Site-Directed immobilizzazione della proteina morfogenetica ossea 2 a superfici solide di Click Chemistry

Sommario

Biomateriali drogati con Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2) sono stati utilizzati come una nuova strategia terapeutica per guarire fratture ossee non sindacale. Per superare gli effetti collaterali derivanti da un'incontrollabile rilascio del fattore, vi proponiamo una nuova strategia per sito-direttamente immobilizzare il fattore, creando così materiali con migliorate capacità osteogeniche.

Abstract

Diverse strategie terapeutiche per il trattamento di non-guarigione dell'osso lungo i difetti sono state studiate intensivamente. Attualmente utilizzati trattamenti presenti numerose limitazioni che hanno portato all'uso di biomateriali in combinazione con fattori di crescita osteogeniche, quali proteine morfogenetiche dell'osso (BMP). Metodi comunemente usati di assorbimento o incapsulamento richiedono quantità sovra-fisiologiche di BMP2, in genere causando un effetto di rilascio cosiddetto scoppio iniziale che provoca diversi effetti collaterali negativi gravi. Una possibile strategia per superare questi problemi sarebbe coppia covalentemente alla proteina al patibolo. Inoltre, accoppiamento deve essere eseguita in modo specifico del sito al fine di garantire un risultato riproducibile prodotto. Pertanto, abbiamo creato una variante BMP2, in cui un amminoacido artificiale (propargil-L-lisina) è stata introdotta nella parte matura della proteina BMP2 di espansione l'utilizzo di codone (BMP2-K3Plk). BMP2-K3Plk è stata accoppiata al funzionalizzati perline attraverso catalizzata rame azide-alchino cicloaddizione (CuAAC). L'attività biologica dell'accoppiata BMP2-K3Plk è stata dimostrata in vitro e l'attività osteogenica delle perle BMP2-K3Plk-funzionalizzati è stata dimostrata nelle analisi delle cellule basata. Le perline funzionalizzate a contatto con cellule C2C12 erano in grado di indurre l'espressione di fosfatasi alcalina (ALP) nella prossimità localmente limitato del tallone. Così, da questa tecnica, possono essere prodotto funzionalizzate impalcature che può innescare la differenziazione delle cellule verso una linea osteogenica. Inoltre, le dosi più basse BMP2 sono sufficienti a causa dell'orientamento controllato del sito diretta accoppiato BMP2. Con questo metodo, BMPs sono sempre esposti ai loro ricevitori sulla superficie delle cellule con l'orientamento appropriato, che non è il caso se i fattori sono accoppiati tramite tecniche di accoppiamento non-luogo-diretta. Il risultato prodotto è altamente controllabile e, quindi, risultati in materiali con proprietà omogenea, migliorando la loro applicabilità per la riparazione di dimensione critica dell'osso difetti.

Introduzione

L'obiettivo finale di rigenerazione ossea del tessuto dell'osso e ingegneria è quello di superare gli svantaggi e limitazioni che si verificano durante i trattamenti comuni delle fratture non-Unione. Auto o allo trapianti sono usati principalmente come attuali strategie di terapia, anche se entrambi hanno diversi inconvenienti. L'innesto osseo ideale dovrebbe indurre osteogenesi di osteoinduzione così come osteoconduzione, conduce per l'osteointegrazione dell'innesto dell'osso. Al giorno d'oggi, solo auto-trapianto è considerato come il "gold standard", poiché esso fornisce tutte le caratteristiche di un innesto di osso ideale. Purtroppo, esso presenta anche importanti aspetti negativi, quali tempi chirurgici lungo e un secondo sito di trauma che solitamente comporta ulteriori complicazioni (ad es., dolore cronico, formazioni di ematoma, infezioni, difetti estetici, ecc.). Trapianto allogenico, d'altra parte hanno caratteristiche non ottimali per tutti gli aspetti generali¹. Tecnologie di innesto osseo alternativi sono stati migliorati negli ultimi pochi anni, con l'obiettivo di produrre impalcature che sono osteoinduttivo, osteoconduttivo, biocompatibile e bioriassorbibile. Poiché molti biomateriali non mostrare tutte queste caratteristiche osteogeniche, fattori di crescita differenti, principalmente BMP2 e BMP7, sono state integrate al fine di migliorare il potenziale osteogenico dell' impalcatura particolare².

