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Articolo metodologico

Alla ricerca di Driver delle vie di acquisito resistenza alla terapia mirata: generazione farmacoresistenti Subclone e sensibilità ripristino di Gene Knock-down

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DOI:

10.3791/56583

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11 dicembre 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biosciences Laboratory, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 2Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS

In questo articolo

Sommario

Si tratta di un protocollo di tempo e costi efficaci in vitro indagare i meccanismi della resistenza acquisita agli agenti terapeutici mirati, che è un bisogno medico altamente insoddisfatto in gestione del cancro.

Abstract

Negli ultimi due decenni hanno visto uno spostamento da farmaci citotossici a terapia mirata in oncologia medica. Anche se gli agenti terapeutici mirati hanno dimostrato efficacia clinica più impressionante e ridotto al minimo gli effetti negativi rispetto ai trattamenti tradizionali, farmacoresistenza è diventata la principale limitazione alla loro benefici. Diversi modelli preclinici/in vitro/in vivo di resistenza acquisita ad agenti mirati nella pratica clinica sono stati sviluppati utilizzando principalmente due strategie: manipolazione i) genetica per la modellazione di genotipi di resistenza acquisita e ii) in vitro / in vivo selezione dei modelli resistenti. Nel presente lavoro, proponiamo un quadro unificante, per indagare i meccanismi responsabili della resistenza acquisita agli agenti terapeutici mirati, a partire dalla generazione di subcloni cellulari resistenti alla droga alla descrizione del le procedure utilizzate per ripristinare la sensibilità all'inibitore di silenziamento. Questo approccio semplice di tempo e costi efficaci è ampiamente applicabile e può essere facilmente estesa per studiare i meccanismi di resistenza ad altri farmaci terapeutici mirati in istotipi differenti del tumore.

Introduzione

In seguito le scoperte cruciali nella biologia molecolare e cellulare, un numero di nuove molecole antitumorali sintetizzati è stato sviluppato per mirare selettivamente oncogeniche vie di segnalazione in una vasta gamma di tipi di tumore. In particolare, composti di due categorie di agenti terapeutici mirati con proprietà uniche in oncologia, vale a dire sintetici chimici e anticorpi monoclonali ricombinanti, sono noti ad aver raggiunto successi clinici e cura del cancro drammaticamente alterato in ultimi decenni1,2,3.

Tuttavia, nonostante la loro impressionante risposta iniziale al trattamento, la maggior parte dei malati di cancro hanno sviluppato resistenza ai farmaci a tutti gli agenti terapeutici mirati, sia gli anticorpi monoclonali e gli inibitori della chinasi. Di conseguenza, farmacoresistenza, il grande ostacolo per farmaci anti-cancro classico4, è ancora una grande sfida per emergenti terapie mirate5,6.

Resistenza alla terapia mirata può essere intrinseco (cioè, primario) o acquisito (cioè, secondario). Resistenza intrinseca descrive una de novo in mancanza di risposta alla terapia, mentre la resistenza secondaria si verifica dopo un periodo di risposta alla droga trattamento7. Quest'ultimo è causato da focolai di piccole coorti di cellule del tumore all'interno della massa del tumore primitivo o immerso nelle nicchie anatomiche criptici distale, che esibiscono fino al 90% resistenza a uno o più mirati agenti terapeutici. Meccanismi molecolari alla base di uno sviluppo di resistenza alla terapia mirata principalmente il risultato di mutazioni del gene bersaglio e ridondante attivazione di altre vie di segnalazione pro-sopravvivenza, cui la comprensione è lungi dall'essere completa8.

