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Articolo metodologico

Microscopia di immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1 per analizzare la formazione e la riparazione di rotture a doppio filamento del DNA

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DOI:

10.3791/56617

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3 novembre 2017

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1Department of Hematology and Oncology, Medical Faculty Mannheim of the Heidelberg University

In questo articolo

Sommario

Questo manoscritto fornisce un protocollo per l'analisi delle rotture del doppio filamento di DNA da microscopia di immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1.

Abstract

Rotture del DNA a doppio filamento (DSB) sono gravi lesioni al DNA. Analisi della formazione e della riparazione del DSB sono rilevante in un ampio spettro di settori di ricerca tra cui integrità del genoma, genotossicità, radiobiologia, invecchiamento, cancro e lo sviluppo di farmaci. In risposta a DSB, istone H2AX è fosforilata a serina 139 in una regione di diverse coppie di megabase formando fuochi nucleari discreti rilevabili da microscopia di immunofluorescenza. In aggiunta, 53BP1 (proteina p53 1) è un'altra importante proteina DSB-sensible a reagire promuovendo la riparazione del DSB unendo nonhomologous fine-evitando la ricombinazione omologa. Secondo le specifiche funzioni di γH2AX e 53BP1, l'analisi combinata di γH2AX e 53BP1 da microscopia di immunofluorescenza può essere un approccio ragionevole per un'analisi dettagliata del DSB. Questo manoscritto fornisce un protocollo dettagliato completato con metodiche note per l'esecuzione della tecnica. In particolare, l'influenza del ciclo cellulare sui modelli di fuochi γH2AX è dimostrata in fibroblasti normali della linea cellulare NHDF. Inoltre, il valore dei fuochi γH2AX come biomarcatore è raffigurato nei linfociti irradiati raggi x di un individuo sano. Infine, l'instabilità genetica è studiata in cellule CD34 + di un paziente con la leucemia mieloide acuta da microscopia di immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1.

Introduzione

DNA è continuamente danneggiato da endogeno (ad es., stress replica, specie reattive dell'ossigeno, intrinseca instabilità del DNA) ed esogene (ad esempio, radicali chimici, irradiazione) fonti (Figura 1)1,2 ,3,4. Tra il danno del DNA, rotture del DNA a doppio filamento (DSB) sono lesioni particolarmente gravi e possono indurre la morte delle cellule o carcinogenesi. Circa 50 DSB possono sorgere al cellulare e ciclo cellulare5. In cellule di mammifero, ricombinazione omologa (HR) e fine-unirsi nonhomologous (NHEJ) sviluppato come vie principali per la riparazione di DSB (Figura 2). HR si verifica nella fase tarda S/G2 e utilizza un'intatta sorella cromatidio come modello per la riparazione potenzialmente privo di errori. In confronto, NHEJ è attivo durante tutto il ciclo cellulare e potenzialmente mutageni come coppie di basi può essere aggiunto o resecate prima legatura dell'estremità rotte. Inoltre, fine-entrare in alternativa possono essere assunti come un meccanismo di lento mutagene backup ripristino in caso di carenza NHEJ6,7.

DSB inducono la fosforilazione dell'istone H2AX a serina 139 in una regione di diverse coppie di megabase intorno ogni DSB. I fuochi che formanti nucleari sono denominati γH2AX i fuochi e rilevabili da microscopia di immunofluorescenza8. ΓH2AX promuove l'assunzione di ulteriori proteine DSB-sensible a reagire ed è coinvolto nel rimodellamento della cromatina, riparazione del DNA e di trasduzione di segnale9. Come ogni focus γH2AX è considerato per rappresentare un singolo DSB, la quantificazione del DSB da microscopia di immunofluorescenza è possibile, che è stata dimostrata in linee cellulari del cancro e i campioni dei pazienti10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (proteina p53 1) è un'altra proteina chiave nel mediare la riparazione DSB. È coinvolto nel reclutamento di DSB-sensible a reagire proteine, segnalazione di checkpoint e le sinapsi di DSB estremità15. Inoltre, 53BP1 svolge un ruolo critico nella scelta di percorso di riparazione DSB. Si innesca la riparazione del DSB verso NHEJ mentre HR è impedito16. Considerando le funzioni originali di γH2AX e 53BP1 in riparazione DSB, l'analisi simultanea di γH2AX e 53BP1 da microscopia di immunofluorescenza può essere un metodo utile per l'analisi precisa della formazione e della riparazione del DSB.