Come criterio essenziale, tali sistemi di consegna di fattore di crescita dovrebbe fornire un rilascio di dose controllata nel tempo al fine di facilitare gli eventi essenziali come reclutamento di cellule e attaccamento, ricrescita delle cellule e l'angiogenesi. Tuttavia, BMPs così come altri fattori di crescita osteogeniche sono stati comunemente immobilizzato non covalentemente³. Tecniche di intrappolamento e adsorbimento richiedono l'uso di sovra-fisiologiche quantità di proteine a causa un rilascio di scoppio iniziale, che porta a gravi svantaggi in vivo, che interessa tipicamente i tessuti circostanti inducendo la crescita eccessiva dell'osso, osteolisi, gonfiore e infiammazione⁴. Così, la conservazione dei fattori di crescita nel sito di consegna per lunghi periodi di tempo può essere ottenuta metodi di immobilizzazione covalente. Modificati chimicamente BMP2 (succinylated⁵, acetilata⁶ o biotinilati⁷), ingegnerizzato eterodimeri⁸, o BMP2 oligopeptidi derivata⁹ sono stati progettati e utilizzati per superare le limitazioni relative al assorbimento. Tuttavia, la bio-attività di questi costrutti non è prevedibile, poiché la disposizione potenzialmente inibisce il legame del ligando immobilizzato ai ricevitori cellulari. Come illustrato in precedenza, è essenziale che tutte le quattro catene di recettori coinvolte nella formazione di complessi ligando-recettore attivato interagiscano con la BMP2 immobilizzato per attivare completamente tutto a valle segnalazione cascades¹⁰.

Per superare i problemi di un risultato prodotto non omogeneo con limitazioni in termini di bioattività, stabilità e biodisponibilità del fattore immobilizzato, abbiamo progettato una variante BMP in grado di legare covalentemente impalcature in maniera diretta al sito. Questa variante, definita BMP2-K3Plk, comprende un amminoacido artificiale introdotta dal codone genetica espansione¹¹. Questa variante è stata collegata con successo a ponteggi utilizzando una strategia di accoppiamento covalente pur mantenendo la sua attività biologica.

