Articolo metodologico

Rilevamento e rimozione di nucleasi contaminazione durante la purificazione del prototipo ricombinanti Virus schiumoso integrasi

DOI:

10.3791/56605

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8 dicembre 2017

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1Department of Cancer Biology and Genetics, The Ohio State University College of Medicine

In questo articolo

Sommario

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Proteina di integrasi del virus schiumoso prototipo ricombinante è spesso contaminata con una nucleasi batterica durante la purificazione. Questo metodo identifica contaminazione nucleasi e lo rimuove dalla preparazione finale dell'enzima.

Abstract

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La proteina di integrasi (IN) del virus schiumoso del prototipo di retrovirus (PFV) è un enzima di modello per studiare il meccanismo di integrazione retrovirale. Rispetto IN da altri retrovirus, PFV IN è più solubile e più suscettibili di manipolazione sperimentale. Inoltre, è sensibile a inibitori dell'IN clinicamente rilevanti virus di immunodeficenza umana (HIV-1), suggerendo che il meccanismo catalitico di PFV IN è simile a che di HIV-1 pollici pollici catalizza l'Unione covalente di virale DNA complementare (cDNA) per destinazione DNA in un processo chiamato trasferimento strand. Questa reazione di trasferimento del filo introduce Nick al DNA dell'obiettivo. Analisi dei prodotti di reazione di integrazione possono essere confuso dalla presenza di nucleasi quel nick allo stesso modo del DNA. Una nucleasi batterica è stata indicata per co-purificare con ricombinante IN PFV espressa in Escherichia coli (Escherichia coli). Qui descriviamo un metodo per isolare PFV IN dalla nucleasi contaminante dalla cromatografia di affinità di eparina. Le frazioni sono facilmente schermate per contaminazione di nucleasi con un plasmide supercoiled e l'elettroforesi del gel dell'agarosi. PFV IN e i contaminante nucleasi display alternativo affinità per eparina sepharose permettendo una preparazione nucleasi-free of recombinant PFV IN adatto per analisi biochimiche o singola molecola di massa di integrazione.

Introduzione

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Gli studi biochimici e singola molecola delle interazioni della proteina con DNA richiedono proteine ricombinanti eccezionalmente pure. Contaminando nucleasi da batteri possa oscurare i risultati di queste analisi. Una nucleasi contaminante è stata trovata in preparazioni a base di proteine ricombinanti ossigeno scavenger protocatecuato-3,4-diossigenasi (PCD) e prototipo virus schiumoso (PFV) integrasi (IN) isolato da Escherichia coli (Escherichia coli)1 , 2 , 3.

Integrazione retrovirale saggi si basano sulla conversione del DNA s....

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Protocollo

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1. indurre PFV nell'espressione in e. coli

  1. Aggiungere 1 μL di plasmide di espressione IN PFV (10 ng / µ l) a 20 μL di e. coli BL21 (DE3) pLysS (aliquota da 20 μL di celle disponibili in commercio è > 2 x 106 CFU/μg plasmide) in una provetta da 1,5 mL. Mescolare delicatamente dal dito toccando o sfogliando il tubo. Incubare in ghiaccio 5 min.
    1. Calore shock per esattamente 30 s in un 42 ˚ c bagno d'acqua e quindi tornare immediatamente in ghiaccio per 2 min.
    2. Aggiungere 80 µ l di brodo super ottimale di temperatura ambiente con media di repressione (SOC) dei cataboliti. Incubar....

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Risultati

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Ricombinante IN PFV è spesso contaminato con una nucleasi batterica1. Le analisi biochimiche integrazione dipendono la quantificazione della conversione del DNA del plasmide supercoiled cerchi rilassati e prodotti lineari. La presenza di una contaminante nucleasi potrebbe portare a spuria quantificazione di queste analisi. Espressione di PFV IN con un tag hexahistidine è indotta in e. coli (Figura 1) e prima purificati mediante cromatografia di affinità di ni.......

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Discussione

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Proteine ricombinanti che interagiscono con il DNA, come proteine, spazzini di ossigeno per le applicazioni di microscopia di singola molecola, o retrovirali integrases, di riparazione del DNA dovrebbero essere liberi di contaminanti batterici nucleasi2,3. Questi contaminanti possono confondere l'interpretazione dei risultati durante saggi biochimici o singola molecola alla rinfusa.

Abbiamo trovato che una nucleasi batterica frequentem.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato da NIH AI099854 e AI126742 a chiave.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
BL21/DE3 Rosetta E. coliEMD Millipore70956-4
LB brodoEMD biosciences1.10285.0500
AmpicillinaAmresco0339
Cloramfenicolo Amresco0230
PBSSigma-AldrichD8537
IPTG Denville ScientificCI8280
ZnCl2Sigma-Aldrich208086
Tris Ultra PureGojira Fine ChemicalsUTS1003
NaClP212121RP-S23020
PMSF Amresco0754
Imidazole Sigma-AldrichI0250
DTT P212121SV-DTT
UltraPure EDTAInvitrogen/Gibco15575
MgSO4Amresco0662
Agarosio Denville ScientificCA3510
Bromuro di etidioThermo Fisher ScientificBP1302
GliceroloFisher ScientificG37-20
Ni-NTA SuperflowQiagen30430
Eparina Sefarosio 6 Fast FlowGE Healthcare Life Sciences17-0998-01
HRV14 3C proteasi Prodotti chimici EMD71493-3

Riferimenti

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  1. Lopez, M. A. Jr, Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
  2. Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease....

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Tag

Purificazione delle proteineCromatografia di affinit per l eparinaProteina ricombinanteSDS PAGESaggio della nucleasiElettroforesi su gel di agarosioDNA plasmidicoEspressione in E coli

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