Questo manoscritto fornisce un protocollo dettagliato per l'esecuzione di microscopia di immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1 nei nuclei delle cellule. In particolare, la tecnica è applicata in fibroblasti normali della linea cellulare NHDF, nei linfociti irradiati raggi x di un individuo sano e in cellule CD34 + di un paziente con la leucemia mieloide acuta. I dettagli del metodo sono indicati nel contesto dei risultati presentati.

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Protocollo

tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal Comitato etica II della Mannheim facoltà medica dell'Università di Heidelberg. Scritto il consenso informato è stato ottenuto da tutti gli individui.

1. preparazione dei materiali

  1. di soluzione anticoagulante: preparare una soluzione di riserva dell'anticoagulante dell'eparina a 200 UI / mL in sodio cloruro 0,9%. Riempire ciascuna delle provette di raccolta (disegnare il volume 9 mL) con 2 mL di soluzione di riserva dell'anticoagulante prima del prelievo dei campioni di sangue o midollo osseo.
  2. Soluzione di lisi di cellule rosse: preparare il 10 x soluzione di lisi per cellule rosse con 82,91 g di cloruro di ammonio, bicarbonato di ammonio 7,91 g e 2 mL di soluzione di acido etilendiamminotetracetico 0,5 M ad un pH di 8,0 sciogliendo gli agenti in acqua bidistillata per un volume totale di 1 L.
  3. Soluzione di fissazione: 8.3 aggiungere µ l di una soluzione di idrossido di potassio di 1 M di paraformaldeide 360 mg (PFA) in un tubo di microtitolo. Riempire il tubo con tamponato fosfato salino (PBS) fino alla tacca 1 mL del tubo e di calore del tubo in un blocco di riscaldamento a 95 ° C per ottenere 1 mL di una soluzione PFA del 36%. Trasferire la soluzione PFA 36% 1 mL in una provetta con una capacità di 15 mL. Aggiungere 8 mL di PBS alla soluzione 1 mL 36% PFA, per ottenere 9 mL di una soluzione madre di PFA 4%. Aliquota del 4% soluzione di riserva di PFA e conservare a-18 ° C fino a utilizzare per la fissazione delle cellule.
    Attenzione: la soluzione di idrossido di potassio 1) è corrosivo. Essere consapevoli di protezione degli occhi e della pelle. 2) PFA è cancerogeno. Evitare il contatto con la pelle e l'inalazione. Preparare la soluzione di fissaggio sotto un cofano.
  4. Soluzione di permeabilizzazione: aggiungere 50 µ l octoxinolo 9 a 50 mL di PBS per ottenere una soluzione di circa 0.1% octoxinolo 9.
  5. Soluzione bloccante: preparare 5% e 2% soluzioni di blocco di miscelazione l'agente bloccante della proteina con PBS e store a 6 – 8 ° C.