Protocollo

1. produzione della variante BMP2 BMP2-K3Plk

1. Clonazione di BMP2-K3Plk di mutagenesi sito-diretta mediante PCR ¹²
   1. Amplificare BMP2 maturo umano (hmBMP2) da un vettore di p25N-hmBMP2 (Vedi Tabella materiali) con un primer forward (5' GACCAGGACATATGGCTCAAGCCTAGCACAAACAGC 3') e un primer inverso (5' CCAGGAGGATCCTTAGCGACACCCACAACCCT 3') l'introduzione di un codone di stop ambra ( TAG) nella posizione della lisina prima di BMP2´s parte matura. Eseguire la reazione di PCR utilizzando 33,5 µ l di H₂O, 10 µ l di miscela di reazione PCR, 1,5 µ l di soluzione stock di 10 µM dNTP, 1,5 µ l di primer forward (10 pmol / µ l), 1,5 µ l di primer reverse (10 pmol / µ l), 1 µ l di p25N-hmBMP2 (10 ng / µ l) e 1 µ l di DNA polimerasi (Vedi Tabella materiali) in un termociclatore (denaturazione a 95 ° C per 5 min, 30 cicli di denaturazione a 95 ° C per 1 min, ricottura a 60 ° C per 1 min, l'allungamento a 72 ° C per 1 min e un'estensione finale a 72 ° C per 10 min).
   2. Purificare il prodotto PCR utilizzando un kit disponibile in commercio seguendo le raccomandazioni del produttore (Vedi Tabella materiali).
   3. Digerire il prodotto di PCR con l'enzima di restrizione NdeI a 37 ° C per 45 min utilizzando 16 µ l di H₂O, 3 µ l di tampone di digestione, 10 µ l di DNA (20 ng / µ l) e 1 µ l di enzima di restrizione. Calore-inattivare l'enzima a 65 ° C per 5 min. digerire il prodotto di PCR con l'enzima di restrizione BamHI a 37 ° C per 1 h utilizzando 16 µ l di H₂O, 3 µ l di tampone di digestione, 10 µ l di DNA (20 ng / µ l) e 1 µ l di enzima di restrizione. Calore-inattivare l'enzima a 80 ° C per 5 min.
   4. Digerire il vettore di pET11a-pyrtRNA con NdeI a 37 ° C per 2 h e 45 min utilizzando 16 µ l di H₂O, 3 µ l di tampone di digestione, 10 µ l di DNA (20 ng / µ l) e 1 µ l di enzima di restrizione. Calore-inattivare a 65 ° C per 5 min. digerire il vettore di pET11a-pyrtRNA con BamHI a 37 ° C per 1 h utilizzando 16 µ l di H₂O, 3 µ l di tampone di digestione, 10 µ l di DNA (20 ng / µ l) e 1 µ l di enzima di restrizione. Inattivare a caldo a 80 ° C per 5 min.
   5. Separare il vettore digerito dal vettore non digerito e i resti di digestione di agarosio gel elettroforesi (agarosio 0.8%, 60 min a 100 V). Legare l'inserto BMP2-K3TAG digerito con spina dorsale digerito pET11a-pyrtRNA a temperatura ambiente (TA) per 2 h usando 100 ng di pET11a-pyrtRNA spina dorsale e 34,5 ng di inserto BMP2-K3TAG (rapporto molare 1:3). La miscela di reazione contiene la spina dorsale del DNA e inserto, 2 µ l di tampone di ligasi, 1 µ l di DNA ligasi e H₂O a un volume totale di 20 µ l.
   6. Eseguire una co-trasformazione di pET11a-pyrtRNA-BMP2-K3Plk e pSRF-duetto-pyrtRNAsynth nei batteri BL21 (DE3):
      1. Aggiungere 50 ng di ogni plasmide ai batteri, mettere il composto sul ghiaccio per 30 min, shock termico a 42 ° C per 50 s, mettere sul ghiaccio per 5 min, aggiungere 500 µ l di terreno di Lisogenesi brodo (LB) nella miscela e agitare a 300 giri/min per 60 min.
      2. Sviluppa 100 µ l della miscela batterica sul pre-riscaldata kanamicina (50 µ g/mL) / lastre di ampicillina (100 µ g/mL) e incubare per una notte a 37 ° C.
