amministrare atipamezolo cloridrato (0,15 mg/kg) per via intramuscolare nel muscolo femorale di contrapporrsi medetomidina.
  2. Quando inizia di respirazione spontanea, rimuovere il tubo endotracheale.
  3. Mantenere il marmoset comune in un'unità di cure intensive al 30% O2, 29 ℃ fino a quando l'anestesia svanisce per completare l'eccitazione.
  4. Confermare che non ci sono risultati indicativi di disfunzione vestibolare come nistagmo e restituire l'animale nella gabbia di allevamento.

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Risultati

Tympanotomy posteriore è stato effettuato senza alcuna complicazione come un'infezione del sito chirurgico, sanguinamento con lesioni vascolari o disfunzione vestibolare, che a volte si verifica con la manipolazione dell'orecchio medio. Abbiamo effettuato tympanotomy posteriore sull'orecchio destro del marmoset comune 7-anno-vecchio ed amministrato 1 µ l di tampone fosfato salino per la nicchia della finestra rotonda. ABRs sono stati misurati prima e due mesi dopo l'intervento chirurgico ...

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Discussione

Il volume del flusso sanguigno cocleare è estremamente piccolo, stimato nell'ordine di 1/1.000.000 di gittata cardiaca totale in esseri umani, e l'accesso è limitato dalla presenza della barriera sangue-coclea che separa l'orecchio interno dalla circolazione generale19 ,20. Per questi motivi, droga o amministrazione di vettore virale nell'orecchio interno è favorevole, non tramite somministrazione sistemica ma piuttosto di amministrazione diretta. Nel topo e cav...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Il lavoro è supportato da sovvenzioni per M.F. dal governo giapponese MEXT KAKENHI (24592560, 15 H 04991 e 15 K 15624) e la Fondazione di scienza di Takeda di M.F. e il Jikei University priorità ricerca fondo strategico per H.J.O.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
uistitì comuneCLEA GiapponeEDM:C.Marmoset(Jic)
isofluranoPhizer
medetomidinaZENOAQ
midazolamastellas
butorphanolMeiji Seika
ampicillinaMeiji Seika
lidocaina cloridratoAstraZeneca
6-0 filo assorbenteETHICONRD-1
atipamezolo cloridratoZENOAQ
soluzione salina tamponata con fosfatoWako045-29795
Surge WaveMoritaTR-900-OR
Diamond Bar 006Morita14070057
Diamond Bar 010Morita14070081
unità di terapia intensivaMenixP-100

Riferimenti

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