2. Preparazione dei campioni

  1. fibroblasti in coltura delle cellule: coltivare fibroblasti umani della linea cellulare NHDF in un umidificata 5% CO 2 atmosfera a 37 ° C in RPMI 1640 supplementato con 10% siero fetale di vitello, 4 mM Glutammina e 1% di penicillina/streptomicina.
    1. Preparazione di un vetrino da microscopio con aderente fibroblasti
      1. rimuovere il supporto dal pallone (area di crescita di 75 cm 2) con fibroblasti NHDF in crescita esponenziale. Aggiungere 10 mL di PBS al pallone. Lavare delicatamente i fibroblasti aderenti agitando manualmente la beuta per 1 min.
      2. Rimuovere il PBS e aggiungere tripsina 1 mL nel pallone. Agitare il matraccio delicatamente per garantire che tutte le cellule aderenti sono coperti dalla tripsina. Rimuovere la tripsina dal pallone. Mettere il pallone in incubatrice per 5 min a 37 ° C.
      3. Prendere il pallone fuori l'incubatrice e aggiungere 10 mL RPMI 1640 liquido nel pallone. Pipettare il mezzo su e giù più volte per disperdere i fibroblasti.
      4. Pipetta 0,3 mL dei fibroblasti dispersi su ciascuno dei due campi del vetrino da microscopio e inserire la diapositiva nell'incubatrice per 24 h in modo che i fibroblasti aderiscono alla diapositiva. Per immunostaining di γH2AX e 53BP1 nei nuclei dei fibroblasti, passare alla fase 3.1.
  2. Campioni di pazienti
    1. campioni di sangue: utilizzare i tubi di raccolta che sono stati riempiti con 2 mL di soluzione di riserva dell'anticoagulante e aggiungere 7 mL di sangue nelle provette. Conservare i campioni durante la notte a temperatura ambiente (cioè, 18-20 ° C). Il giorno successivo, isolare la fase G0/G1 cellule mononucleari di riposo di centrifugazione in gradiente di densità (punto 2.2.3).
    2. Campioni del midollo osseo: utilizzare i tubi di raccolta che sono stati riempiti con 2 mL di soluzione di riserva dell'anticoagulante (punto 1.1) e aggiungere midollo osseo 7 mL nelle provette. Conservare i campioni durante la notte a temperatura ambiente (cioè, 18-20 ° C). Il giorno successivo, isolare la fase G0/G1 cellule mononucleari di riposo di centrifugazione in gradiente di densità (punto 2.2.3). Utilizzare microsfere di CD34 e colonne di separazione per l'isolamento delle cellule CD34 + di cell.
    3. Isolamento delle cellule mononucleari di centrifugazione in gradiente di densità
      Nota: Cellule mononucleari sono isolate da campioni di sangue e midollo osseo di centrifugazione su gradiente di densità 17 , 18 , 19.
      1. Diluire il campione di sangue eparinizzato in un rapporto di 1:1 con PBS e il campione di midollo osseo eparinizzata in un rapporto di 1:3 con PBS. Sospendere le cellule delicatamente trascinandoli dentro e fuori la pipetta due volte.
      2. Aggiungere un volume di mezzo di gradienti di densità in una nuova provetta. Delicatamente strato il sangue diluito o midollo osseo sopra il mezzo del gradiente di densità. Fare attenzione a non per mescolare i due strati.
      3. Centrifugare la provetta per 30 min a temperatura ambiente e 400 g. x lo strato superiore del plasma prelevare con la pipetta. Poi accuratamente raccolto le cellule mononucleari nello strato di sopra il mezzo del gradiente di densità. Le cellule mononucleari di trasferimento in una nuova provetta.
      4. Aggiungere almeno tre volumi di PBS a cellule mononucleari nel tubo. Sospendere le cellule delicatamente trascinandoli dentro e fuori la pipetta due volte. Centrifugare la provetta per 10 min a temperatura ambiente e 400 x g.
      5. Dopo la rotazione, rimuovere il supernatante e aggiungere 10 mL di 4 ° C, 1 x soluzione di lisi di cellule rosse. Risospendere delicatamente le cellule trascinandoli dentro e fuori la pipetta due volte e posizionare il tubo sul ghiaccio per 5 min. Aggiungere 30 mL di PBS a 4 ° C, quindi centrifugare la provetta per 10 min a temperatura ambiente e 400 x g.
    4. Preparazione dei cytospins
      1. preparare due cytospins con cellule mononucleari dei campioni dei pazienti (cioè, un cytospin per γH2AX colorazione di immunofluorescenza e un cytospin per γH2AX e 53BP1 combinato di immunofluorescenza) mediante centrifugazione (300 x g, 10 min) di 1.0 x 10 5 celle per ogni preparazione ( Figura 3 e 4).

3. γH2AX e colorazione di immunofluorescenza 53BP1

  1. fissazione e permeabilizzazione: fissare le cellule con 200 µ l di 4% PFA per 10 min. Dopo la fissazione, lavare delicatamente le cellule tre volte con 30 mL di PBS per 5 minuti ciascuno su un agitatore di laboratorio. Quindi permeabilize le cellule con 200 µ l di 0,1% octoxinolo 9 per 10 min. lavare le cellule delicatamente tre volte con 30 mL di soluzione bloccante 5% per 5 minuti ciascuno su un agitatore di laboratorio. Bloccare le cellule in 30 mL di fresco 5% soluzione per 1 h. di blocco
  2. Incubazione con gli anticorpi
    1. Incubare una preparazione delle cellule con un anticorpo monoclonale anti-γH2AX di topo (1: 500) e l'altra preparazione delle cellule con un anticorpo monoclonale anti-γH2AX di topo (1: 500) e una anticorpo policlonale del coniglio di anti-53BP1 (1: 500) durante la notte a 4 ° C.
    2. Dopo incubazione lavare le cellule delicatamente 3 volte con 30 mL di soluzione bloccante 2% per ogni 5 minuti su un agitatore di lab.
    3. Rimuovere la soluzione di blocco e incubare la prima preparazione delle cellule con un anticorpo secondario anti-topo di capra Alexa488-coniugati (1: 500) e la seconda preparazione delle cellule con un (anticorpo secondario anti-topo di capra Alexa488-coniugato 1: 500) e un asino Alexa555-coniugato anticorpo secondario anti-coniglio (1: 500) per 1 h a temperatura ambiente.
  3. Mezzo di montaggio: mettere il vetrino con le cellule in una ciotola e lavare le cellule delicatamente tre volte con 30 mL di PBS per ogni 5 minuti su un agitatore di laboratorio. Rimuovere il PBS e montare le cellule con mezzo di montaggio contenente 4,6-diamidino-2-phenylindole. Prudentemente messo un vetrino coprioggetto sopra il mezzo di montaggio in modo che bolle d'aria non sono incorporato. Attendere almeno 3 ore per l'indurimento di mezzo di montaggio prima di analizzare le cellule mediante microscopia a fluorescenza.