2. Espressione e purificazione di BMP2-K3Plk ^{13 , 14}
   1. Propagare una singola Colonia pernottamento in 50 mL di LB medium con 50 µ g/mL di kanamicina e 100 µ g/mL di ampicillina a 37 ° C.
   2. Diluire una notte Culture 01:20 in 800 mL di medium di formidabile brodo (TB) completate con 50 µ g/mL di kanamicina e 100 µ g/mL di ampicillina e crescere a 37 ° C fino a quando viene raggiunto un OD₆₀₀ di 0,7. Aggiungere propargil-L-lisina a una concentrazione finale di 10 mM. Raccogliere un campione di 100 µ l dalla cultura prima di induzione di isopropile β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG).
   3. Indurre l'espressione genica mediante l'aggiunta di IPTG ad una concentrazione finale di 1 mM. Far crescere la cultura a 37 ° C per 16 h in un agitatore orbitale a 180 giri/min. Raccogliere un campione di 100 µ l dalla cultura.
   4. Centrifugare a tutta la cultura a 9000 x g per 30 min. scartare il supernatante e risospendere il pellet batterico in 30 mL di tampone TBSE (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 millimetro di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)) con 1: 1000 (v/v) 2-mercaptoetanolo (appena aggiunto).
      Attenzione: Maneggiare 2-mercaptoetanolo sotto la cappa. Evitare il contatto con pelle e occhi. Evitare l'inalazione di vapore o nebbia. Eseguire tutti i passaggi di risospensione con buffer contenente 2-mercaptoetanolo sotto la cappa.
   5. Pesare un beaker vuoto centrifuga e trasferire il sedimento risospeso nel becher vuoto. Centrifugare a 6.360 x g per 20 min. scartare il sopranatante e pesare il becher con la pallina. Sottrarre il peso del bicchiere vuoto per calcolare il peso del pellet.
      Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Congelare il pellet a-20 ° C a breve termine o a-80 ° C a lungo termine. Al momento della ripresa del protocollo, scongelare il pellet a TA.
   6. Risospendere il pellet in STE tampone (Tris 10 mM pH 8.0; 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, saccarosio 375 mM; 1: 1000 (v/v) 2-mercaptoetanolo (appena aggiunto)). Utilizzare 200 mL di buffer di STE per ogni 10 g di pellet.
   7. Sonicare la sospensione su ghiaccio (10 min con 40 s pulse, freno s 20 e 30% ampiezza). Centrifugare a 6.360 x g per 20 min. scartare il sopranatante e pesare il pellet. Ripetere i passaggi di sonicazione e centrifugazione 4 volte.
   8. Risospendere il pellet in 100 mL di tampone TBS (10 mM Tris, 150 mM NaCl). Centrifugare a 6.360 x g per 20 min. scartare il sopranatante e pesare pellet.
   9. Risospendere il pellet in buffer di nucleasi (100 mM Tris, 1 mM EDTA, 3 mM MgCl₂) con appena aggiunto 80 nucleasi U/mL (ad es., benzonasi) utilizzando 10 mL/g di pellet. Incubare la sospensione durante la notte a RT su una piastra di agitazione (30 giri).
   10. Aggiungere tampone di Triton (60 mM EDTA, 1.5 M NaCl, 6% (v/v) 4-(1,1,3,3-tetrametilbutil) fenil-polietilenglicole) alla sospensione. Il volume di tampone di Triton per aggiungere corrisponde ad una parte di 0,5 volume della sospensione. Incubare per 10 min a RT (nessuna agitazione). Centrifugare a 6.360 x g per 20 min. scartare il sopranatante e pesare il pellet.
