Risonanza paramagnetica elettronica di basso campo (banda L, 1.2 GHz) usando le sonde nitrossidi e trityl solubile è dimostrata per la valutazione dei parametri fisiologicamente importanti nel microambiente tumorale in modelli murini di cancro al seno.
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Articolo metodologico
In Vivo EPR valutazione di pH, pO2, lo stato Redox e le concentrazioni di fosfato e glutatione nel microambiente tumorale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo protocollo dimostra le capacità di risonanza paramagnetica elettronica di basso campo (EPR)-basato su tecniche in combinazione con sonde paramagnetiche funzionale a fornire informazioni quantitative sul microambiente tumorale chimica (TME), tra cui p O2, lo stato redox, pH, concentrazioni di fosfato inorganico interstiziale (Pi) e intracellulare del glutatione (GSH). In particolare, un'applicazione di una sonda sviluppata di recente solubile trityl multifunzionale offre opportunità insuperabile per in vivo misure simultanee di pHe pO2 Pi a E spazio inases (sonda di speranza). Le misure dei tre parametri utilizzando una singola sonda permettono per le loro analisi di correlazione indipendente di distribuzione sonda e ora delle misurazioni.
Introduzione
Un ruolo chiave della TME nella progressione del cancro e nella terapia è sempre più apprezzato1. Tra le importanti parametri fisiologici della TME in tumori solidi, di ipossia del tessuto2, acidosi3,4, alta riduzione capacità5, elevate concentrazioni di GSH intracellulare6,7, e interstiziale Pi8 sono ben documentati. Valutazioni di2, pH, Pi, GSH e redox non invasiva in vivo pO forniscono intuizioni uniche i processi biologici nella TME e....
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Protocollo
Tutto il lavoro animale è stato eseguito conformemente al protocollo WVU IACUC approvato.
1. sintesi e calibrazione della sonda
- Particolato pO2-sensibili LiNc-BuO sonda
Nota: LiNc-BuO microcristalli vengono sintetizzati e preparate come descritto nel riferimento13. Sono molto stabili e possono essere conservati a temperatura ambiente per anni. L'EPR linewidth della sonda del particolato LiNc-BuO è un pO2-parametro sensibile. LiNc-BuO microcristalli dimostrano ideale dipendenza lineare di linewidth sulla concentrazione di ossigeno nella gamma da con....
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Risultati
Tessuto p O 2 Sonde di valutazione utilizzando il LiNc-BuO:
Utilizzando la procedura descritta nella sezione passaggio 1.1, abbiamo effettuato la taratura della sospensione di microcristalli LiNc-BuO preparati al momento. Figura 2 Mostra la dipendenza di ossigeno tipico di linewidth della sonda L.......
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Discussione
I metodi presentati consentono per la valutazione non invasiva in vivo dei parametri critici della TME chimica, vale a dire pO2, pH, stato redox e le concentrazioni di GSH intracellulare e interstiziale Pi. Tecniche di risonanza magnetica, quali MRI e basso campo EPR, sono i metodi di scelta per non invasiva in vivo profilatura di questi parametri TME. MRI Visualizza le strutture anatomiche, ma manca di sensibilità funzionale. In contrasto con MRI, EPR tecniche forniscono sensibilità.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto da NIH concede CA194013, CA192064 e U54GM104942. Il WVCTSI è riconosciuto per start-up a VVK, AB e TDE. Gli autori ringraziano il Dr. M. Gencheva e K. Steinberger per l'assistenza con gli esperimenti illustrativi. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del NIH.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Spettrometro EPR in banda L | Magnettech, Germania | Spettrometro a risonanza paramagnetica elettronica (EPR) in banda L (1,2 GHz) per la raccolta di spettri in vitro e in vivo di molecole paramagnetiche | |
| . Temperatura & Regolatore del gas | Noxygen, Germania | Temperatura & Regolatore di gas progettato per controllare e regolare la temperatura e la composizione del gas. | |
| Sonicatore | Fisher Scientific | ||
| GSH (L-Glutatione ridotto) | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| MMTV-PyMT topi | DMEM | ||
| Thermo Fisher Scientific | 11995065 | ||
| Met-1 cellule di carcinoma mammario murino | In casa | ||
| C57Bl/6 topi wild type | Jackson Laboratory | ||
| Tripsina | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Trypan Blue Exclusion Dye | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Ohmeda Fluotec 3 | |||
| Isoflurano (IsoFlo) | Abbott Laboratories | ||
| Sodio fosfato bibasico | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| Sodio fosfato monobasico | sigma-Aldrich | S07051 | |
| Cloruro di sodio | sigma-Aldrich | S7653 | |
| Acido cloridrico | sigma-Aldrich | 320331 | |
| Idrossido di Sodio | sigma-Aldrich | S8045 | |
| Glucosio | sigma-Aldrich | ||
| Glucosio ossidasi | sigma-Aldrich | ||
| Lauda Circolatore E100 | Lauda-Brikmann | ||
| pHmetro Orion | Thermo Scientific | ||
| Sonda LiNc-BuO | Interna | La sonda Octa-n-Butossi-Naftalocianina è stata sintetizzata secondo la sonda NR ref 13 | |
| Interna | La sonda Nitrossido è stata sintetizzata secondo la | ||
| sonda RSSR | Interna | La sonda di-Nitrossido è stata sintetizzata secondo la sonda | |
| HOPE probe | Internamente | La sonda triarilmetilica monofoshonata è stata sintetizzata secondo ref 12 |
Riferimenti
- Siemann, D. W. Tumor Microenvironment. , John Wiley & Sons Ltd.,. Chichester, UK; Hoboken, NJ, USA. (2011).
- Tatum, J. L., et al. Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer thera....
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Ristampe e permessi