In questo lavoro, abbiamo proposto un approccio a tempo e a costi efficaci per studiare in vitro i meccanismi di resistenza acquisita agli agenti terapeutici mirati, a partire dalla generazione di subcloni cellulari resistenti alla droga alla descrizione di silenziamento procedure utilizzate per ripristinare la sensibilità all'inibitore, uno strumento fondamentale utilizzato per testare e convalidare le ipotesi di lavoro. In particolare, il nostro approccio è stato usato per studiare, nel cancro gastrico, i meccanismi di resistenza al trastuzumab (per esempio, Herceptin), un anticorpo monoclonale umanizzato il dominio extracellulare di HER2 proteina9di targeting. Trastuzumab + chemioterapia è ampiamente accettata come il trattamento standard di prima linea per tumore mammario metastatico HER2-positivo. Grazie a studi preclinici recenti che mostrano quello anti-HER2 terapie hanno attività significativa in entrambi in vitro e in vivo il cancro gastrico HER2-positivi modelli10,11, farmaci molecolari destinazione HER2 sono stati ampiamente esaminato negli studi clinici, alcuni dei quali sono ancora in corso, su pazienti con gastroesofageo cancro12,13,14,15.

Questi studi hanno sottolineato il crescente numero di pazienti che avvertono la resistenza a trastuzumab16, similmente a ciò che è osservato per altri inibitori terapeutici mirati. In particolare, il tasso di risposta di trastuzumab era 47%, e la sopravvivenza globale mediana per i pazienti su trastuzumab + chemioterapia era solo 2,7 mesi più lungo per i pazienti in chemioterapia da solo17. Ciò ha suggerito che, mentre la resistenza primaria trastuzumab è prevalente, resistenza secondaria trastuzumab è inevitabile. Per questo motivo, c'è bisogno urgente di chiarire i meccanismi che causano la resistenza di terapia mirata di HER2 nel carcinoma gastrico, che è ancora più problematico dato l'eterogeneità genetica intra-tumorale di questa neoplasia18.

Inoltre, meccanismi di resistenza al trastuzumab nel cancro gastrico hanno dimostrato difficile da spiegare, parzialmente a causa della difficoltà nell'ottenere il rappresentante di modelli preclinici affidabili di questa circostanza. Oshima et al ha segnalato un metodo di selezione in vivo di linee cellulari di carcinoma gastrico trastuzumab-resistente, composto da una cultura ripetuta di piccola metastasi peritoneale residua dopo il trattamento con trastuzumab19. Tuttavia, la necessità di un recinto, di competenza di gestione specifica degli animali e dell'approvazione del Comitato di etica animale hanno contribuito a renderlo un metodo che richiede tempo e costi. L'approccio che descriviamo in questo lavoro è semplice e ampiamente applicabile e può essere facilmente estesa per studiare i meccanismi di resistenza ad altri farmaci terapeutici differenti del tumore istotipi20.

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Protocollo

Nota: Questo protocollo è stato regolato in modo specifico per l'analisi dei meccanismi di resistenza acquisita al trastuzumab di linee cellulari di cancro gastrico HER-positivi. Tutti gli strumenti di laboratorio necessari sono riportati nella Tabella materiali.

1. generazione di subcloni resistente di terapia mirate

Nota: Questo è il più critico e difficile da standardizzare passo nel protocollo, dovuto al fatto che diverse linee cellulari possono presentare diverse sensibilità all'inibitore terapeutico mirato indipendentemente dalla loro concentrazione di droga o istotipo del tumore utilizzato.