   11. Risospendere il pellet in buffer di TE (100 mM Tris, 20 mM EDTA) utilizzando 8 mL/g di pellet. Centrifugare a 6.360 x g per 20 min. scartare il sopranatante e pesare il pellet.
   12. Risospendere il pellet con l'aggiunta di 4 mL/g 25 mM a Pierantonio pH 5.0 e 5 mL/g di 6 M GuCl con 1 mM dithiothreitol (DTT) (appena aggiunto). Incubare la sospensione durante la notte a 4 ° C su una piastra di agitazione (30 giri).
   13. Centrifugare a 75.500 x g per 20 min. Il surnatante ora contiene la proteina unfolded monomerica BMP2. Raccogliere il surnatante e concentrato questo estratto a 20 OD/mL utilizzando una membrana di cut-off (MWCO) di peso molecolare 3 kDa in una concentrazione delle cellule (Vedi Tabella materiali).
   14. Aggiungere i monomeri concentrati in singole gocce nel buffer di rinaturazione (2m LiCl, 50 mM Tris, CHAPS 25 mM, 5 mM EDTA, bisolfuro di 1 mM del glutatione (GSSG), 2 mM del glutatione (GSH)) agitando (30 giri). Incubare a RT per 120 ore al buio.
       Nota: durante questo periodo di incubazione, ripiegamento occours. La soluzione da questo punto in poi contiene il piegato dimerica BMP2-K3Plk.
   15. Regolare il pH della soluzione a 3.0 utilizzando concentrato HCl. Dialyze la soluzione contro 1 mM HCl. concentrato la soluzione dializzata utilizzando una membrana di cut-off (MWCO) peso molecolare 10 kDa in una cella di concentrazione.
   16. Equilibrare la soluzione aggiungendo buffer (20mm Pierantonio, 30% isopropanolo). Aggiungere un volume di tampone A corrispondente ad un volume di 30% della soluzione. Centrifugare la soluzione a 4700 x g per 15 min.
   17. Equilibrare la colonna di scambio ionico su un di sistema di cromatografia in fase liquida (FPLC)¹⁵ proteine veloci con 150 mL di tampone carico r. la soluzione della proteina sulla colonna equilibrata. Eluire frazioni utilizzando una sfumatura lineare del buffer B (20mm Pierantonio, 30% isopropanolo, 2 M NaCl) con 100 mL di frazioni di mL di tampone di B. raccogliere 2.
       Nota: Concentrare la proteina prima di caricare la colonna in base al volume totale colonna. Il volume finale di proteine dovrebbe essere < 5% del volume totale colonna.
   18. Analizzare 20 µ l di ciascuna frazione di SDS poliacrilammide gel (12%) elettroforesi (SDS-PAGE) ¹⁶ e colorante Coomassie Brilliant Blue¹⁷ (Vedi Tabella materiali).
       Nota: Il Coomassie Brilliant Blue macchiato SDS-PAGE gel spettacoli frazioni contenenti dimeri (26 kDa) e frazioni contenenti monomeri (13 kDa).
   19. Frazioni contenenti dimero di piscina. Dializzare la piscina del dimero contenente frazioni durante la notte a 4 ° C contro 1 mM HCl (volume di 5 litri). Concentrare il prodotto finale utilizzando un 10 kDa concentrando unità filtro centrifugo (Vedi Tabella materiali). Analizzare il prodotto finale mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS (12%) (SDS-PAGE) e la macchiatura Coomassie Brilliant Blue.
       Nota: La band il Coomassie Brilliant Blue macchiato SDS-PAGE gel dovrebbe mostrare soltanto una fascia al kDa 26. Questo è il prodotto finale BMP2-K3Plk.