4. Analisi di γH2AX e 53BP1 i fuochi

  1. microscopia di fluorescenza: analizzare i fuochi γH2AX e 53BP1 nei nuclei delle cellule con un microscopio a fluorescenza dotato di filtri per DAPI, Alexa 488 e Cy3 durante la formazione immagine a un obiettivo 100x ingrandimento. Registrare immagini con una macchina fotografica ed elaborare le immagini con software di imaging appropriato.

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Risultati

Analisi dei fuochi di γH2AX in cellule è più accurata in fase G0/G1 e la fase G2 quando i fuochi di γH2AX vengono visualizzati come punti fluorescenti distinti (Figura 5A). Al contrario, analisi dei fuochi di γH2AX nelle cellule durante la fase S sono complicata da macchioline dispersi γH2AX pan-nucleare causate dal processo di replica (figura 5B).

Fissazione delle cell...

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Discussione

Microscopia di immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1 è un metodo utile per analizzare la formazione e la riparazione di DSB in un ampio spettro di settori di ricerca. I parametri critici che influenzano il risultato degli esperimenti sono la fase del ciclo cellulare, gli agenti utilizzati per la fissazione e la permeabilizzazione delle cellule, la scelta di anticorpi e l'hardware e il software di microscopio di fluorescenza.

L'influenza del ciclo cellulare sui modelli i fuochi di γH2AX è stata d...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Il progetto è stato sostenuto dalla Fondazione tedesca José Carreras leucemia (14 DJCLS R/2017).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Terreno RPMISigma-AldrichR0883Terreno per colture cellulari
Eparina sodioratiopharmPZN 3029843  Eparina 5.000 U.I. / mL
Soluzione di cloruro di sodio 0,9%B. BraunPZN 1957154Componente della soluzione madre anticoagulante
Ficoll-Paque PremiumGE Healthcare17-5442-02Terreno per l'isolamento di cellule mononucleate
Soluzione di tripsina 10XSigma-Aldrich59427CEnzima per la dissociazione dei fibroblasti in coltura cellulare
CD34 MicroBead KitMiltenyi Biotec130-046-702Isolamento di cellule progenitrici mieloidi CD34+
Vetrini per microscopio diagnosticoThermo ScientificER-203B-CE24Vetrini per microscopio
Megafuge 1.0 RHeraeus75003060  Centrifuga da tavolo 
Dispositivo
CoperchioHeraeus76003422Coperchio per lavorare senza microprovette
Contenitore CytoHeraeus75003416Contenitore Cyto con 2 fori conici
Clip CarrierHeraeus75003414Carrier per contenere un contenitore cyto e un vetrino
Inserto di supportoHeraeus75003417Inserto di supporto per tenendo un supporto a clip
Triton X-100 (Octoxinol 9)Thermo Scientific85112Detergente per la permeabilizzazione delle membrane cellulari
Soluzione di idrossido di potassio 1MMerck Millipore109107Necessario per preparare la soluzione di paraformaldeide
ParaformaldeideSigma-AldrichP6148Agente di fissazione
Soluzione salina tamponata con fosfatoSigma-AldrichD8537Soluzione salina
bilanciata ChemiblockerMerck Millipore2170Agente bloccante
Monoclonale di topo anti-γ Anticorpo H2AX (JBW301)Merck Millipore05-636Anticorpo primario per la rilevazione di γ H2AX
Anticorpo policlonale anti-53BP1 di coniglio (NB100-304)Novus BiologicalsNB100-304Anticorpo primario per il rilevamento di 53BP1
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibodyInvitrogenA-11001Anticorpo secondario
Alexa Fluor 555-coniugato asino anti-coniglioInvitrogenA-31572Anticorpo secondario
Vectashield mount mediumVector LaboratoriesH-1200Contiene DAPI per la colorazione del DNA
Axio Scope.A1Zeiss490035Microscopio a fluorescenza
Cool Cube 1 Telecamera CCDMetasystemsH-0310-010-MSSistema di telecamere per la registrazione digitale
Software IsisMetasystemsNon applicabileSoftware per microscopio
Cytospin

Riferimenti

  1. Hoeijmakers, J. H. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer. Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).
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