  1. Cultura NCI-N87 cella linea in medium RPMI completate con siero fetale di vitello (10%) e glutamina (2 mM, 1%), come un monostrato a 37 ° C e semi in matracci di cultura di 25 cm2 .
  2. Aggiungere al terreno di coltura in ogni bottiglia 10 µ g/mL di trastuzumab come dose iniziale. Esporre le cellule per la dose iniziale fino a riprendere la crescita.
    Nota: La dose iniziale dell'inibitore terapia mirata dovrebbe essere 10 volte inferiore al suo picco di concentrazione plasmatica. Concentrazione di picco plasmatica è il più alto livello di concentrazione del farmaco rilevati nel sangue del paziente solito a seguito di dosi multiple di terapia standard. Questo valore può essere recuperato da studi sulla farmacocinetica.
  3. Monitorare la crescita delle cellule con il metodo di esclusione del trypan blu; Quando la crescita delle cellule è ripresa (in genere dopo un periodo di due o tre settimane), esporre le cellule ad una concentrazione di dose 10 volte superiore di trastuzumab.
  4. Esporre le cellule ad una dose gradualmente crescente di trastuzumab (da 100 µ g/mL a 400 µ g/mL) fino alle cellule continuare a crescere (dopo circa 2 settimane) nonostante la presenza di una concentrazione di farmaco alta (almeno 2,5 - 4 volte superiore rispetto al picco del plasma).
  5. Eseguire un'analisi clonogenic per valutare il livello di resistenza alla terapia mirata ad ogni cambiamento nella concentrazione dell'inibitore terapia target nel terreno di coltura e definire la resistenza relativa IC50 indice (IC RR50) come segue.
    1. 500 cellule 24 multi-pozzetto in piastre a coltura del seme.
      Nota: 5 pozzi devono essere preparati per ogni set di condizioni.
    2. Esporre le cellule a concentrazioni crescenti di inibitore (trastuzumab) terapia target da 100 µ g/mL fino a 400 µ g/mL.
    3. Incubare le cellule in un incubatore a CO2 a 37 ° C per 15 giorni.
    4. Dopo l'incubazione, difficoltà e macchia campioni come segue.
      1. Rimuovere le cellule medie e risciacquo con 10 mL di PBS 1X. Rimuovere 1X PBS e aggiungere 2-3 mL di soluzione di fissaggio (acido acetico: metanolo, 1:7, (vol/vol)). Rimuovere la soluzione di fissazione ed aggiungere la soluzione di cristalvioletto di 0,5%. Incubare a temperatura ambiente per 2 h
      2. Rimuovere con attenzione la soluzione di cristalvioletto aspirando con una pipetta e immergere le piastre in acqua di rubinetto per lavare via i residui di soluzione di cristallo viola. Asciugare a temperatura ambiente per 2 giorni.
    5. Contare le colonie di oltre 50 celle utilizzando un microscopio invertito (ingrandimento 4x).
      Nota: Due osservatori indipendenti sono necessari per questo.
    6. Calcolare IC RR50 come il rapporto tra il valore di IC50 delle cellule bersaglio-terapia-resistente subclone e il valore delle celle originale/ingenuo.

2. convalida protocollo per il candidato mirata terapia Gene di resistenza (R-gene)

Nota: Dopo la caratterizzazione dell'espressione genica, firme associate con la resistenza acquisita alla terapia target e qualsiasi gene candidato come driver di resistenza si studieranno attraverso: a) RT-PCR e b) Western blot analisi.