2. ottimizzazione di rame (I)-catalizzata alchino-Azide cicloaddizione (CuAAC) condizioni

1. Effetto di ascorbato di sodio (NaAsc) e solfato di rame (II) (CuSO ₄ ) _{il tipo selvaggio BMP2 (BMP2-WT)}
   1. Incubare 20 µM BMP2-WT con differenti rapporti di NaAsc a CuSO₄. Utilizzare 0,5 mM NaAsc e 0,5 mM CuSO₄ (a partire di concentrazione) in un volume di 50 µ l. Procedere con i seguenti rapporti di NaAsc di CuSO₄: (1:1), (1.7:1), (10:1), (20: 1), mantenendo costante la concentrazione di CuSO₄ a 0,5 mM e regolando di conseguenza la concentrazione di NaAsc. Eseguire la reazione in H₂O su un miscelatore rotante (20 giri) durante la notte a TA.
   2. Preparare campioni ridotti con l'aggiunta di tampone di caricamento contenente 5% 2-mercaptoetanolo e incubare il campione a 95 ° C per 6 min. Analyze ridotto e non ridotta campioni di SDS poliacrilammide gel (12%) elettroforesi (SDS-PAGE) e macchiatura Coomassie Brilliant Blue. Il Coomasie macchiato gel di SDS-PAGE mostrano bande nella gamma di 13 kDa (ridotta conditons)-26 kDa e più alto peso molecolare (non ridotte condizioni).
2. Effetto di Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl) amine (THPTA) sulla reazione di CuAAC
   1. Incubare 20 µM BMP2-K3Plk con differenti rapporti di THPTA a CuSO₄. Utilizzare 5 mM NaAsc e 200 µM 3-Azido-7-hydroxycoumarin (NaAsc e 3-Azido-7-hydroxycoumarin mantenere costante). Utilizzare 50 µM THPTA e 0,5 mM di CuSO₄ come le concentrazioni di partenza. Utilizzare differenti rapporti di THPTA a CuSO₄: (7:1); (10:1); (12:1); (15:1); (20:1). eseguire la reazione in H₂O (volume totale di 50 µ l) per 24 h a RT su un miscelatore rotante (20 giri).
   2. Al momento dell'accoppiamento, 3-Azido-7-hydroxycoumarin diventa una tintura fluorescente. Preparazione di campioni in condizioni di ridotte e non ridotta e analizzarli da SDS-PAGE. Visualizzare il gel sotto il canale di eccitazione con la lunghezza d'onda specifica per il 3-Azido-7-hydroxycoumarin (λ_abs = 404 nm; λ_em = 477 nm).

3. tecnica di accoppiamento covalente di BMP2-K3Plk di Azide funzionalizzati agarosio perline

1. Incubare 2 ore a RT su un rotati 20 µM di BMP2-K3Plk o BMP2-WT (usato come controllo negativo) con 20 µ l di azide-attivato dell'agarosi branelli in un volume totale di 500 µ l di tampone di reazione (0,1 M HEPES pH 7.0, urea 3,9 M, 50 µM CuSO₄, 250 µM THPTA, ascorbato di sodio di 5 mM) Miscelatore di ng (20 giri). Fermare la reazione aggiungendo 5 mM EDTA (concentrazione finale).
2. Incubare a RT per 15 min in un miscelatore rotante (20 giri). Centrifugare i campioni a 20.000 x g per 1 min a RT. Collect i sovranatante.
3. Lavare il pellet contenente microsfere tre volte con 1.000 µ l di tampone HBS₅₀₀ (50 mM HEPES, 500 mM NaCl), tre volte con 1.000 µ l di 4 M MgCl₂e due volte con 1.000 µ l di tampone fosfato salino (PBS). In ogni fase di lavaggio, centrifugare a 20.000 x g per 1 min a RT e raccogliere i surnatanti. Negozio perline accoppiati a 1.000 µ l di PBS a 4 ° C.
   Attenzione: Non disturbare il pellet perlina durante la rimozione del surnatante.

4. convalida la presenza e l'attività biologica di immobilizzato BMP2-K3Plk utilizzando Texas rosso etichettato recettore BMP ho un Ectodomain (BMPR-IA _CE )

1. Incubare 50 µ l di perline BMP2-K3Plk funzionalizzati con 1 µM di Texas Red etichettato BMPR-IA_CE con 150 µ l di tampone HBS₅₀₀ (50 mM HEPES, 500 mM NaCl) a TA per 1h su un miscelatore rotante (20 giri).
2. Centrifugare le perline a 20.000 x g per 1 min a RT. scartare il surnatante. Lavare le perle con 1000 µ l di tampone di₅₀₀ HBS. Ripetere la fase di lavaggio di un ulteriore 3 volte. Centrifugare a 20.000 x g per 1 min RT dopo ogni fase di lavaggio.
3. Risospendere le sfere in 500 µ l di PBS e pipettare 50 µ l su un vetrino di copertura. Impostare il filtro di microscopio tra 561 o 594 nm. Rilevare il Texas Red – BMPR-IA_CE– BMP2-K3Plk funzionalizzati perline usando le immagini di microscopia e prendere fluorescente.

5. misurazione della fosfatasi alcalina (ALP) espressione per dimostrare la bioattività In Vitro del prodotto BMP2-K3Plk prima e dopo la reazione di accoppiamento.

1. Analisi della fosfatasi alcalina (ALP)
   1. Cultura promyoblastic cellule C2C12 (ATCC CRL-172) in di per volta Eagle di Dulbecco Medium (DMEM) con 10% siero fetale di vitello (FCS), 100 U/mL di penicillina G e 100 µ g/mL di streptomicina a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% CO₂.
   2. Semi di cellule C2C12 ad una densità di 3 × 10⁴ cellule/pozzetto in una micropiastra a 96 pozzetti. Ha lasciato le cellule allegare durante la notte. Rimuovere il mezzo e incubare le cellule C2C12 in presenza di 0.5-200 nM di BMP2-WT o BMP2-K3Plk in 100 µ l/pozzetto di DMEM (2% FCS, 100 U/mL di penicillina G e 100 µ g/mL di streptomicina) a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% CO₂ per 72 h.
   3. Rimuovere il mezzo e lavare le cellule con 100 µ l di PBS. Lisare cellule a temperatura ambiente per 1 h con 100 µ l/pozzetto di tampone di lisi (1% NP-40, glicina 0,1 M, pH 9.6, 1 mM MgCl₂, 1mm ZnCl₂) su un'agitazione piastra (220 giri/min).
   4. Aggiungere 100 µ l/pozzetto di buffer di ALP (glicina di 0,1 M, pH 9.6, 1 mM MgCl₂, 1mm ZnCl₂) con 1 mg/mL p-nitrophenylphosphate (appena aggiunto) il lysate delle cellule.
   5. Misurare l'assorbimento a 405 nm in un lettore multidisco dopo aver aggiunto il buffer ALP e ogni 5 min fino a completo lo sviluppo del colore. Generazione di curve dose-risposta e valori di EC50 utilizzando un modello logistico, y = A₂ + (A₁-A₂) / (1 + (x/x₀)^p).
2. Macchiatura di fosfatasi alcalina (ALP)
   1. Cultura promyoblastic cellule C2C12 (ATCC CRL-172) in di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) con 10% siero fetale di vitello (FCS), 100 U/mL di penicillina G e 100 µ g/mL di streptomicina a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% CO₂.
   2. Semi di cellule C2C12 ad una densità di 3 × 10⁴ cellule/pozzetto in una micropiastra a 96 pozzetti. Ha lasciato le cellule allegare durante la notte. Rimuovere il mezzo e aggiungere 20 µ l/pozzetto di perline BMP2-K3Plk accoppiato. BMP2-K3Plk accoppiato perle sono a 1000 µ l di una sospensione di PBS.
   3. Preparare una soluzione di agarosio di punto di fusione basso di 0,4% in DMEM. Sciogliere nel microonde (600 W per 3 min) e lasciatelo raffreddare in un bagno di acqua a 37 ° C fino all'utilizzo.
   4. Aggiungere 20 µ l di 0,4% punto di fusione basso agarosio in ciascun pozzetto (copertura perline e cellule). Centrifugare a 2000 x g per 5 min a 20 ° C. Aggiungere 80 µ l DMEM (2% FCS, 100 U/mL di penicillina G e 100 µ g/mL di streptomicina) e incubare a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% CO₂ per 72 h.
   5. Rimuovere il mezzo, facendo attenzione a non staccare l'agarosio solidificato di 0,4%. Aggiungere 100 µ l/pozzetto di NBT 1-Step/soluzione substrato BCIP (cloruro di Nitro blu di tetrazolio, 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate p-toluidina sale).
   6. Analizzare la fosfatasi alcalina che macchia usando la microscopia chiara immediatamente dopo la colorazione viola diventa apparente. Utilizzare la microscopia luminosa del campo e scattare foto.