  1. RT-PCR in tempo reale
    1. Estrarre RNA totale da linee cellulari usando acido guanidinio tiocianato-fenolo-cloroformio miscela (Vedi Tabella materiali).
    2. Eseguire reazioni di trascrizione inversa (RT) utilizzando primers hexamer casuale e impostare il termociclatore come segue: adescamento a 25 ° C per 5 min, RT a 46 ° C per 20 min e l'inattivazione di RT a 95 ° C per 1 min.
    3. Uso 400 ng di RNA totale per una reazione di 20 µ l. Preparare la miscela di reazione per esempio come segue: 7 µ l RNasi free H2O, 2 µ l cdel DNA (10 ng / µ l), 1 µ l 20 x fluorescenti-labeled sonda specifica della destinazione e 10 µ l 2 x Mix contenente tampone, dNTPs e DNA polimerasi (Vedi Tabella materiali).
    4. Aggiungere 20 µ l di miscela di reazione per ogni piatto ben ed eseguire il seguente programma: holding fase a 50 ° C per 2 min, a 95 ° C per 10 min (1 ciclo); quindi 40 cicli a 95 ° C per 15 s e a 60 ° C per 1 min.
  2. Occidentale della macchia
    1. Recuperare le sospensioni cellulari aggiungendo 2 mL di soluzione di tripsina/EDTA 0,05% e permettendo di 2-3 min per tripsina a lavorare.
    2. Aggiungere 2 volumi di media contenente 10% siero bovino fetale per neutralizzare la tripsina (ad es., 2 mL di terreno per ogni 1 mL di tripsina) e centrifugare a 1.200 x g per 5 min. Discard surnatante e lavare le cellule con PBS 1X freddo.
    3. Centrifugare a 1.200 x g per 5 min ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare con buffer di lisi e incubare su un attuatore a 4 ° C per 30 min.
      1. La quantità di tampone di lisi dipende dal numero di celle (ad esempio, 100 µ l per 1 x 106 cellule); Assicurarsi di preparare il tampone di lisi fresco ogni volta. 1 ml di preparazione di buffer di lisi (lasciare il ghiaccio): utilizzare µ l 975 M-PER mammiferi lysate buffer, 15 inibitori di proteasi e fosfatasi µ l e 10 µ l 100 µM PMSF inibitori.
    4. Recuperare il surnatante proteina mediante centrifugazione lisato cellulare a 13.000 x g a 4 ° C per 15 min.
    5. Determinare le concentrazioni di proteina mediante un'analisi della proteina BCA.
    6. Aggiungere 4 x tampone di LaemmLi campioni proteici (almeno 20-30 µ g di proteine) e riscaldare a 100 ° C per 3 min.
    7. Utilizzare gel prefabbricati 4-20% e di carico 20-30 µ g di soluzione proteica LaemmLi e 5-10 µ l di proteina standard per campione.
    8. Riempire l'anello occidentale della macchia con il TRIS/GLICYNE /SDS 1x tampone ed esegua il gel a 110 V per 30-60 min (quando il tempo si ferma controllare che il colorante ha raggiunto la fine del gel, in caso contrario eseguire per alcuni minuti supplementari)
    9. Electroblot trasferire proteina in una membrana PVDF (Vedi Tabella materiali) utilizzando un sistema semi-secco.
    10. Bloccare la membrana mediante immersione in soluzione della proteina appropriato (latte/BSA 5%) sull'agitatore a temperatura ambiente per 1 h.
    11. Fare una soluzione di 1: 400 con l'anticorpo primario anti-IQGAP1 in una soluzione di latte del 5% (Vedi Tabella materiali).
    12. Posizionare la membrana in soluzione di anticorpo primario su un agitatore in una stanza fredda durante la notte.
    13. Il giorno seguente, scartare la soluzione di anticorpo e immergere in soluzione di T-TBS 1x (1 x T-TBS: 1x tampone salino Tris aggiunto di Tween20 0,1%) su un agitatore a temperatura ambiente per 7 min.
    14. Scartare T-TBS 1 x soluzione e Sostituisci. Ripetere 3 volte.
    15. Fare una soluzione di anticorpo secondario di 1: 10.000 con l'aggiunta dell'anticorpo per standard Western blot di rilevamento (Vedi Tabella materiali) e posizionare la membrana in un agitatore; lasciare a temperatura ambiente per 2 h.
    16. Scartare la soluzione di anticorpo e immergere in soluzione di 1 x T-TBS su un agitatore a temperatura ambiente per 7 min.
    17. Scartare T-TBS 1 x soluzione e Sostituisci. Ripetere 3 volte.
    18. Immergere la membrana per 5 minuti in una soluzione a chemiluminescenza e l'immagine della membrana su un imager di chemiluminescenza.

3. ristabilimento della sensibilità di inibitore di terapia Target di candidati R-gene Knock-down

  1. Preparazione delle cellule
    1. Preparare la sospensione unicellulare di trypsinization. Eseguire transfezione il giorno in cui le cellule sono placcate.
      1. NCI-N87 lavare le cellule con PBS e incubare a 37 ° C con soluzione di tripsina/EDTA 0,05% per 5-10 minuti aggiungere 2 volume di RPMI medium contenente 10% siero bovino fetale per neutralizzare la tripsina (ad es., 2 mL di terreno per ogni 1 mL di tripsina).
      2. Contare le celle con un emocitometro usando la macchiatura blu di trypan. Cellule di5 seme 2,5 x 10 (60% confluenza) in un pallone di2 cm di T25 per ogni condizione.
        Nota: Il numero appropriato di cellule per il seeding è determinato dal tempo di raddoppio della linea cellulare e la durata dell'esperimento. L'obiettivo è raggiungere il gene bersaglio knock-down per tutta la durata dell'esperimento. Boccette2 di nove T25 cm sono ideali per condizioni di transfezione e analisi clonogenic (3 boccette per i controlli, 3 boccette per i controlli negativi transfezione, 3 boccette per la transfezione del gene-bersaglio).
  2. Invertire la transfezione
    1. Preparare gene-bersaglio e negativi mix di transfezione di controllo per ciascuna beuta di2 cm T25 come segue.
      1. Diluire 12,5 µ l di ogni gene-targeting siRNA oligonucleotidi o oligonucleotidi di siRNA di controllo negativo in mezzo minimo essenziale transfezione (rapporto 01:55; Vedi Tabella materiali).
      2. Aggiungere un reagente di transfezione di liposomi cationici (rapporto 1:1 con oligonucleotidi di siRNA gene-targeting; Vedi Tabella materiali). Incubare a temperatura ambiente per 20 min.
        Nota: Il volume totale della miscela di transfezione è 700 µ l.
      3. Aggiungere 700 µ l della miscela transfezione ciascun matraccio di2 cm T25. Incubare le cellule a 37 ° C per 1-3 giorni.
    2. Verificare gene knock-down tramite RT-PCR e Western blot. Verificare l'impatto del presunto R-gene knock-down sul restauro sensibilità all'agente terapeutico mirato attraverso esperimenti di formazione di Colonia (ripetere passo 1.5).

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Risultati

Figura 1 delinea il quadro delle procedure sperimentali. Tre cancro gastrico-linee cellulari che esprimono un elevato livello di HER2 e sensibile al trastuzumab (IC50 < livello del plasma di picco del grafico di sinistra di droga, Figura 2A,) sono state coltivate in terreno di coltura contenente l'agente terapeutico mirato. Una dose 10 volte inferiore la concentrazione plasmatica di picco di trastuzumab (10 µ g/mL) ...