Risultati

In questo articolo, descriviamo un metodo per coppie covalentemente una nuova variante di BMP2, BMP2-K3Plk, ai branelli di agarosio commercialmente disponibili azide funzionalizzati (Figura 1). La bioattività del prodotto variant BMP2-K3Plk è stata convalidata tramite l'induzione dell'espressione genica della fosfatasi alcalina (ALP) in cellule C2C12. Il test in vitro Mostra simili livelli di espressione di ALP indotti dal tipo selvaggio BMP2 (BMP2-W...

Discussione

Generazione di varianti della proteina contrassegnati dall'espansione di codone genetica permette l'introduzione di vari aminoacidi non naturali analoghi principalmente in qualsiasi posizione della sequenza primaria della proteina. In caso di BMPs come BMP2, comune tag come un tag 6-istidina (sua) può solo essere presentare N-terminalmente, poiché alla fine di protein´s C-terminale è sepolto all'interno della struttura terziaria della proteina e quindi non è accessibile dall'esterno. In altre posizioni, la dimensione del...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Materiale
1-Step NBT/BCIP	Thermo Fisher	34042	Aggiungere soluzione alle cellule
3-Azido-7-idrossicumarina BaseClick		BCFA-047-1	Sostanza chimica utilizzata per la reazione a clic
Agarosio a basso punto di fusione	Biozym	840101	Agarosio per il saggio ALP
Perle di agarosio azide	Jena Bioscience	CLK-1038-2	Perle utilizzate per la reazione
BamHI (enzima Fast Digest)	Thermo Fisher Scientific	FD0054	Enzima di restrizione
BMP recettore IA (BMPR-IAEC)	--	--Prodotto	nel nostro laboratorio
Coomassie Brilliant Blue G-250 Dye	Thermo Fisher Scientific	20279	Prodotto chimico utilizzato per Coomassie Colorazione blu brillante di SDS PAGE
Solfato di rame (II) anidro (CuSO4)	Alfa Aesar	A13986	Prodotto chimico utilizzato per la reazione a clic
, DNA polimerasi e tampone di reazione	Kapabiosystems	KK2102 KAPA	Kit PCR HiFi
Dulbecco' s Eagle modificato' s medium (DMEM) GlutaMAX	Gibco	61965-026	Terreni di coltura cellulare
etilendiamminotetraacetico (EDTA)	Sigma Aldrich GmbH	E5134-1kg	Sostanza chimica utilizzata per fermare la reazione di clic
Isopropil ß-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG)	Carl Roth GmbH	2316.5	Induzione batterica (concentrazione finale 1mM)
NdeI (enzima a digestione rapida)	Thermo Fisher Scientific	ER0581	Enzima di restrizione
attivato da NHS Texas Red	Life technologies	T6134	Accoppiato al recettore
P- Nitrofenil fosfato	Sigma Aldrich GmbH	N4645-1G	Fosfatasi alcalina
p25N-hmBMP2	--	--Plasmide	gentilmente fornito da Walter Sebald a J. Nickel
pET11a-pyrtRNA	--	--Fornito	dalla Cattedra di Farmaceutica e Biofarmacia, Università di Wuerzburg
propargyl-L-lysine (Plk)	-	---	Fornito dalla Cattedra di Farmaceutica e Biofarmacia, Università di Wuerzburg
pSRFduet-pyrtRNAsynth	--	--	Fornito dalla cattedra di Farmaceutica e Biofarmacia, Università di Wuerzburg
Qiagen Kit di estrazione del gel	Qiagen	28704	Purificazione
del gel Qiagen Kit di purificazione PCR Qiagen		28104	Purificazione PCR
Sodio L-ascorbato	Sigma Aldrich GmbH	A7631-100G	Sostanza chimica utilizzata per la reazione di clic
T4 DNA Ligasi	ThermoScientific	EL0011	Legatura
tris(3-idrossipropiltriazolilmetil)ammina (THPTA)	BaseClick	BCMI-006-100	Sostanza chimica utilizzata per la reazione di clic
4-(1,1,3,3-Tetrametilbutil)fenil-polietilenglicole	Sigma Aldrich GmbH	X100-1L	Triton X 100
Name	Azienda	Numero di catalogo	Comments
>Equipment
Cella concentrata Amicon 400 ml	Merck KGaA	UFSC40001	Unità di concentrazione Unità filtranti
centrifughe Amicon Ultra-15 Merck	KGaA	UFC901024	Unità centrifuga di concentrazione
Ä KTA avant FPLC	Ä KTA-	-Macchina	FPLC
Avanti J-26XP	Beckman Coulter	393124	Centrifuga per colture batteriche
Incubatore per agitazione batterica	Infors HT		Incubatore per colture batteriche
FluorChem Q system	proteinsimple	--	Sistema di imaging e analisi per SDS-PAGE
Miscroscopio fluorescente	Keyence	BZ-9000 (BIOREVO)
Fractogel® EMD SO3- (M)	Merck KGaA	116882	Materiale della colonna per cromatografia a scambio ionico
Greiner CELLSTAR®   Piastre a 96 pozzetti	Sigma	M5811-40EA	Piastre a 96 pozzetti per colture cellulari (ALP Assay)
Heraeus Multifuge X1R	ThermoScientific	--	Centrifuge
M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor	ThermoScientific	75003624	Rotore per microcentrifuga per piastra durante la colorazione ALP
Microcentrifuga - 5417R	Eppendorf	--	Centrifuga
OriginPro 9.1 G	OriginLab	--	software per l'analisi statistica dei dati del saggio ALP
Vetrini polisinici	Vetrini per microscopio	ThermoScientific	10143265
Rotore JA-10	Beckman Coulter	--	rotore per centrifuga Avanti J-26XP
Rotore JLA 8.1	Beckman Coulter	--	rotore per centrifuga Avanti J-26XP
Rotore JA 25.50	Beckman Coulter	--	rotore per centrifuga Avanti J-26XP
Tecan infinite M200 lettore multipiastra	Tecan Deutschland GmbH	--	lettore multipiastra per test ALP
Thermocycler - Labcycler Gradient	SensoQuest GmbH	--	PCR
TxRed - filtro per microscopio	Keyence		Filter per microscopio fluorescente
Dischi di cellulosa rigenerata per ultrafiltrazione 3 kDa	Merck KGaA	PLBC04310	utilizzato con cella di concentrazione amicon 400ml
Dischi di cellulosa rigenerata per ultrafiltrazione 10 kDa	Merck KGaA	PLGC04310	utilizzato con cella di concentrazione amicon 400ml