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Discussione

Mentre personalizzate e mirate terapie hanno suscitato entusiasmo crescente, queste cosiddette terapie 'intelligente' affrontano il grande ostacolo stesso come farmaci chemioterapici tradizionali, vale a dire, l'acquisizione rapida e imprevedibile di farmaco resistenza. Per migliorare i risultati della terapia mirata, farmaco-resistenza problemi devono essere risolti attraverso una migliore comprensione dei meccanismi che li provocano. Qui, abbiamo presentato una metodologia ampiamente accessibili in vitro <...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Veronica Zanoni per la modifica il manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Il reagente TrizolInvitrogen15596026Il reagente TRIzol è un reagente per isolare RNA totale di alta qualità o isolare contemporaneamente RNA, DNA e proteine da una varietà di campioni biologici
KIT DI SINTESI DEL CDNA ISCRIPTBio-Rad1708891Il kit di sintesi del cDNA iScript è un kit di sintesi del cDNA del primo filamento sensibile e facile da usare per l'analisi dell'espressione genica utilizzando la qPCR in tempo reale.
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Reagente per l'estrazione di proteine di mammifero M-PERThermo Scientific78501Il reagente per l'estrazione di proteine di mammifero M-PER è progettato per fornire un'estrazione di proteine solubili totali altamente efficiente da cellule di mammifero in coltura.
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Kit per il dosaggio delle proteine Pierce BCAThermo Scientific23225Il kit per il dosaggio delle proteine Pierce BCA di Thermo Scientific è un set di test a due componenti, ad alta precisione e compatibile con i detergenti, per misurare la concentrazione totale di proteine (A562 nm) rispetto a uno standard proteico.
4x Laemmli Sample BufferBio-Rad1610747Utilizzare 4x Laemmli Sample Buffer per la preparazione dei campioni per SDS PAGE. Per la riduzione dei campioni, aggiungere un agente riducente come il 2-mercaptoetanolo al tampone prima di miscelarlo con il campione.
4– Gel proteici prefabbricati Mini-PROTEAN TGX al 20%Bio-Rad456-1094I gel TGX (Tris-Glycine eXtended) a lunga durata hanno una nuova formulazione e possono essere utilizzati sia per le separazioni standard di proteine denaturanti che per l'elettroforesi nativa.
Standard di blotting Precision Plus Protein WesternCBio-Rad1610376standard Precision Plus Protein Prestained sono disponibili nei formati Dual Color, All Blue, Kaleidoscope e Dual Xtra. Tutti e quattro hanno gli stessi modelli di migrazione del gel, con 3 bande di riferimento ad alta intensità (25, 50 e 75 kD).
10x Tris/Glycine/SDSBio-Rad161073210x Tris/glycine/SDS è un tampone di corsa premiscelato per la separazione di campioni proteici mediante SDS-PAGE.
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Coniugato Precision Protein StrepTactin-HRPBio-Rad1610381Coniugato StrepTactin-Perossidasi di Rafano (HRP) per la rilevazione chemiluminescente o colorimetrica degli standard proteici non colorati Precision Plus Protein o degli standard proteici Precision Plus Protein WesternC su western blot.
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Il siRNA a controllo negativo universale12935300controllo negativo non ha somiglianze significative con sequenze geniche di topo, ratto o uomo. Il controllo è stato testato anche in screening cellulari e ha dimostrato di non avere alcun effetto significativo sulla proliferazione, la vitalità o la morfologia cellulare.
opti-MEM Glutamax MediumThermo Fisher Scientific51985026Opti-MEM Medium è un terreno minimo essenziale (MEM) migliorato che consente una riduzione dell'integrazione di siero fetale bovino di almeno il 50% senza alcun cambiamento nel tasso di crescita o nella morfologia.
Selezione del silenziatore Pre-progettato e L'interferenzadell'RNA (RNAi) 4390824 siRNA convalidata è il modo migliore per abbattere efficacemente l'espressione genica e studiare la funzione delle proteine in un'ampia gamma di tipi di cellule.
Reagente di trasfezione Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen13778075Reagente di trasfezione Lipofectamine RNAiMAX offre una soluzione avanzata ed efficiente per la somministrazione di siRNA. Nessun altro reagente di trasfezione specifico per siRNA fornisce una somministrazione di siRNA così facile ed efficiente in un'ampia varietà di linee cellulari, inclusi tipi di cellule comuni, cellule staminali e cellule primarie, nonché tipi di cellule tradizionalmente difficili da trasfettare.
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Spettrofotometri per microvolumiThermo ScientificNanodropFornisce una misura accurata e veloce dei nucleidi acidi utilizzando un piccolo volume di campione
Sistema di blottingBio-RadTrans-Blot TurboEsegue un trasferimento semy-dry in pochi minuti
Sistema di acquisizione immagini e documentazione su gel ImmagineBio-RadChemidoc èfacile da usare per il rilevamento chemiluminescente
Gli a Sistema Sistema

Riferimenti

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  13. ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01748773. A Study of the Combination of Oxaliplatin, Capecitabine and Herceptin (Trastuzumab) and Chemoradiotherapy in The Adjuvant Setting in Operated Patients With HER2+ Gastric or Gastro-Esophageal Junction Cancer (TOXAG Study). , Available from: http://www.clinicaltrials.gov/show/NCT01748773 (2017).
  14. ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01472029. Explorative Phase II Study of Perioperative Treatment in Patients With Adenocarcinoma of the Gastroesophageal Junction or Stomach (HerFLOT). , Available from: http://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01472029 (2017).
  15. ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01196390. Radiation Therapy, Paclitaxel, and Carboplatin With or Without Trastuzumab in Treating Patients With Esophageal Cancer. , Available from: http://clinicaltrials.gov/show/NCT01196390 (2017).
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